Name: a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids
Uploaded: 2019-10-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

Biz cömertçe LD540 sağlayan için B. Spee teşekkür ederiz. Bu çalışma Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) Için S.M.

Burada tanımlanan insan dokuları kullanılarak yapılan tüm deneyler Utrecht Üniversitesi Tıp Merkezi (UMCU) etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Wilhelmina Çocuk Hastanesi (WKZ)-UMCU'daki hastalardan organoidlerin toplanması, üretimi, depolanması ve kullanımı için bilgilendirilmiş onam alındı.
1. Kültür Medyasının Hazırlanması
NOT: Bu protokol bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır. Organoidler standart hücre k?...

<ol>
	<li>Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+triacylglycerol+synthesis+in+fat+absorption+and+systemic+energy+metabolism.">Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism.</a> Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).</li><li>Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+glycerolipids.+DGAT+enzymes+and+triacylglycerol+biosynthesis.">Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis.</a> Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).</li><li>D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+discoveries+on+absorption+of+dietary+fat:+Presence,+synthesis,+and+metabolism+of+cytoplasmic+lipid+droplets+within+enterocytes.">Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).</li><li>Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fat+absorption+and+effect+of+sham+feeding+on+postprandial+lipema.">Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema.</a> Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).</li><li>Chitraju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+Synthesis+by+DGAT1+Protects+Adipocytes+from+Lipid-Induced+ER+Stress+during+Lipolysis.">Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis.</a> Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).</li><li>van Rijn, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+failure+and+aberrant+lipid+metabolism+in+patients+with+DGAT1+deficiency.">Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency.</a> Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).</li><li>Haas, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DGAT1+mutation+is+linked+to+a+congenital+diarrheal+disorder.">DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).</li><li>Gluchowski, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+a+novel+DGAT1+missense+mutation+associated+with+congenital+diarrhea.">Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea.</a> Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).</li><li>Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+Diarrhea+From+DGAT1+Mutation+Leading+to+Electrolyte+Derangements,+Protein-losing+Enteropathy,+and+Rickets.">Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).</li><li>Stephen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+protein+losing+enteropathy:+an+inborn+error+of+lipid+metabolism+due+to+DGAT1+mutations.">Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations.</a> European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).</li><li>Schlegel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+deficits+in+apical+transporter+trafficking+associated+with+deficiency+in+diacylglycerol+acyltransferase.">Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).</li><li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triacylglycerol+synthesis+enzymes+mediate+lipid+droplet+growth+by+relocalizing+from+the+ER+to+lipid+droplets.">Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets.</a> Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function.">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forskolin-induced+Swelling+in+Intestinal+Organoids:+An+In+Vitro+Assay+for+Assessing+Drug+Response+in+Cystic+Fibrosis+Patients.">Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+multicolor+imaging+of+lipid+droplets+with+a+new+dye,+LD540.">Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540.</a> Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).</li><li>Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dgat1+and+Dgat2+regulate+enterocyte+triacylglycerol+distribution+and+alter+proteins+associated+with+cytoplasmic+lipid+droplets+in+response+to+dietary+fat.">Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).</li></ol>

Burada, oleik asit ile kuluçka üzerine insan bağırsak organoidlerinde LD oluşumunu belirlemek için bir protokol sağlar. Bu yöntem LD'ye özgü floresan boya LD54018'edayanmaktadır, bu da organoid kültürdeki lipid damlacıklarının toplam hacminin karakterizasyonuna ve ölçülmesine olanak sağlar. İnsan bağırsak organoid kültürleri kurmak ve korumak için prosedürler13önce yayınlanmıştır , ve bu protokolün görsel bir rehber de mevcuttur<sup class="...

