Name: medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions
Uploaded: 2019-08-15T15:00:00
Duration: 6 min 17 s
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Cette recherche a été financée par le Fonds scientifique autrichien (FWF) : numéros de projet P 29360 et P 29143. La publication a été soutenue par Publikationsfonds der Universitàt Innsbruck. Nous reconnaissons grandement le GIE.

1. Préparation du milieu
<ol><li>Préparer la solution de stock d'indicateur redox (0,1 g de résine/100 mL solution aqueuse).</li>
	<li>Préparer une solution vitaminique (tableau 1).</li>
	<li>Préparer la solution d'oligo-éléments (tableau 2). REMARQUE : L'ordre d'ajout est important; veuillez consulter le tableau 2 et les protocoles respectifs.</li>
	<li>Préparer la solution de stock d'agent de réduction (60 g Na2S/L solution aqueuse).</li>
	<li>Peser les ingrédients moyens (milieu de sel minéral, tableau 3) dans un flacon approprié (p. ex., 1 L flacon de bouchon à vis). REMARQUE : Selon la configuration expérimentale, l'ajout d'une source de carbone distincte pourrait être nécessaire.</li>
	<li>Ajouter le demi-volume d'eau distillée (tableau3) et dissoudre les ingrédients.</li>
	<li>Ajouter 1 ml de solution d'indicateur redox selon le tableau 3.</li>
	<li>Ajouter la vitamine et la solution d'oligo-éléments selon le tableau 3.</li>
	<li>Ajuster le pH en fonction des besoins moyens/organismes du tableau 3. REMARQUE : La couleur de l'indicateur redox dépend du pH et peut nécessiter un certain temps pour s'ajuster.</li>
	<li>Porter à un volume final de 1 L avec de l'eau distillée. REMARQUE : Des solutions de vitamines et d'oligo-éléments peuvent également être ajoutées après l'autoclacnage automatique en ajoutant aseptiquement un aliquot stérilisé par filtre (solutions diluées, taille des pores de filtre s'il y a 0,2 m) dans des flacons de sérum précédemment fermés et autoclaves. Toutefois, cette approche comporte un risque élevé de contamination.</li>
</ol>2. Remplissage des flacons de culture
<ol><li>Nettoyer et sécher soigneusement les flacons de sérum de 120 ml. REMARQUE : Les flacons de sérum sont disponibles en différentes capacités de volume (p. ex. 20, 60, 120, 250 ml).</li>
	<li>Bien propre et sec butyl caoutchouc septa.</li>
	<li>Peser d'autres composants moyens (p. ex. substrats précurseurs d'acide phényl) dans les flacons de culture. REMARQUE : Les composants supplémentaires dépendent de la configuration expérimentale et de l'hypothèse.</li>
	<li>Remplir les flacons de sérum de 50 ml de milieu.</li>
</ol>3. Réduction/enlèvement de l'oxygène dans la phase liquide
<ol><li>Préparer un bain d'eau à 100 oC.</li>
	<li>Mettre les flacons de sérum remplis dans le bain d'eau et couver pendant environ 20-30 min pour réduire la solubilité de O2 dans la phase liquide.</li>
	<li>Rincer immédiatement l'espace de tête avec du gaz N2 ou alternativement avec d'autres mélanges de gaz ou de gaz comme N2/CO2. ATTENTION : Prenez soin de la ventilation appropriée de la pièce.</li>
	<li>Fermez les flacons avec le septa en caoutchouc butyl et fixez-le avec des bouchons en aluminium. REMARQUE : Le septa en caoutchouc peut souvent s'adapter mieux sur le cou du flacon en ajoutant une goutte d'eau/moyenne tout en le perçant dedans.</li>
	<li>Ajouter 0,1 ml d'agent réducteur (solution de stock) à chaque flacon rempli de 50 ml de milieu pour réduire davantage le potentiel redox (0,1 ml d'agent réducteur par 50 ml de milieu).</li>
	<li>Autoclave de 20 min à 121 oC. CAUTION: Un autoclave certifié pour la stérilisation des navires fermés doit être utilisé. Sinon, la surpression dérivée de l'augmentation de la température pourrait provoquer l'explosion de flacons de sérum.</li>
</ol>4. Inoculation du milieu
<ol><li>Préparer l'inoculum à partir d'un digesteur anaérobie.<ol>
<li>Ajouter 400 ml d'eau distillée dans un flacon et porter à ébullition.</li>
		<li>Refroidir (lt; 30 oC) tout en rinçant définitivement l'espace de tête avec N2.</li>
		<li>Ajouter environ 100 g de boues provenant d'un digesteur anaérobie. REMARQUE : Évitez tout contact excessif avec les boues avec l'oxygène.</li>
		<li>Enregistrez la masse exacte de boues ajoutées pour la détermination exacte de la dilution.</li>
		<li>Échangez l'espace de tête du flacon avec N2 et fermez-le avec un septum en caoutchouc butyl.</li>
		<li>Agiter le flacon pendant 30 min à 120 tr/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirez l'inoculum de 5 ml à l'aide de la seringue et de la canule et injectez-la dans les flacons de sérum préparés tels que décrits à l'étape 1-3.</li>
</ol>5. Incubation, échantillonnage et analyse
