Name: medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions
Uploaded: 2019-08-15T15:00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions at JoVE.com

Denna forskning finansierades av österrikiska vetenskaps fonden (FWF): projektnummer P 29360 och P 29143. Publikationen stöddes av Publikationsfonds der Universität Innsbruck. Vi erkänner starkt EIG.

1. beredning av medel
<ol><li>Förbered redoxindikatorns stamlösning (0,1 g resazurin/100 mL vattenlösning).</li>
	<li>Bered vitamin lösning (tabell 1).</li>
	<li>Förbered spår elementets lösning (tabell 2). Notera: beställa av tillägget är viktigt; Se tabell 2 och respektive protokoll.</li>
	<li>Förbered reducerande medel stamlösning (60 g na2S/L vattenlösning).</li>
	<li>Väga medelstora ingredienser (mineralsalt medium, tabell 3) i en lämplig kolv (t. ex. 1 L skruvlock Lab kolv). Observera: beroende på den experimentella installationen kan det vara nödvändigt att lägga till en separat kol källa.</li>
	<li>Tillsätt halva volymen destillerat vatten (tabell 3) och lös upp ingredienserna.</li>
	<li>Tillsätt 1 mL av redox-indikatorlösningen enligt tabell 3.</li>
	<li>Tillsätt vitamin-och spårelement lösning enligt tabell 3.</li>
	<li>Justera pH-värdet enligt medel-/organismens krav i tabell 3. Obs: färg på redox indikatorn är pH-beroende och kan kräva lite tid att justera.</li>
	<li>Ta med destillerat vatten till en slutlig volym på 1 liter. Anmärkning: vitamin-och spårelement lösningar kan också tillsättas efter autoklavering genom aseptiskt tillsats av filtersteriliserad alikvot (utspädda lösningar, filter porstorlek < 0,2 μm) till tidigare slutna och autoklaverade serum flaskor. Detta tillvägagångssätt har dock en förhöjd risk för kontaminering.</li>
</ol>2. fyllning av odlingsflaskor
<ol><li>Rengör och torka 120 mL av serum kolvar. Obs: serum kolvar finns i olika volym kapaciteter (t. ex. 20, 60, 120, 250 mL).</li>
	<li>Grundligt ren och torr butylgummisepta.</li>
	<li>Väg in ytterligare medelstora komponenter (t. ex. substrat för fenylsyriprekursorer) i odlings kolvar. Obs: ytterligare komponenter beror på experimentell installation och hypotes.</li>
	<li>Fyll i serum kolvar med 50 mL medium.</li>
</ol>3. reduktion/avlägsnande av syre i vätskefasen
<ol><li>Förbered en ~ 100 ° C vattenbad.</li>
	<li>Ställ fyllda serum flaskor i vattenbadet och inkubera i ca. 20-30 min för att reducera lösligheten hos O2 i vätskefasen.</li>
	<li>Spola headspace omedelbart med N2 gas eller alternativt med andra gas-eller gasblandningar som n2/Co2. FÖRSIKTIGHET: ta hand om lämplig ventilation i rummet.</li>
	<li>Stäng flaskarna med butylgummisepta och fixera med aluminiumkapsyler. Obs: gummi septa kan ofta passa bättre på halsen av kolven genom att tillsätta en droppe vatten/medium under borrning i.</li>
	<li>Tillsätt 0,1 mL reduktionsmedel (stamlösning) till varje kolv fylld med 50 mL medium för att ytterligare reducera redoxpotentialen (0,1 mL reduktionsmedel per 50 mL medium).</li>
	<li>Autoklav i 20 min vid 121 ° c. FÖRSIKTIGHET: en autoklav certifierad för sterilisering av slutna fartyg måste användas. Annars kan övertryck som härrör från temperaturhöjning orsaka att serum kolvar exploderar.</li>
</ol>4. inokulering av mediet
<ol><li>Förbered inokulum från anaerob rötkammare.<ol>
<li>Tillsätt 400 mL destillerat vatten i en kolv och koka upp det.</li>
		<li>Kyla ner den (< 30 ° c) medan du permanent spolar headspace med N2.</li>
		<li>Tillsätt ca 100 g slam från en anaerob rötkammare. Obs: Undvik överdriven kontakt med slam med syre.</li>
		<li>Anteckna den exakta massan av tillsatt slam för exakt bestämning av utspädning.</li>
		<li>Växla Flask headspace med N2 och Stäng den med en butylgummiseptum.</li>
		<li>Skaka kolven i 30 min vid 120 RPM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ta bort 5 ml inokulum med hjälp av spruta + kanyl och injicera det i beredda serum flaskor enligt beskrivningen i steg 1-3.</li>
</ol>5. inkubering, provtagning och analys
<ol><li>Inkubera inokulerade serum flaskor vid en temperatur som är lämplig för respektive experiment. Obs: inkubations temperaturen är beroende av experimentell inställning och använt inoculum.<ol>
<li>Dränera övertryck till följd av temperaturhöjningen med hjälp av spruta + kanyl, när vätskan i serum kolvar har Ekat till inkubations temperaturen (ca 15 – 30 min, beroende på inkubations temperatur). Försiktighet: beroende på tillämpad substrat, dess koncentration, temperatur, inkubationstid, inokulum typ och koncentration, övertryck i kolvar kan stiga med upp till > 2 bar tryck och kan orsaka serum flaks att explodera. Det är därför obligatoriskt att övervaka övertrycket med hjälp av en manometer och därefter dränera övertryck med en kanyl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utvärdera biogasproduktion och-sammansättning under inkubationstiden. Obs: inkubationstiden kan spänna över några dagar till flera veckor.<ol>
