Name: a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Vi tackar B. Spee för generöst tillhandahålla LD540. Detta arbete stöddes av en nederländsk organisation för vetenskapligt forskningsbidrag (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) till Swen

Alla experiment med mänsklig vävnad som beskrivs häri godkändes av etikkommittén vid University Medical Center Utrecht (UMCU). Informerat samtycke till vävnads insamling, generering, lagring och användning av organoider erhölls från patienter på Wilhelmina Children ' s Hospital (WKZ)-UMCU.
1. förberedelse av odlingsmedier
Anmärkning: Detta protokoll bör utföras i ett biosäkerhetsskåp. Organoider ska hanteras enligt standardriktlinjer f...

<ol>
	<li>Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+triacylglycerol+synthesis+in+fat+absorption+and+systemic+energy+metabolism.">Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism.</a> Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).</li><li>Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+glycerolipids.+DGAT+enzymes+and+triacylglycerol+biosynthesis.">Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis.</a> Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).</li><li>D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+discoveries+on+absorption+of+dietary+fat:+Presence,+synthesis,+and+metabolism+of+cytoplasmic+lipid+droplets+within+enterocytes.">Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).</li><li>Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+absorption+and+effect+of+sham+feeding+on+postprandial+lipema.">Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema.</a> Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).</li><li>Chitraju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Synthesis+by+DGAT1+Protects+Adipocytes+from+Lipid-Induced+ER+Stress+during+Lipolysis.">Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).</li><li>van Rijn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+failure+and+aberrant+lipid+metabolism+in+patients+with+DGAT1+deficiency.">Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency.</a> Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).</li><li>Haas, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGAT1+mutation+is+linked+to+a+congenital+diarrheal+disorder.">DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).</li><li>Gluchowski, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+DGAT1+missense+mutation+associated+with+congenital+diarrhea.">Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea.</a> Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).</li><li>Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Diarrhea+From+DGAT1+Mutation+Leading+to+Electrolyte+Derangements,+Protein-losing+Enteropathy,+and+Rickets.">Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).</li><li>Stephen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+protein+losing+enteropathy:+an+inborn+error+of+lipid+metabolism+due+to+DGAT1+mutations.">Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations.</a> European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).</li><li>Schlegel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+deficits+in+apical+transporter+trafficking+associated+with+deficiency+in+diacylglycerol+acyltransferase.">Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).</li><li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triacylglycerol+synthesis+enzymes+mediate+lipid+droplet+growth+by+relocalizing+from+the+ER+to+lipid+droplets.">Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets.</a> Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function.">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye,+LD540.">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li><li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat.">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li></ol>

Här ger vi ett protokoll för att bestämma LD formation i mänskliga intestinal organoider vid inkubering med oljesyra. Denna metod är baserad på LD-specifika fluorescerande färgämne LD54018, vilket möjliggör karakterisering och kvantifiering av den totala volymen av lipiddroppar inom en Organoid kultur. Förfarandena för att etablera och underhålla humana intestinala Organoid kulturer har publicerats före13, och en visuell guide till detta protokoll finns också...