<ol><li>Incuber des flacons de sérum inoculés à une température appropriée pour l'expérience respective. REMARQUE : La température d'incubation dépend de la configuration expérimentale et de l'inoculum utilisé.<ol>
<li>Égoutter la surpression résultant de l'augmentation de la température à l'aide de la seringue et de la canule, lorsque le liquide dans les flacons de sérum a réopéré à la température d'incubation (environ 15 à 30 min, selon la température d'incubation). CAUTION: Selon le substrat appliqué, sa concentration, sa température, son temps d'incubation, son type d'inoculum et sa concentration, la surpression dans les flacons peut augmenter jusqu'à 2 à la pression de la barre et pourrait provoquer l'explosion de sépultures. La surveillance de la surpression à l'aide d'un manomètre et, par la suite, la surpression à l'aide d'une canule est donc obligatoire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Évaluer la production et la composition du biogaz pendant le temps d'incubation. REMARQUE : La période d'incubation peut s'étendre de quelques jours à plusieurs semaines.<ol>
<li>Enregistrez la pression atmosphérique actuelle.</li>
		<li>Préparer un manomètre et évaluer la pression dans les flacons dérivés de l'activité microbienne.</li>
		<li>Secouez les flacons.</li>
		<li>Enlever 1 ml de gaz de l'espace de têteà l'aide d'une seringue et d'une canule, et mesurer les concentrations de H 2, O2, CH4et/ou CO2 par chromatographie gazeuse. REMARQUE : Pour la qualification et la quantification de H2, O2, CH4, et CO2, un chromatographe à gaz a été utilisé en appliquant des températures de fonctionnement de 160 oC (four à colonnes), de 100 oC (injecteur) et de 180 oC (détecteur de conductivité thermique, TCD ). N2 a été utilisé comme un gaz de transport. Pour plus de détails, consultez les études précédentes10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Surveiller les concentrations d'acides gras volatils (VFA) et d'acides phényles. Pour l'analyse vfA et l'acide phényl, utilisez un système HPLC équipé d'un détecteur UV (à 220 nm) fonctionnant avec 5 mM H2SO4 comme phase mobile. Pour plus de détails sur la méthode et des informations supplémentaires sur le stockage d'échantillons, veuillez consulter les études précédentes11. REMARQUE : L'analyse de VFA est exemplaire pour beaucoup d'autres analyses physico-chimiques ou évaluations microscopiques. En outre, des méthodes biologiques moléculaires ciblant l'abondance de micro-organismes spécifiques et/ou la composition de la communauté microbienne à un certain moment de l'expérience peuvent être appliquées à l'aide de la procédure décrite.<ol>
<li>Retirer 1 ml de liquide à l'arme à d'oreille. REMARQUE : Les échantillons peuvent être congelés (-20 oC) immédiatement après le retrait et analysés à la fin de l'expérience11.</li>
		<li>Centrifugeuse à 15 000 à 20 000 x g et passe à travers des filtres rc (cellulose régénérée) de 0,2 m RC.</li>
		<li>Injecter de 5 à 20 L sur un système HPLC et analyser la composition et la concentration d'acides phényls.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Égoutter la surpression du flacon à l'aide d'une canule. REMARQUE : Après avoir déterminé la pression et la composition du gaz ainsi que la prise de tout échantillon nécessaire, placez le flacon de culture sur la température respective et ne drainez pas la surpression avant que le liquide ait atteint la température d'incubation.</li>
	<li>Calculer la production de biogaz et de méthane VCH4N en considérant la loi idéale sur le gaz à l'aide de l'équation 1-3. Veuillez également consulter le tableau 4. Équation 1 :<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60155/60155eq1v2.jpg"> par quoi Équation 2 :<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60155/60155eq2v2.jpg"> et Équation 3 :<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60155/60155eq3v3.jpg"> REMARQUE : Pour le calcul de la production totale de biogaz, la quantité de CH4 % et de CH4 %X dans les équations 2 et 3 doit être fixée à 100. NmL : volume de gaz normalisé dans des conditions normalisées (0 oC, 1 atm), en vertu duquel le volume de gaz molaire est de 22,414 NmL/mmol.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wiebe, W. J., Pomeroy, L. R., Wiegert, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+Respiration+and+Fermentation.">Anaerobic Respiration and Fermentation.</a> The Ecology of a Salt Marsh. , 137-159 (1981).</li><li>Kim, B. H., Gadd, G. M., Kim, B. H., Gadd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+fermentation.">Anaerobic fermentation.</a> Bacterial physiology and metabolism. , 252-297 (2008).</li><li>Stolz, J. F., Oremland, R. 