Lipidler insan diyetinin önemli bir bileşenidir ve sistemik enerji depolama ve metabolizmaönemli bir rol oynamaktadır. Sindirildiğinde, diyet lipidleri pankreas lipazları tarafından serbest yağ asitleri (FFA) ve monogliseritler (MGs) içine bozulur. Bu substratlar daha sonra bağırsak epitelinin enterositleri tarafından alınır, burada ilk olarak monogliserit ayltransferazlar (MGAT) enzimleri tarafından digliseritlere (DG) ve daha sonra diacylrigerolerol tarafından trigliserid (TG) tarafından yeniden esterlenirler. acyltransferaz 1 (DGAT1)1. Son olarak, bu TGs ya lenf sistemine veya sitosolik lipid damlacıkları (LDs) hücre içi depolama için ihracat için şilomikronlar entegre edilmiştir2,3. Şilomikronlar diğer organlara diyet lipidleri dağıtmak için gerekli olmasına rağmen, LDs hücre içi yağ depolama önemi tamamen açık değildir. Ancak, LDs bağırsakta düzenleyici bir işlev icra gösterilmiştir, onlar yavaş yavaş bir yemekten sonra dolaşıma lipidler serbest olarak 16 saat4. Ayrıca, LDs toksik yağ asidi konsantrasyonlarına karşı korumak için gösterilmiştir, lipolitik koşullar sırasında fare adipositler gibi5.
DGAT1 proteini endoplazmik retikulum (ER) membranÜzerinde yer alır ve intestinal epitelde LD oluşumunda önemli rol oynar. DGAT1'deki homozigot mutasyonlar erken başlayan şiddetli ishale ve/veya kusmaya, hipoalbuminemiye ve/veya (ölümcül) protein kaybeden enteropatiye yol açarak yağ alımı üzerine bağırsak yetmezliği ile birlikte, insan lipid homeostazisinde DGAT1'in önemini gösterir. bağırsak epitel6,7,8,9,10. İnsanlarda DGAT1 eksikliğinin ortaya çıkması nadir olduğundan, primer hasta kaynaklı hücrelere erişim az olmuştur. Ayrıca, bağırsak epitel hücrelerinin uzun vadeli kültür uzun sadece sınırlı bir uzatmak için normal fizyolojisi temsil tümör kaynaklı hücre hatları ile sınırlı olmuştur. Bu nedenle, DGAT1 aracılı LD oluşumu çoğunlukla fibroblastlar veya hayvan kaynaklı hücre hatları7,10,11,12çalışılmıştır. Bu nedenle, son zamanlarda DGAT1-eksik hasta kaynaklı fibroblastlar oleik asit ile stimülasyon sonra sağlıklı kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında daha az DDs birikir gösterilmiştir (OA)8.
Daha önce, protokoller üç boyutlu (3D) organoidler13şeklinde herhangi bir gastrointestinal organdan kültür epitel kök hücreleri kurulmuştur. Bu bağırsak organoidleri uzun bir süre kültürde tutulabilir13, ve hasta fonksiyonel çalışma sağlar- ve bağırsak konumuna özgü epitel özellikleri14. Onlar genetik ve fenotipik kararlı ve saklanabilir, uzun vadeli genişleme ve biyobankacılık izin13.
Yakın zamanda LD oluşumunun insan bağırsak organoidlerinde ld oluşumunda (LDF)6'dakolayca ölçülebileceğini gösterdik. 16 saat boyunca OA maruz kaldığında, organoidler lipid kaynaklı toksisite hücreleri korumak için LDs oluşturmak. OA konsantrasyonları çok yüksek olduğunda, hücreler caspase aracılı apoptoz6tarafından ölür. LDF tsay daha önce büyük ölçüde DGAT1 bağımlı olduğu gösterilmiştir organoidler DGAT1-mutant hastalardan elde edilen ve DGAT1-spesifik inhibitörleri kullanımı ile gösterildiğigibi 6.
Burada ayrıntılı olarak açıklanan LDF analizi için, 3D organoidler bağırsak biyopsilerinden kültürlenir ve kolayca yeni organoidler oluşturan tek hücrelere bozulma tarafından haftalık olarak geçmektedir. LDF analizini çalıştırmak için, ~7,500 organoid kaynaklı tek hücre 24 kuyulu bir plakanın her kuyusunda kaplanır. Organoidler birkaç gün içinde oluşur, bir gecede 1 mM OA ile kuluçkaya yatırılır ve görüntülemeyi kolaylaştıran floresan hücre geçirilmezLD spesifik boya LD540 ile boyanmıştır. LD oluşumu daha sonra konfokal mikroskopi, floresan plaka okuyucu veya akış sitometrisi ile ölçülür.
96-iyi bir biçimde bu LD oluşumu tahlil ölçekleme olarak, tahlil de insan bağırsak organoid kültürlerde LD oluşumunu etkileyen yeni ilaçlar için ekran ld oluşumunun yüksek iş lenme analizi için kullanılabilir, ya da etkileyen (insan genetik) bozuklukları çalışma LD metabolizması.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DGAT1 inhibitor (AZD 3988)</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>4837/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty acid free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>4078-9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamin (GlutaMAX, 100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD540</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09_500ug</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oleic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O1008-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated 24 well plates</td>
			<td>Greiner-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-treated black clear-bottom 96 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>353219</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)&#160;</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (TrypLE Express)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120129-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based assay for characterization and quantification of lipid droplet formation in human intestinal organoids