Lipider är en viktig del av den mänskliga kosten och spelar en stor roll i systemisk energilagring och metabolism. När intas, Dietary lipider bryts ned till fria fettsyror (FFAs) och monoglycerider (MGS) av pankreaslipaser. Dessa substrat tas sedan upp av enterocyterna i tarmens epitel, där de först återförestrades till diglycerider (DG) av monoglyceride acyltransferaser (mgat) enzymer och därefter till triglycerider (TG) av diglyceridolja acyltransferas 1 (DGAT1)1. Slutligen är dessa TGS integreras i antingen kylomikroner för export till lymfsystemet eller cytosoliska lipid droppar (LDs) för intracellulär lagring2,3. Även om kylomikroner behövs för att distribuera kosten lipider till andra organ, är vikten av intracellulär fett lagring i LDs inte helt klart. Emellertid, LDs har visat sig utföra en reglerande funktion i tarmen, som de långsamt släpper lipider i cirkulationen upp till 16 h efter en måltid4. Dessutom har LDs visats skydda mot giftiga fettsyra koncentrationer, såsom i mus adipocyter under lipolytiska förhållanden5.
Den DGAT1 proteinet är lokaliserat på det endoplasmatiska nätmagen (er) membran och leker en avgörande roll i LD bildning inne om intestinal epitel. Homozygot mutationer i DGAT1 leda till tidig debut svår diarré och/eller kräkningar, hypoalbuminemi, och/eller (dödlig) protein-Losing enteropati med intestinal misslyckande vid fettintag, illustrerar vikten av DGAT1 i lipidhomeostas av den mänskliga intestinal epitel6,7,8,9,10. Eftersom förekomsten av DGAT1-brist hos människor är sällsynt, tillgång till primära patient-härledda celler har varit knappa. Vidare, den långsiktiga kulturen av intestinal epitelceller har länge begränsats till tumör-härledda cellinjer som representerar den normala fysiologin endast till en begränsad utvidga. Därför, DGAT1-medierad LD formation har mestadels studerats i fibroblaster eller djur-härledda cellinjer7,10,11,12. Som sådan, det visades nyligen att DGAT1-bristfällig patient-derived fibroblaster ackumuleras mindre LDs jämfört med friska kontrollceller efter stimulering med oljesyra (OA)8.
Tidigare, protokoll upprättades för att kulturen epiteliala stamceller från alla gastrointestinala organ i form av tredimensionella (3D) organoider13. Dessa intestinala organoider kan hållas i kulturen under en lång tidsperiod13, och möjliggöra funktionell studie av patient-och tarm platsspecifika epiteliala egenskaper14. De är genetiskt och fenotypiskt stabila och kan lagras, vilket möjliggör långsiktig expansion och biobankning13.
Vi har nyligen visat att LD formation lätt kan mätas i mänskliga intestinala organoider i en LD formation (LDF) assay6. När organoider exponeras för OA under 16 timmar, genererar de LDs för att skydda cellerna från lipidinducerad toxicitet. När OA koncentrationer är för höga, cellerna dör av kaspas-medierad apoptos6. LDF-analysen har tidigare visat sig vara i hög grad beroende av DGAT1, vilket indikeras av organoider som härrör från DGAT1-muterade patienter och genom användning av DGAT1-specifika hämmare6.
För LDF-analysen som beskrivs i detalj här, är 3D-organoider odlade från intestinal biopsier och är framryckt varje vecka genom störningar i enskilda celler som lätt bildar nya organoider. För att köra LDF-analysen, ~ 7 500 Organoid-härledda enskilda celler är klädd i varje brunn av en 24-brunn tallrik. Organoider bildas under flera dagar, inkuberas över natten med 1 mM OA och färgas med LD540, en fluorescerande cell-permeable LD-specifik färg som underlättar avbildning. LD-bildningen kvantifieras sedan genom konfokalmikroskopi, fluorescerande Plattläsare eller flödescytometri.
Genom att skala denna LD formation assay till en 96-väl format, kan analysen också användas för hög genomströmning analys av LD formation till Screen för nya läkemedel som påverkar LD formation i mänskliga intestinala Organoid kulturer, eller att studera (mänskliga genetiska) störningar som påverkar LD metabolism.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGAT1 inhibitor (AZD 3988)</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4837/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty acid free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4078-9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamin (GlutaMAX, 100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD540</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09_500ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated 24 well plates</td>
			<td>Greiner-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated black clear-bottom 96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)&#160;</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (TrypLE Express)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids

Dietary lipider tas upp som fria fettsyror (FAs) av intestinal epitel. Dessa fas är intracellulärt omvandlas till triglycerid (TG) molekyler, innan de förpackas i kylomikroner för transport till lymfa eller i cytosoliska lipiddroppar (LDs) för intracellulär lagring. Ett avgörande steg för bildandet av LDs är den katalytiska aktiviteten av diacylglycerolacyltransferaser (DGAT) i det sista steget i TG-syntesen. LDs är viktiga för att buffra giftiga lipidarter och reglera cellulär metabolism i olika celltyper. Eftersom den mänskliga intestinal epitel regelbundet konfronteras med höga koncentrationer av lipider, LD formation är av stor betydelse för att reglera homeostas. Här beskriver vi en enkel analys för karakterisering och kvantifiering av LD formation (LDF) vid stimulering med de vanligaste omättade fettsyror, oljesyra, i mänskliga intestinal organoider. LDF-analysen är baserad på det LD-specifika fluorescerande färgämnet LD540, som möjliggör kvantifiering av LDs genom konfokalmikroskopi, fluorescerande Plattläsare eller flödescytometri. LDF-analysen kan användas för att karakterisera LD-bildningen i humana intestinala epitelceller, eller för att studera mänskliga (genetiska) sjukdomar som påverkar LD-metabolism, såsom DGAT1-brist. Dessutom kan denna analys också användas i en hög genomströmning pipeline för att testa nya terapeutiska föreningar, som återställer defekter i LD-bildning i tarm eller andra typer av organoider.

För korrekt analys av LD-bildningen bör organoiderna inte seedas för tätt före stimulering med OA och efterföljande färgning. Detta är särskilt viktigt för den konfokala och Plattläsare avläsning, eftersom överlappande organoider kan störa fluorescensen. Ett exempel på korrekt Organoid sådd täthet (figur 1A) och en kultur med överlappande Organoider visas (figur 1B). För att mi...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Detta protokoll beskriver en analys för karakterisering av lipid DROPP (LD) formation i mänskliga intestinal organoider vid stimulering med fettsyror. Vi diskuterar hur denna analys används för kvantifiering av LD-bildning, och hur den kan användas för hög genomströmning screening för läkemedel som påverkar LD-bildning.

En Fluorescensbaserad analys för karakterisering och kvantifiering av Lipidbildningen hos humana intestinala Organoider