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O., Hohlbrugger, P., Lins, P., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+nitrogen+sources+on+the+biogas+production+-+a+lab-scale+investigation.">Effects of different nitrogen sources on the biogas production - a lab-scale investigation.</a> Microbiological research. 167 (10), 630-636 (2012).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation,+preservation,+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants.">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li><li>Uzarski, J. S., DiVito, M. D., Wertheim, J. A., Miller, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+design+considerations+for+the+resazurin+reduction+assay+to+noninvasively+quantify+cell+expansion+within+perfused+extracellular+matrix+scaffolds.">Essential design considerations for the resazurin reduction assay to noninvasively quantify cell expansion within perfused extracellular matrix scaffolds.</a> Biomaterials. 129, 163-175 (2017).</li><li>Costilow, R. N., Breznak, J. A., Marzluf, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+Factors+in+Growth.">Physicochemical Factors in Growth.</a> Methods for General and Molecular Microbiology. , 309-329 (2007).</li><li>Le Mer, J., Roger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+oxidation,+emission+and+consumption+of+methane+by+soils:+a+review.">Production, oxidation, emission and consumption of methane by soils: a review.</a> European Journal of Soil Biology. 37 (1), 25-50 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verein+deutscher+Ingenieure+VDI+4630:+Fermentation+of+organic+material.">Verein deutscher Ingenieure VDI 4630: Fermentation of organic material.</a> VDI Richtlinien. , (2006).</li><li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+acetate:+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments.">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li></ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

L'étape la plus importante et la plus critique dans la culture des micro-organismes anaérobies est d'assurer des conditions sans oxygène dans les médias de culture et l'espace de tête des flacons. Un indicateur comme la résazurine peut être utilisé pour vérifier indirectement le remplissage anaérobie correct des flacons. La resazurin est un colorant redox couramment utilisé car il est peu coûteux, non toxique, et déjà efficace à faibles doses et les temps d'incubation courts 12. Lorsqu'il est incorporé aux médias, la résine de couleur bleue subit d'abord une étape de réduction irréversible à la résorufine, qui est rose à des valeurs de pH neutres. Cette première réaction peut se produire lorsque les médias sont chauffés 13. Par la suite, la résorufine est réduite à la dihydrorésorufine incolore dans une réaction secondaire réversible (figure 7)12. Le système redox resorufin/dihydroresorufin devient complètement incolore à un potentiel standard d'oxydation-réduction d'environ Eh -110 mV et tourne rose au-dessus d'un potentiel redox de -51 mV 13.
Afin de réduire davantage le potentiel redox, par exemple, pour faciliter la croissance de micro-organismes méthanogéniques connus pour nécessiter moins de -200 mV14, une solution Na2S peut être ajoutée. Alternativement, la cystéine-HCl, le sodium-thioglycolate, ou la dithionite de sodium sont couramment employés. Cependant, quel agent de réduction est approprié d'utiliser dépend de la configuration expérimentale respective et pourrait nécessiter une attention particulière. Par exemple, le thioglycolate de sodium a besoin d'activation de la température (p. ex., par autoclaclacage).
Un consortium microbien bien équilibré, composé de divers genres de bactéries et d'archées, et d'une cascade de dégradation anaérobie efficace peut être évalué en déterminant la composition du gaz dans la culture par l'intermédiaire du gaz Chromatographie. Lors de la manipulation de composés comme les acides phényl dérivés de différents précurseurs, l'évaluation de l'espace de tête est un moyen rapide de vérifier le processus de méthanogenèse8. Une concentration d'espace de tête CH4 d'environ 50-60% dans les contrôles à la fin de la période d'incubation indique une utilisation réussie des nutriments appliqués et donc une minéralisation de la matière organique dans des conditions anaérobies. La production théorique de méthane et les concentrations de méthane expectables pendant le processus de digestion peuvent être déterminées ex ante selon l'équation Buswell-Boyle après une analyse élémentaire du substrat ou en estimant le contenu de glucides, protéines et graisses dans le substrat. Selon VDI 4630 15, les glucides peuvent conduire à une production théorique de biogaz de 750 L kg-1 VSS (50% CH4 et 50% CO2), protéines à 800 L kg-1 VSS (72% CH4 et 28 % CO2), et les graisses à 1 390 L kg -1 VSS (60% CH4 et 40% CO2).