<li>Registrera aktuellt atmosfärstryck.</li>
		<li>Bered en manometer och utvärdera trycket i de kolvar som härrör från mikrobiell aktivitet.</li>
		<li>Skaka kolvar.</li>
		<li>Ta bort 1 mL headspace-gas med hjälp av en spruta + kanyl och mät koncentrationerna av H2, O2, CH4och/eller co2 via gaskromatografi. Anmärkning: för kvalificering och kvantifiering av H2, O2, CH4och co2 användes en gaskromatograf med användning av drifttemperaturer på 160 ° c (kolonnugn), 100 ° c (injektor) och 180 ° c (värmeledningsförmåga, TCD ). N2 användes som bärgas. För mer information, se tidigare studier10.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Övervaka koncentrationerna av flyktiga fettsyror (VFA) och fenylsyror. För VFA och fenylsyra analys, Använd ett HPLC-system utrustat med en UV-detektor (vid 220 nm) som löper med 5 mM H2so4 som en mobil fas. För metodens detaljer och ytterligare information om PROVFÖRVARING hänvisas till tidigare studier11. Anmärkning: analysen av VFA är exemplarisk för många andra fysikalisk-kemiska analyser eller mikroskopiska utvärderingar. Dessutom kan molekylära biologiska metoder som riktar sig mot förekomsten av specifika mikroorganismer och/eller sammansättningen av den mikrobiella gemenskapen vid en viss punkt i experimentet appliceras med hjälp av den beskrivna proceduren.<ol>
<li>Ta bort 1 mL vätska med spruta + kanyl. Anmärkning: prover kan frysas (-20 ° c) omedelbart efter uttag och analyseras i slutet av experimentet11.</li>
		<li>Centrifugera vid 15000 – 20000 x g och passera genom 0,2 μm RC (regenererad cellulosa) filter.</li>
		<li>Injicera 5-20 μL på ett HPLC-system och analysera VFA-sammansättningen och koncentrationen av fenylsyror.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dränera Flask övertryck med en kanyl. Anmärkning: när du har fastställt tryck-och gas sammansättningen samt tagit ett nödvändigt prov ska du placera odlings kolven tillbaka på respektive temperatur och dränera inte övertryck innan vätskan har uppnått inkubations temperaturen.</li>
	<li>Beräkna biogas-och metanproduktion VCH4N med tanke på den idealiska gas lag med hjälp av ekvation 1-3. Se även tabell 4. Ekvation 1:<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60155/60155eq1v2.jpg"> Whereby Ekvation 2:<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60155/60155eq2v2.jpg"> Och Ekvation 3:<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60155/60155eq3v3.jpg"> Anmärkning: för beräkningen av den totala biogasproduktionen måste mängden4% och4% X i ekvation 2 och 3 ställas in på 100. NmL: normaliserad gas volym under standardiserade förhållanden (0 ° c, 1 ATM), under vilken molar gasvolymen är 22,414 NmL/mmol.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wiebe, W. J., Pomeroy, L. R., Wiegert, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+Respiration+and+Fermentation.">Anaerobic Respiration and Fermentation.</a> The Ecology of a Salt Marsh. , 137-159 (1981).</li><li>Kim, B. H., Gadd, G. M., Kim, B. H., Gadd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+fermentation.">Anaerobic fermentation.</a> Bacterial physiology and metabolism. , 252-297 (2008).</li><li>Stolz, J. F., Oremland, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+respiration+of+arsenic+and+selenium).">Bacterial respiration of arsenic and selenium).</a> FEMS Microbiology Reviews. 23 (5), 615-627 (1999).</li><li>Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogenotrophic+Methanogenesis+and+Autotrophic+Growth+of+Methanosarcina+thermophila.">Hydrogenotrophic Methanogenesis and Autotrophic Growth of Methanosarcina thermophila.</a> Archaea. 2018 (5), 1-7 (2018).</li><li>Mutschlechner, M., Praeg, N., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecological+importance+of+grazing+to+methane+fluxes+and+engaged+microbial+communities+in+alpine+forest+soils.">The ecological importance of grazing to methane fluxes and engaged microbial communities in alpine forest soils.</a> FEMS Microbiology Ecology. , (2018).</li><li>Prem, E. M., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livestock+grazing+on+alpine+soils+causes+changes+in+abiotic+and+biotic+soil+properties+and+thus+in+abundance+and+activity+of+microorganisms+engaged+in+the+methane+cycle.">Livestock grazing on alpine soils causes changes in abiotic and biotic soil properties and thus in abundance and activity of microorganisms engaged in the methane cycle.</a> European Journal of Soil Biology. 62, 22-29 (2014).</li><li>Praeg, N., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+fertilisation,+temperature+and+water+content+on+microbial+properties+and+methane+production+and+methane+oxidation+in+subalpine+soils.">Effects of fertilisation, temperature and water content on microbial properties and methane production and methane oxidation in subalpine soils.