Diyet lipidler bağırsak epitel tarafından serbest yağ asitleri (FAs) olarak alınır. Bu FA'lar hücre içi trigliserid (TG) moleküllerine dönüştürülür, lenfe veya hücre içi depolama için sitozolik lipid damlacıklarına (LD) götürülmek üzere şilomikronlara paketlenmeden önce. LDs oluşumu için önemli bir adım Diacylglycerol ayltransferazların katalitik aktivitesidir (DGAT) TG sentezinin son adımında. LDs toksik lipid türleri tampon ve farklı hücre tiplerinde hücresel metabolizmayı düzenleyen önemlidir. İnsan bağırsak epiteli düzenli lipidlerin yüksek konsantrasyonlarda ile karşı karşıya olduğundan, LD oluşumu homeostaz düzenlemek için büyük önem taşımaktadır. Burada insan bağırsak organoidlerinde en sık görülen doymamış yağ asidi, oleik asit ile uyarılması üzerine LD oluşumunun (LDF) karakterizasyonu ve nicelemesi için basit bir analiz açıklıyoruz. LDF testi, ld'lerin konfokal mikroskopi, floresan plaka okuyucu veya akış sitometrisi ile ölçülmesine olanak tanıyan LD'ye özgü floresan boya LD540'ya dayanmaktadır. LDF analizi insan bağırsak epitel hücrelerinde LD oluşumunu karakterize etmek için kullanılabilir, veya LD metabolizmasını etkileyen insan (genetik) bozuklukları incelemek için, DGAT1 eksikliği gibi. Ayrıca, bu test aynı zamanda yeni terapötik bileşikleri test etmek için yüksek iş lenme boru hattı kullanılabilir, hangi bağırsak veya organoidlerin diğer türleri LD oluşumunda kusurları geri.

LD oluşumunun doğru analizi için, organoidler OA ve sonraki boyama ile stimülasyon öncesinde çok yoğun tohumlu olmamalıdır. Örtüşen organoidler floresan ile müdahale edebilir, çünkü bu konfokal ve plaka okuyucu okuma için özellikle önemlidir. Uygun organoid tohumlama yoğunluğuna bir örnek(Şekil 1A) ve üst üste binen organoidlere sahip bir kültür gösterilmiştir (Şekil 1B</stro...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids at JoVE.com

A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids

Bu protokol yağ asitleri ile stimülasyon üzerine insan bağırsak organoidlerinde lipid damlacık (LD) oluşumunun karakterizasyonu için bir test açıklar. Bu denemenin LD oluşumunun nicelleştirilmesi için nasıl kullanıldığını ve LD oluşumunu etkileyen ilaçlar için yüksek iş elde taramalarda nasıl kullanılabileceğini tartışıyoruz.

İnsan Bağırsak Organoidlerinde Lipid Damlacık Oluşumunun Karakterizasyonu ve Niceliği için Floresan Esaslı Bir Test

Dietary lipids are taken up as free fatty acids (FAs) by the intestinal epithelium. These FAs are intracellularly converted into triglyceride (TG) ...