En outre, la formation et la dégradation ultérieure possible des VFA et des acides phényl ont été surveillées. Le processus de dégradation peut être évalué en analysant les concentrations de VFA (p. ex. acétate, propionate) à différents moments. L'accumulation d'acides gras à chaîne courte comme l'acétate et/ou le propionate peut indiquer des perturbations dans la composition de la communauté méthanogénique et une surcharge globale du réacteur. Cependant, une cascade de dégradation microbienne bien équilibrée peut même faire face à des concentrations très élevées de VFA et d'acétate9. En outre, le rapport acétate / propionate pourrait fournir des informations sur l'état global du réacteur16. Cependant, il existe de nombreux paramètres adaptés à la surveillance des processus qui doivent être sélectionnés selon les hypothèses expérimentales proposées. Dans le présent exemple, les variables cibles étaient les concentrations d'acide phényl (figure6).

Sur terre, l'oxygène moléculaire en concentrations notables est disponible dans les zones ayant un contact direct avec l'atmosphère ou en présence de phototrophes oxygétiques. Les environnements dans lesquels l'oxygène est absent sont appelés anaérobies. Cependant, la conversion d'énergie est toujours possible dans des conditions anaérobies par l'intermédiaire de deux processus métaboliques différents, la fermentation et la respiration anaérobie1.
Tandis que les organismes subissant la respiration aérobie utilisent l'oxygène comme accepteur d'électrons terminal, la respiration anaérobie exige des accepteurs alternatifs d'électrons comme le nitrate ou le sulfate2. Dans la soi-disant « tour d'électrons », les couples redox sont organisés en fonction de leur potentiel redox, avec les plus négatifs situés au sommet (donneurs d'électrons) et les agents d'oxydation les plus forts avec un potentiel redox positif au fond (accepteurs d'électrons). Le transfert d'électrons entre les donneurs et les accepteurs conduit à la conservation de l'énergie via la soi-disant chaîne respiratoire et les électrons peuvent être capturés par les accepteurs d'électrons - pour rester dans l'image - dans différents étages de la tour. Ainsi, plus la chute des électrons à travers la tour d'électrons est élevée, plus l'énergie peut être conservée par la réaction respective. Par conséquent, la respiration est également possible dans les habitats anaérobies, par exemple, avec des paires de redox, y compris NO3-/NO2-, acide fumarique / acide succinique, SO32-/H2S, S '/H2S, Mn(IV)/Mn(II , Fe(III)/Fe(II)2,3. Tout d'abord, l'énergie résultante est conservée comme potentiel membranaire, qui est ensuite utilisé par la phosphorylation de transport électronique pour la synthèse de l'adénosine-triphosphate (ATP) par des ATP-synthases membranaires. Contrairement à la respiration aérobie, la quantité d'énergie qui peut être conservée par la respiration anaérobie peut être considérablement réduite; cependant, la production d'énergie de la plupart des respirations anaérobies est encore plus élevée par rapport à la fermentation, une voie de conservation de l'énergie anaérobie dans les habitats dépourvus d'oxygène et d'autres accepteurs d'électrons terminaux2.
Pendant la fermentation, les substrats organiques riches en énergie sont dégradés en divers produits de fermentation qui définissent souvent le nom du processus global, par exemple, la fermentation alcoolique. Contrairement aux processus respiratoires, la production d'ATP pendant la fermentation se limite à la phosphorylation au niveau du substrat au cours de laquelle un groupe de phosphate est transféré à l'adénosine-di-phosphate (ADP) à partir d'un substrat phosphorylé riche en énergie2. Les micro-organismes de fermentation jouent un rôle central dans la dégradation anaérobie de la matière organique, car ils jouent un rôle clé dans la dégradation du substrat. Les produits de fermentation primaire, comme les acides organiques, les alcools, le CO2, et H2, peuvent ensuite être utilisés par les micro-organismes de fermentation secondaire pour produire de l'acide acétique, CO2, et H2. Les exemples pour les produits de fermentation incluent l'acide lactique, divers acides gras volatils (formic-, acétique-, propionic-, butyric-, acide valeric), n-butanol, 2,3-butandiol, acétone, et éthanol.