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

Detta protokoll beskriver några metoder för att kvantifiera lipiddroppbildning i mänskliga intestinala organoider. Det kan användas som en hög genomströmning screening plattform för att testa för läkemedel som modulerar lipidd droppbildning. Den metod vi beskriver är baserad på en lipid droplet-specifika färgämne och biopsi-härledda intestinala organoider.Det ger därigenom en stabil, noggrann och fysiologiskt relevant modell för lipiddroppbildning. Detta protokoll kan användas för att screena för patientspecifika nya läkemedelskandidater som modulerar lipiddroppar bildning, till exempel i DGAT1-bristfälliga patienter. Denna lipiddroppbildningsanalys kan också appliceras på andra typer av organoidkulturer för att studera lipidmetabolism i andra celltyper.Analysen är i betydande utsträckning beroende av den organoida kulturens densitet. Försök att säkerställa en konsekvent organoid densitet över prover och experiment. Visuell demonstration av denna analys är kritisk eftersom det är viktigt att visa hur organoiden ska odlas och hur de ska hanteras för att säkerställa korrekt analys av lipiddroppbildning.Efter att ha förberett organoiderna aspirerar du noggrant odlingsmediet utan att störa dropparna av källarmembranmatris. Tillsätt 500 mikroliter av kallt basalt medium till den första brunnen av organoider. Med hjälp av en P1000-pipett, försiktigt pipetter upp och ner för att störa källaren membranmatrisdroppar med organoider.Upprepa detta förfaranden med samma medium i nästa väl som krävs, men inte skörda mer än två brunnar per 500 mikroliter av basalt medium. Samla organoiderna i ett lågbindande 1,5 milliliter mikrocentrifugrör och snurra ner dem i en minibordscentrifug i 15 till 20 sekunder. Tillsätt 400 mikroliter trypsin till de nedspunna organoiderna.Inkubera i ett vattenbad vid 37 grader Celsius i fem minuter. Därefter använder en P200-pipetter för att försiktigt pipettera suspensionen upp och ner för att störa de återstående aggregat av celler. Inkubera i ett vattenbad vid 37 grader Celsius i fem minuter.När endast enstaka celler återstår, tillsätt en milliliter basalt medium, och snurra ner cellerna i en mini-bordsskiva centrifug i 15 till 20 sekunder. Aspirera supernatanten helt. Använd en P200-pipett för att på nytt upphäva de enstaka cellerna i 200 mikroliter av färsk hSI-EM, och tillsätt ytterligare 800 mikroliter av hSI-EM.Räkna sedan antalet celler i suspension och beräkna volymen av celler som behövs för den slutliga celltätheten. Ta ut lämplig volym av suspension och justera densiteten till 750 celler per mikroliter. Lägg till källarmembranmatris till cellfjädringen i ett förhållande mellan två till en.Försiktigt pipettera suspensionen att blanda vara noga med att undvika att skapa bubblor. I en förvörd odlingstallrik, frö ut tre 10-mikroliter droppar per brunn om plattan har 24 brunnar eller en fem-microliter droppe per brunn om plattan har 96 brunnar. Placera plattan i en inkubator på 37 grader Celsius med fem procent koldioxid i 10 till 15 minuter för att stelna dropparna.Under tiden, för varm en lämplig volym av hSI-EM + Y i ett vattenbad vid 37 grader Celsius. Efter detta, lägg försiktigt till den förvarvade hSI-EM+Y till varje brunn av plattan. Inkubera cellerna i 37 grader Celsius med fem procent koldioxid.Efter två till tre dagar, byt ut mediet med hSI-EM och se till att uppdatera det två till tre gånger i veckan. Först, väga 0,2 gram flytande oljesyra vid rumstemperatur. Tillsätt 1,5 milliliter av kultur-grade steril PBS och värm blandningen till 70 grader Celsius i en timme att se till att virvel intermittent.Därefter väger 5,89 gram fettsyrefri BSA och lös upp den i 33,9 milliliter PBS. Värm blandningen i ett vattenbad vid 37 grader Celsius tills BSA är helt upplöst. Vortexa oljesyra blandningen igen för att skapa en emulsion av fina droppar och omedelbart lägga till den i BSA lösningen med hjälp av en glaspipett.Håll blandningen på 37 grader Celsius i 30 minuter tills en klar gulaktig lösning återstår. Passage organoiderna som tidigare beskrivits och utsäde ut organoid-härledda enstaka celler i en svart clear-bottom 96-väl platta. På dag sex av odling på hSI-EM, ersätta odlingsmediet med hSI-EM som innehåller en millimolar av oljesyra och BSA konjugat.Inkubera cellerna i 16 till 17 timmar vid 37 grader Celsius i närvaro eller frånvaro av 0,1 mikromolar DGAT1-hämmare. Efter detta aspirera mediet utan att störa källarmembranmatrisdropparna. Fixera organoiderna genom att lägga till 100 mikroliter av fyra procent neutral buffrad formaldehyd i brunnarna i 30 minuter vid rumstemperatur.Ta bort formaldehyden försiktigt och tvätta försiktigt cellerna med 150 mikroliter PBS per brunn. Fläck cellerna för lipiddroppar med 025 milligram per milliliter LD540 och DAPI i PBS i 15 minuter vid rumstemperatur i mörkret. Tvätta sedan brunnarna försiktigt med PBS.För översikt