Bu protokol, insan bağırsak organoidlerinde lipid damlacık oluşumunu ölçmek için bazı yöntemleri açıklamaktadır. Lipid damlacık oluşumunu modüle eden ilaçlar için test etmek için yüksek iş letiye tarama platformu olarak kullanılabilir. Tarif ettiğimiz yöntem lipid damlacıklarına özgü boya ve biyopsi kaynaklı intestinal organoidlere dayanmaktadır.Bu nedenle lipid damlacık oluşumu için kararlı, doğru ve fizyolojik olarak ilgili bir model sağlar. Bu protokol, örneğin DGAT1 eksikliği olan hastalarda lipid damlacıklarının oluşumunu modüle eden hastaya özel yeni ilaç adaylarının taranması için kullanılabilir. Bu lipid damlacık oluşumu tsay da diğer hücre tiplerinde lipid metabolizması çalışmak için organoid kültürlerin diğer türleri uygulanabilir.Tsur önemli ölçüde organoid kültürün yoğunluğuna bağlıdır. Örnekler ve deneyler arasında tutarlı bir organoid yoğunluğu sağlamaya çalışın. Bu testin görsel gösterimi önemlidir, çünkü organoidin nasıl kültüre alınması gerektiğini ve lipid damlacık oluşumunun doğru analizini sağlamak için nasıl ele alınması gerektiğini göstermek önemlidir.Organoidler hazırlandıktan sonra, dikkatle bodrum membran matris damlacıkları rahatsız etmeden kültür ortamı aspire. Organoidlerin ilk kuyusu için soğuk bazal orta 500 mikrolitre ekleyin. Bir P1000 pipet kullanarak, hafifçe pipet yukarı ve aşağı organoidler ile bodrum membran matris damlacıkları bozmak için.Bu prosedürleri bir sonraki ortamda aynı ortamda gerekli olduğu kadar tekrarlayın, ancak 500 mikrolitre bazal ortam için ikiden fazla kuyu hasat etmeyin. Organoidleri düşük bağlayıcı 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpte toplayın ve 15 ila 20 saniye boyunca mini masa üstü bir santrifüjde döndürün. Bükülmüş organoidlere 400 mikrolitre tripsin ekleyin.37 derecede bir su banyosunda beş dakika kuluçkaya yat. Daha sonra, kalan hücre toplamlarını bozmak için süspansiyonu yavaşça yukarı ve aşağı pipetlemek için P200 pipetkullanın. 37 derecede bir su banyosunda beş dakika kuluçkaya yat.Sadece tek hücreler kaldığında, bir mililitre bazal ortam ekleyin ve hücreleri 15 ila 20 saniye boyunca mini masa üstü bir santrifüjde aşağı döndürün. Supernatant'ı tamamen aspire edin. 200 mikrolitre taze hSI-EM'deki tek hücreleri yeniden askıya almak ve 800 mikrolitre hSI-EM eklemek için Bir P200 pipet kullanın.Daha sonra askıya alınan hücre sayısını sayın ve son hücre yoğunluğu için gereken hücre hacmini hesaplayın. Uygun süspansiyon hacmini çıkarve yoğunluğu mikrolitre başına 750 hücreye ayarlayın. Hücre süspansiyonuna ikiye bir oranında bodrum membran matrisi ekleyin.Yavaşça kabarcıklar oluşturmaktan kaçınmak için dikkatli olmak karıştırmak için süspansiyon pipet. Önceden ısıtılmış bir kültür plakasında, plakada 24 kuyu veya her kuyuda 96 kuyu varsa, kuyu başına bir adet beş mikrolitrelik damlacık varsa, kuyu başına üç adet 10 mikrolitrelik damlacık çıkar. Damlacıkları katılaştırmak için plakayı 37 derecede yüzde beş karbondioksitle 10 ila 15 dakika boyunca kuvöze yerleştirin.Bu arada, 37 santigrat derece bir su banyosunda hSI-EM +Y uygun bir hacim Önceden ısıtın. Bundan sonra, plakanın her kuyuya önceden ısıtılmış hSI-EM+Y'yi dikkatlice ekleyin. Hücreleri %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın.2-3 gün sonra ortamı hSI-EM ile değiştirin ve haftada 2-3 kez yenilediğinden emin olun. İlk olarak, oda sıcaklığında sıvı oleik asit 0,2 gram tartın. Kültür sınıfı steril PBS 1,5 mililitre ekleyin ve aralıklı girdap emin olmak için bir saat boyunca 70 santigrat derece karışımı ısı.Daha sonra, yağ asidi içermeyen BSA 5,89 gram tartmak ve PBS 33,9 mililitre içinde eritin. BSA tamamen eriyene kadar karışımı 37 santigrat derecede bir su banyosunda ısıtın. Girdap oleik asit karışımı tekrar ince damlacıkların bir emülsiyon oluşturmak ve hemen bir cam pipet kullanarak BSA çözeltisi ekleyin.Açık sarımsı bir çözelti kalana kadar karışımı 37 derecede 30 dakika bekletin. Daha önce açıklandığı gibi organoidler geçiş ve siyah bir açık alt 96-iyi plaka içine organoid kaynaklı tek hücreleri tohum. HSI-EM'de kültür ortamının altıncı gününde, oleik asit ve BSA konjuge bir milimolar içeren hSI-EM ile kültür ortamını değiştirin.0.1 mikromolar DGAT1 inhibitörü varlığı veya yokluğunda 37 santigrat derece 16 ila 17 saat boyunca hücreleri kuluçka. Bundan sonra, bodrum membran matris damlacıkları rahatsız etmeden orta aspire. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuyulara %4 nötr tamponlu formaldehitin 100 mikrolitresini ekleyerek organoidleri sabitleyin.Formaldehiti nazikçe çıkarın ve hücreleri her kuyuda 150 mikrolitre PBS ile dikkatlice yıkayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca mililitre LD540 başına 025 miligram ve PBS'de DAPI ile lipid damlacıkları için hücreleri lekeleyin. Daha sonra kuyuları PBS ile dikkatlice yıkayın.Tüm organoidlerin genel bakış görüntüleri için konfokal floresan görüntüleme için uygun bir 40X öznel kullanın. Burada gösterilen uyarma ve emisyon ayarlarını kullanarak mikroskobu DAPI ve LD540 boyaiçin görüntüye ayarlayın. Yeterli z ekseni çözünürlüğü için iğne deliği boyutunu tek bir havadar üniteye ayarlayın.Küresel bir organoidin yarısını görmek için yaklaşık 85 mikrometreye kadar bir z destesi ayarlayın. Uygun bir görüntü işleme sistemi kullanarak, Görüntü, Yığınlar, Z Projesi'ni tıklatarak her organoidin z yığınını maksimum projeksiyona dönüştürün. En yüksek projeksiyon eşiğini, Görüntü, Ayarla, Eşik'e tıklayarak BSA araç kontrol numunesinde görünür olmayan LD540 sinyalinin olmadığı bir seviyeye ayarlayın.Her görüntüyü eşiğe getirmek için bu ayarları kullanın. Daha sonra analiz, parçacıkları analiz et işlevini kullanarak her maksimum projeksiyon için toplam floresan alanını ölçün. Lipid damlacık oluşumunun doğru analizi için, organoidler oleik asit ve sonraki boyama ile stimülasyon öncesinde çok yoğun tohumlu olmamalıdır.Örtüşen organoidler floresan ile müdahale edebilir beri bu konfokal ve plaka okuyucu okuma için özellikle önemlidir. Bir gecede oleik asit milimolar ile uyarılmasından sonra, lipid damlacık oluşumu ters parlak alan mikroskobu ile görüntülenebilir. Lipid damlacıklarının birikmesi ışığı saçar ve bu nedenle organoidler daha koyu görünür, uyarılmayan organoidler ise yarı saydam bir görünüme sahiptir.Oleik asit uyarılmış organoidler sabit ve lekeli sonra, lipid damlacık oluşumu bir konfokal mikroskop kullanılarak görselleştirilmiş olabilir. Organoidler 3D yapılar olduğundan, düzenli bir epifloresan mikroskop odak dışı arka plan sinyali nedeniyle uygun değildir, bu yüzden organoidlerde LDF karakterize etmek için bir konfokal z-stack kullanılır. Konfokal mikroskopi örneklerinin sayısallaştırılması, floresan Hoechst sinyaline normalleştirilmiş floresan plaka okuyucu suması kullanılarak da yapılabilir.Plaka okuyucu analizi, dgat1 inhibitörü ile tedavi edilen organoid hücrelerde LD540 sinyalinde tedavi edilmeyen organoidlere göre önemli bir düşüş olduğunu gösterir. Tek tek hücrelerde LD oluşumunun nicelleştirilmesi bir akış sitometresi kullanılarak elde edilebilir. Burada gösterilen gating stratejisi ayrışmış insan bağırsak organoidleri içindir.Son canlı hücre popülasyonunun hem SSC-A hem de LD540 sinyali için temsili histogramlar lipid damlacıklarının hücre içi lipid damlacıklarının oluşumuna bağlı olarak SSC-A'da artışa yol açacağını göstermektedir. Buna ek olarak, lipid damlacıkları depolanan lipidler için LD540 lekeleri, ve sinyal de lipid damlacık oluşumunun indüksiyon uyupüzerine artacaktır. Bu nedenle, lipid damlacık oluşumu hem SSC-A ve LD540 ortalama floresan yoğunluğu nda bir kayma olarak ölçülür.Bu protokolün en önemli adımları insan bağırsak organoidleri kültürü ve BSA için oleik asit uygun olukluluk vardır. Daha fazla koşul alabilmek için, bu test floresan plaka okuyucu kullanılarak analiz edilebilir. Her kuyudaki organoid sayısını düzeltmek için LD540 sinyali DAPI sinyaline normalleştirildi.Bu teknikle, araştırmacılar organoid sistemlerde lipid damlacık oluşumunu inceleyebilir ve bulgularını doğrulamak için elektron mikroskobu gibi çeşitli analiz tekniklerini geliştirebilirler.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Medicine