La culture de micro-organismes dans des conditions strictement anaérobies nécessite des méthodes et des équipements complètement différents par rapport à la culture d'organismes aérobies. Alors que les organismes tolérants à l'oxygène sont souvent cultivés sur des plats d'agar, ce que l'on appelle les cultures de surface, c'est - à quelques exceptions près - à peine possible pour les micro-organismes strictement anaérobies. Par conséquent, les cultures d'enrichissement des micro-organismes strictement anaérobies sont principalement établies dans les médias liquides appliquant des récipients de culture scellés avec le septa gaz-serré qui assurent une atmosphère sans oxygène de tête4,6, 7.
La description actuelle du protocole fournira des méthodes de culture appropriées pour les microorganismes cibles d'une population mixte dérivée d'une usine de biogaz anaérobie. L'isolement et la culture de cultures pures est encore plus difficile, mais ne fait pas partie de ce travail.
Ici, nous montrons la procédure pour cultiver une communauté microbienne anaérobie basée sur une étude concernant la formation d'acides phényl pendant la digestion anaérobie des substrats protéinés8. La communauté microbienne s'est composée des membres des quatre phases de la digestion anaérobie : hydrolyse, acidogenèse, acétogenèse, et méthanogenèse. Un milieu minéral de sel complété avec une source de carbone, redox-indicateur, vitamine et solution d'oligo-éléments, et agent de réduction a été appliqué9. Le milieu a été modifié avec les substrats respectifs de précurseur d'acide phényl protéiné8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:703px;" width="701">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">culture flasks (120 mL, N20)</td>
			<td style="width:187px;">Ochs, Germany</td>
			<td align="right" style="width:123px;">102046</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">buty rubber septa (N20)</td>
			<td style="width:187px;">Ochs, Germany</td>
			<td align="right" style="width:123px;">102049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">aluminium caps (N20)</td>
			<td style="width:187px;">Ochs, Germany</td>
			<td align="right" style="width:123px;">102050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">N2 gas</td>
			<td style="width:187px;">Messer, Austria</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>purity 5.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">syringes + cannulae</td>
			<td style="width:187px;">various</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">crimper</td>
			<td style="width:187px;">Ochs, Germany</td>
			<td align="right" style="width:123px;">102051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">de-crimper</td>
			<td style="width:187px;">Ochs, Germany</td>
			<td align="right" style="width:123px;">102052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">GC2010</td>
			<td style="width:187px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Shin-carbon GC column</td>
			<td style="width:187px;">Restek</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">HPLC Prominence</td>
			<td style="width:187px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fast Fruit HPLC Column</td>
			<td style="width:187px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions

Contrairement aux organismes aérobies, les micro-organismes strictement anaérobies nécessitent l'absence d'oxygène et généralement un faible potentiel de redox pour initier la croissance. Comme l'oxygène est omniprésentdans l'air, le maintien des conditions O 2-libres pendant toutes les étapes de la culture est difficile, mais une condition préalable à la culture anaérobie. Le protocole présenté ici démontre la culture réussie d'une culture anaérobie mixte dérivée d'une usine de biogaz en utilisant une méthode simple et peu coûteuse. Une description précise de l'ensemble du processus de culturisation anoxique est donnée, y compris la préparation des médias, le remplissage des flacons de culture, la supplémentation avec l'indicateur redox et la réduction des agents pour fournir de faibles potentiels redox ainsi que l'échange de l'espace de tête pour garder médias exempts d'oxygène. En outre, un aperçu détaillé des flacons de sérum étanche au gaz aseptiquement inoculés (en utilisant des seringues et des aiguilles stériles) et des conditions d'incubation appropriées est fourni. Le présent protocole traite en outre de l'échantillonnage de gaz et de liquides pour des analyses ultérieures concernant la composition des gaz et les concentrations volatiles d'acides gras utilisant la chromatographie gazeuse (GC) et la chromatographie liquide à haute performance (HPLC), respectivement, et le le calcul du biogaz et du rendement du méthane compte tenu de la loi idéale sur le gaz.