bilder av hela organoider använda en 40X subjektiva lämpade för confocal fluorescerande avbildning. Ställ in mikroskopet på bild för DAPI och LD540-färgämnet med hjälp av excitations- och emissionsinställningarna som visas här. Ställ in stifthålsstorleken på en luftig enhet för tillräcklig z-axelupplösning.Att avbilda en halv av en sfärisk organoid ställa in en z-stack till cirka 85 mikrometer. Med hjälp av ett lämpligt bildbehandlingssystem omvandlar du z-stacken för varje organoid till en maximal projektion genom att klicka på Image, Stacks, Z Project. Ställ in tröskeln för den maximala projektionen till en nivå där det inte finns någon LD540-signal synlig i BSA-fordonskontrollprovet genom att klicka på Bild, Justera, Tröskelvärde.Använd dessa inställningar för att tröskelvärde varje bild. Mät sedan den totala ytan av fluorescens för varje maximal projektion med hjälp av funktionen Analysera, Analysera partiklar. För korrekt analys av lipiddroppbildningen bör organoiderna inte sås för tätt före stimulering med oljesyra och efterföljande färgning.Detta är särskilt av betydelse för confocal och tallrik-läsare avläsning eftersom överlappande organoider kan störa fluorescens. Efter stimulering med en millimolar av oljesyra över natten kan lipiddroppbildning visualiseras med ett inverterat ljust fältmikroskop. Ansamlingen av lipiddroppar sprider överfört ljus, och därför verkar organoiderna mörkare, medan icke-stimulerade organoider har ett genomskinligt utseende.När de oljesyrassyre stimulerade organoiderna är fixerade och färgade kan lipiddroppbildningen visualiseras med hjälp av ett konfokalmikroskop. Eftersom organoiderna är 3D-strukturer, är ett regelbundet epifluorescerande mikroskop inte lämpligt på grund av den ofokuserade bakgrundssignalen, så en konfokal z-stack används för att karakterisera LDF i organoider. Kvantifiering av konfokalmikroskopiproverna kan också utföras med hjälp av en fluorescerande plattläsare som normaliseras till den fluorescerande Hoechst-signalen.Plattläsaranalysen indikerar en signifikant minskning av LD540-signalen i organoidceller som behandlats med DGAT1-hämmare jämfört med obehandlade organoider. Kvantifiering av LD-bildning i enskilda celler kan uppnås med hjälp av en flödescytometer. Den gating strategi som visas här är för dissociated mänskliga intestinala organoider.Representativa histogram för både SSC-A och LD540 signalen av den slutliga levande cell befolkningen visar att lipid droppbildning kommer att resultera i en ökning av SSC-A på grund av bildandet av intracellulära lipiddroppar. Dessutom, LD540 fläckar för lipider som lagras i lipiddropparna, och signalen kommer också att öka vid induktion av lipiddroppbildning. Som sådan mäts lipiddroppsbildning som en förskjutning i medelvärdet av fluorescerande intensitet hos både SSC-A och LD540.De mest avgörande stegen i detta protokoll är kulturen av mänskliga intestinala organoider och korrekt korrugation av oljesyra till BSA. För att tillgodose fler villkor, kan denna analys analyseras med hjälp av en fluorescerande tallrik läsare. För att korrigera för det organoida numret per brunn normaliserades LD540-signalen till DAPI-signalen.Med denna teknik, forskare kan studera lipiddroppbildning i organoida system, och förbättra olika analystekniker såsom elektronmikroskopi för att validera sina resultat.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Mammosphere Formation analys från Human bröstcancer vävnader och cellinjer

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Utnyttjande av Soft Agar kolonibildningsanalys för att identifiera inhibitorer för tumorgenes i bröstcancerceller

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Upprättande och karakterisering av UTI och CAUTI i en musmodell

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Tissue Characterization efter en ny Disaggregation metod för Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Strategisk Endothelial Cell Tube Formation analys: Jämföra Extracellulär Matrix och tillväxtfaktor Minskad Extracellulär Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolininducerad Svullnad i Intestinal Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Analys av Läkemedels svar i patienter med cystisk fibros

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Fluorescens-medierad tomografi för påvisande och kvantifiering av makrofag-relaterade murina tarminflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

En kinetisk fluorescens-baserad certifikatutfärdare2 + mobilisering analysen identifiera G-proteinkopplade receptoragonister och antagonister Allosteriska modulatorer

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

Samtidiga EKG inspelning och invasiv blod tryck mätning hos råttor

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Undersöka intestinal barriär nedbrytning i levande organoider

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...