Unit 1

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

İnsan Göğüs Kanseri dokuları ve hücre hatlarından gelen Mammosphere Oluşumu Testi

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Yumuşak Agar koloni oluşturma deneyi kullanılması Meme Kanseri Hücrelerinde tümör oluşum nedenlerinin nin inhibitörlerini teşhis etmek üzere

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Fare Modelinde Kuruluş ve İYE ve CAUTI Karakterizasyonu

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Cilt Mikro-Greftler Üretimi için Yeni Bir Ayrıştırma Yöntemi sonra doku karakterizasyonu

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Stratejik Endotel Hücre Tüp Oluşumu Testi: Azaltılmış Ekstrasellüler Matrix Ekstrasellüler Matrix ve Büyüme Faktörü Karşılaştırılması

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin kaynaklı bağırsak Organoids şişme: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Kistik Fibrozis Hastalarında İlaç Tepki değerlendirilmesi için

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Floresan-aracılı tomografi algılama ve fare bağırsak iltihabı makrofaj ile ilgili miktar

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

A Kinetic Fluorescence-based Ca2+ Mobilization Assay to Identify G Protein-coupled Receptor Agonists, Antagonists, and Allosteric Modulators

Bir Kinetik Floresans tabanlı Ca2 + seferberlik tahlil G Protein birleştiğinde reseptör agonistleri, antagonistleri ve Allosteric modülatörler tanımlamak için

G protein-coupled receptors (GPCRs) are of great importance to the pharmaceutical industry as they are involved in many human diseases and include ...

Simultaneous Electrocardiography Recording and Invasive Blood Pressure Measurement in Rats

Eşzamanlı elektrokardiyografi kayıt ve invaziv kan basınç ölçüm sıçanlarda

For studies related to cardiovascular physiology or pathophysiology, blood pressure (BP) and electrocardiography are basic observational parameters. ...

Investigating Intestinal Barrier Breakdown in Living Organoids

Yaşayan Organoidlerde Bağırsak Bariyerinin Bozulmasının Araştırılması

Organoids and three-dimensional (3D) cell cultures allow the investigation of complex biological mechanisms and regulations in vitro, which previously was ...