Les flacons de culture ont été remplis avec le milieu dans des conditions anaérobies selon le protocole décrit ci-dessus, vérifiés pour la couleur appropriée (figure 1), et utilisés comme bioréacteurs miniatures de lot menant la digestion anaérobie. Ceux-ci ont été modifiés avec des substrats pouvant causer la formation de phényl-acide et incubés à l'aide de boues de digesteur anaérobie s'il s'agit d'inoculum (figure 2). Le tryptophane, la tyrosine et la phénylalanine, ainsi que l'extrait et la caséine de viande précurseurs protéinés complexes ont été appliqués en deux et trois concentrations différentes, respectivement. Des contrôles ont été préparés sans supplémentation supplémentaire de substrat. Différentes concentrations de substrat visant à la simulation de différentes étapes de la surcharge. Les flacons ont été incubés à 37 oC (mésophile) pendant 4 semaines.
La production et la composition du biogaz (H2, CH4, CO2) ont été surveillées régulièrement par chromatographie gazeuse (TCD GC)10 et évaluation de la pression de l'espace de tête. La figure 3 démontre les différences dans la production cumulative de méthane dérivée de la digestion des substrats appliqués en concentrations variées pendant 4 semaines d'incubation anaérobie. En outre, les méthanogènes ont été visualisés en irradiant la coenzyme F420, un porteur d'électrons dans la méthanogénèse, présentant une fluorescence bleu-vert avec un maximum d'absorption à 420 nm (Figure 4).
Parallèlement à l'analyse du gaz, les échantillons de mesures de la concentration de VFA et d'acide phényl par l'intermédiaire du HPLC11 ont été retirés et stockés congelés jusqu'à un traitement ultérieur. La figure 5 montre l'effet des différentes étapes de surcharge, comme en témoigne une accumulation d'échantillons surchargés et représentés pour l'acétate. La figure 6 illustre la dynamique des concentrations d'acétate de phényle pendant la période d'incubation.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60155/60155fig1.jpg"> Figure 1 : Indicateur Redox. Le potentiel correct de redox dans les flacons de culture peut être commandé en ajoutant un indicateur de redox. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60155/60155fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60155/60155fig2.jpg"> Figure 2 : Bioréacteurs à lots miniatures. Bioréacteurs miniatures en lots préparés dans des flacons de culture de 120 ml pour des expériences de digestion anaérobie. Les flacons ont été remplis avec le milieu et inoculés avec les boues diluées de digesteur. Les réacteurs étaient scellés au gaz avec des bouchons en caoutchouc butyl et des bouchons en aluminium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60155/60155fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60155/60155fig3.jpg"> Figure 3 : Production de méthane. Production cumulative de méthane pendant 28 jours d'incubation mésophile à partir de réacteurs reflétant différentes conditions de surcharge (faible, moyenne, élevée). Cont: contrôle; Tryp: tryptophane; Tyr: tyrosine; Phérène: phénylalanine; ME: extrait de viande; Cas: caséine. Il s'agit d'une figure modifiée provenant d'une étude antérieure8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60155/60155fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60155/60155fig4.jpg"> Figure 4 : Fluorescing methanogens. Les méthanogènes émettent une lumière bleuâtre lorsqu'ils sont excités par la lumière UV. Ici, les méthanogènes sont fixés aux particules végétales (vert clair). Des échantillons ont été prélevés dans un réacteur à lots, dilués pour microscopie, et immédiatement analysés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60155/60155fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60155/60155fig5.jpg"> Figure 5 : Concentration d'acétate. Concentration d'acétate pendant 28 jours d'incubation mésophile dans les réacteurs reflétant différentes conditions de surcharge (faible, moyenne, élevée). Cont: contrôle; Tryp: tryptophane; Tyr: tyrosine; Phérène: phénylalanine; ME: extrait de viande; Cas: caséine. Il s'agit d'une figure modifiée provenant d'une étude antérieure8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60155/60155fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60155/60155fig6.jpg"> Figure 6 : Concentration de phénylactate. Concentration de phénylactate pendant 28 jours d'incubation mésophile dans les réacteurs reflétant différentes conditions de surcharge (faible, moyenne, élevée). Cont: contrôle; Tryp: tryptophane; Tyr: tyrosine; Phérène: phénylalanine; ME: extrait de viande; Cas: caséine. Il s'agit d'une figure modifiée provenant d'une étude antérieure8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60155/60155fig6large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60155/60155fig7.jpg"> Figure 7 : Réaction de la résazurine. La résine de couleur bleue subit une réduction irréversible de la résorufine (rose) et une autre réduction réversible à la dihydrorésorufine incolore selon Uzarski et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60155/60155fig7large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cyanocobalamine</td>
			<td>0,050 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>4-aminobenzoic acide</td>
			<td>0,050 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-biotine</td>
			<td>0,010 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acide nicotinique</td>
			<td>0,100 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pyridoxine</td>
			<td>0,250 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Acide D-pantothénique</td>
			<td>0,025 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>HCl de chlorure de thiaminium</td>
			<td>0,18 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>eau</td>
			<td>1000 ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Solution de vitamine.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>25% (w/v) HCl</td>
			<td>10,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>FeCl2 x 4 H2O</td>
			<td>1,50 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZnCl2
</td>
			<td>0,070 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2 x 4 H2O</td>
			<td>0,100 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>H3BO3
</td>
			<td>0,006 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CoCl2 x 6 H2O</td>
			<td>0,190 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CuCl2 x 2 H2O</td>
			<td>0,002 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NiCl2 x 6 H2O</td>
			<td>0,024 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2MoO4 x 2 H2O</td>
			<td>0,036 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>eau</td>
			<td>990,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Recommandation de préparation</td>
			<td>Ajouter le HCl etdissoudre FeCl 2, ajouter 100 ml d'eau distillée, dissoudre les autres ingrédients et faire jusqu'à 1000 ml.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Solution d'élément de trace.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>1,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 x 6 H2O</td>
			<td>0,4 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>0,2 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>0,5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2 x 2 H2O</td>
			<td>0,15 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-cystéine</td>
			<td>0,5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>extrait</td>
			<td>1,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution Resazurin</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution de vitamine</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution d'élément de trace</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>eau</td>
			<td>1000 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ph</td>
			<td>7.2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : Milieu de sel minimal.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>variable</td>
			<td>unité</td>
			<td>description</td>
		</tr>
<tr>
<td>tY
</td>
			<td>[d]</td>
			<td>Délai de mesure</td>
		</tr>
<tr>
<td>tX
</td>
			<td>[d]</td>
			<td>Délai de mesure précédente</td>
		</tr>
<tr>
<td>pM
</td>
			<td>[mbar]</td>
			<td>Surpression mesurée à tY
</td>
		</tr>
<tr>
<td>pA
</td>
			<td>[mbar]</td>
			<td>Pression ambiante à tY
</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAX
</td>
			<td>[mbar]</td>
			<td>Pression ambiante à tX
</td>
		</tr>
<tr>
<td>pS
</td>
			<td>[mbar]</td>
			<td>Pression standard, 1013,25 mbar acc. DIN 1343</td>
		</tr>
<tr>
<td>TI
</td>
			<td>[K]</td>
			<td>Température d'incubation</td>
		</tr>
<tr>
<td>TS (T)
</td>
			<td>[K]</td>
			<td>Température standard, 273,15 K (correspond à 0 o C) acc. DIN 1343</td>
		</tr>
<tr>
<td>VH
</td>
			<td>[ml]</td>
			<td>Volume d'espace de tête à tY
</td>
		</tr>
<tr>
<td>VHX
</td>
			<td>[ml]</td>
			<td>Volume d'espace de tête à tX
</td>
		</tr>
<tr>
<td>CH4%
</td>
			<td>[vol%]</td>
			<td>Concentration de méthane selon la mesure du GC à tY
</td>
		</tr>
<tr>
<td>CH4%X
</td>
			<td>[vol%]</td>
			<td>Concentration de méthane selon la mesure du GC à tX
</td>
		</tr>
<tr>
<td>VCH4T
</td>
			<td>[Nml]</td>
			<td>Quantité totale de méthane dans la bouteille de sérum à tY
</td>
		</tr>
<tr>
<td>VCH4R
</td>
			<td>[Nml]</td>
			<td>Quantité résiduelle de méthane dans l'espace de tête à tX
</td>
		</tr>
<tr>
<td>VCH4N
</td>
			<td>[Nml]</td>
			<td>Méthane nouvellement produit de tX à tY
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 4 : Description des variables de l'équation 1 à 3.

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Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions

Comme les organismes anaérobies obligatoires sont incapables de croître lors de l'exposition à l'oxygène, l'utilisation de techniques de culture anaérobie est indispensable. Ici, nous démontrons une méthode simple et efficace pour cultiver une culture mélangée dérivée d'une usine de biogaz de la préparation des médias à la quantification des gaz et des acides gras volatils.

Préparation moyenne pour la culture de micro-organismes dans des conditions strictement anaérobies/anoxiques

In contrast to aerobic organisms, strictly anaerobic microorganisms require the absence of oxygen and usually a low redox potential to initiate growth. As ...

Contrairement aux organismes aérobies, les micro-organismes strictement anaérobies nécessitent l’absence d’oxygène. Comme l’oxygène est omniprésent dans l’air, le maintien de conditions sans oxygène pendant la culture est une condition préalable à la culture anaérobie. La technique appliquée représente une méthode simple et peu coûteuse pour fournir des conditions anoxiques pour cultiver une population microbienne mixte dans la culture liquide.Cette technique peut également être appliquée pour la culture de cultures pures. Cependant, pour les micro-organismes très sensibles à l’oxygène, cette procédure pourrait ne pas être applicable. Commencez par peser les ingrédients moyens dans un flacon approprié et dissolvez-les avec un demi-volume d’eau distillée.Ensuite, ajoutez millilitre d’indicateur REDOX, suivi de vitamines dans la solution d’élément trace. Ajustez le pH en fonction des besoins de l’organisme, et porter le volume final à 1 litre avec de l’eau distillée. La couleur de l’indicateur REDOX dépend du pH et peut nécessiter un certain temps d’ajustement.Remplissez les flacons de sérum de 120 millilitres de 50 millilitres de milieu, puis incubez-les dans un bain d’eau de 100 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes, afin de réduire la solubilité de l’oxygène dans la phase liquide. Rincer l’espace de la tête avec de l’azote. Prenez soin de la ventilation appropriée de la pièce lorsque vous travaillez avec de l’azote.Fermez les flacons avec du septa en caoutchouc butyle et fixez les bouchons d’aluminium. Ensuite, ajoutez 0,1 millilitres d’agent réducteur à chaque flacon, afin de réduire davantage le potentiel REDOX. Et autoclave les flacons pendant 20 minutes à 121 degrés Celsius.Un autoclave certifié pour la stérilisation des navires fermés doit être utilisé lors de l’application de ce protocole. Dans le cas contraire, la surpression dérivée de l’augmentation de la température pourrait provoquer l’explosion des flacons sériques. Pour préparer l’inoculum à partir d’un digesteur anaérobie, ajouter 400 millilitres d’eau distillée à un flacon et porter à ébullition.Refroidissez-le jusqu’à environ 30 degrés Celsius tout en rinçant de façon permanente l’espace de la tête avec de l’azote. Ajouter environ 100 grammes de boues, dérivées d’un digesteur anaérobie, en s’assurant d’enregistrer la masse exacte de la boue pour déterminer la dilution. Échangez l’espace de la tête du flacon avec de l’azote et fermez-le avec un septum en caoutchouc butyle.Agiter le flacon pendant 30 minutes à 120 rPM. Laissez sédimenter les particules de boue plus grosses, puis utilisez une seringue et une canule pour enlever 5 millilitres d’inoculum et injectez-les dans un flacon de sérum préparé précédemment. Incuber le flacon de sérum inoculé à une température appropriée pour l’expérience, en s’assurant de drainer la pression sur causée par l’augmentation de la température, environ 15 à 30 minutes après le début de l’incubation.Pour évaluer la production et la composition du biogaz pendant la période d’incubation, enregistrez la pression atmosphérique actuelle et préparez un manomètre pour évaluer la pression à l’intérieur du flacon. Secouez les flacons et retirez 1 millilitre de gaz de l’espace de la tête à l’aide de la seringue et de la canule. Mesurer la concentration d’hydrogène, d’oxygène, de méthane et de dioxyde de carbone à l’aide de la chromatographie gazeuse.Utilisez 1 millilitre de liquide de la fiole pour surveiller les concentrations de tous les acides gras grands, selon les instructions manuscrites, et égoutter les flacons sur la pression après l’avoir retourné à la température appropriée. Ce protocole a été utilisé pour créer des bioréacteurs miniatures effectuant des digestions anaérobies. Tryptophane, tyrosine, phénylalanine, extrait de viande et caséine ont été ajoutés à 3 concentrations différentes, et la production de méthane a été surveillée sur une période d’incubation de 28 jours.Les méthanogènes ont été visualisés en rayonnant la co-enzyme F420, qui est un porteur d’électrons dans la méthanogenèse, et présente une fluorescence bleu-vert avec un maximum d’absorption à 420 nanomètres. Parallèlement à l’analyse du gaz, des échantillons ont été analysés pour les concentrations volatiles d’acides gras et d’acides phényles pendant la période d’incubation. Les méthodes biologiques moléculaires ciblant l’abondance de micro-organismes spécifiques et/ou la composition de la communauté microbienne, à un certain moment de l’expérience, peuvent être appliquées à l’aide de la procédure décrite.

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