</a> European Journal of Soil Biology. 65, 96-106 (2014).</li><li>Wagner, A. O., Prem, E. M., Markt, R., Kaufmann, R., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+phenylacetic+acid+and+phenylpropionic+acid+under+different+overload+conditions+during+mesophilic+and+thermophilic+anaerobic+digestion.">Formation of phenylacetic acid and phenylpropionic acid under different overload conditions during mesophilic and thermophilic anaerobic digestion.</a> Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 359 (2019).</li><li>Lins, P., Malin, C., Wagner, A. O., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+accumulated+volatile+fatty+acids+by+an+acetate-degrading+enrichment+culture.">Reduction of accumulated volatile fatty acids by an acetate-degrading enrichment culture.</a> FEMS Microbiology Ecology. 71 (3), 469-478 (2010).</li><li>Wagner, A. O., Hohlbrugger, P., Lins, P., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+nitrogen+sources+on+the+biogas+production+-+a+lab-scale+investigation.">Effects of different nitrogen sources on the biogas production - a lab-scale investigation.</a> Microbiological research. 167 (10), 630-636 (2012).</li><li>Wagner, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation,+preservation,+and+storage+for+volatile+fatty+acid+quantification+in+biogas+plants.">Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants.</a> Engineering in Life Sciences. 17 (2), 132-139 (2017).</li><li>Uzarski, J. S., DiVito, M. D., Wertheim, J. A., Miller, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+design+considerations+for+the+resazurin+reduction+assay+to+noninvasively+quantify+cell+expansion+within+perfused+extracellular+matrix+scaffolds.">Essential design considerations for the resazurin reduction assay to noninvasively quantify cell expansion within perfused extracellular matrix scaffolds.</a> Biomaterials. 129, 163-175 (2017).</li><li>Costilow, R. N., Breznak, J. A., Marzluf, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+Factors+in+Growth.">Physicochemical Factors in Growth.</a> Methods for General and Molecular Microbiology. , 309-329 (2007).</li><li>Le Mer, J., Roger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+oxidation,+emission+and+consumption+of+methane+by+soils:+a+review.">Production, oxidation, emission and consumption of methane by soils: a review.</a> European Journal of Soil Biology. 37 (1), 25-50 (2001).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verein+deutscher+Ingenieure+VDI+4630:+Fermentation+of+organic+material.">Verein deutscher Ingenieure VDI 4630: Fermentation of organic material.</a> VDI Richtlinien. , (2006).</li><li>Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+acetate:+Propionate+ratios+on+the+methanogenic+community+during+thermophilic+anaerobic+digestion+in+batch+experiments.">Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments.</a> Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Det viktigaste och mest kritiska steget i odling av anaeroba mikroorganismer är att säkerställa syrefria förhållanden i odlingsmedier och kolvar "headspace". En indikator som resazurin kan användas för att indirekt kontrollera korrekt anaerob fyllning av kolvar. Resazurin är en vanligt förekommande redoxfärg eftersom det är billigt, giftfri, och redan effektiv i låga doser och korta inkubationstider 12. Vid inkorporerad i media genomgår den blåfärgade resazurin först ett oåterkalleligt reduktions steg till resorufin, vilket är rosa vid neutrala pH-värden. Denna första reaktion kan inträffa när mediet värms 13. Därefter reduceras resorufin till färglös dihydroresorufin i en reversibel sekundär reaktion (figur 7)12. Resorufin/dihydroresorufin redox-systemet blir helt färglös vid en standardiserad oxidations reduktions potential på ca Eh =-110 MV och blir rosa över en redoxpotential på-51 MV 13.
För att ytterligare minska den redoxpotential, till exempel, för att underlätta tillväxten av metanbildande mikroorganismer kända för att kräva mindre än-200 MV14, en na2S lösning kan tillsättas. Alternativt, cystein-HCl, natrium-thioglycolate, eller natriumdithionite används ofta. Men som minskar agenten är lämpligt att använda beror på respektive experimentella installationen och kan kräva särskild uppmärksamhet. Till exempel, natrium thioglycolate behöver temperatur aktivering (t. ex., genom autoklavering).
En välbalanserad mikrobiell konsortium, bestående av olika släkten av bakterier och Archaea, och en effektivt arbetande anaerob nedbrytning kaskad kan ytterligare utvärderas genom att bestämma headspace gas sammansättningen i kulturen kolvar via gas Kromatografi. Vid hantering av föreningar som fenylsyror som härrör från olika prekursorer, är bedömningen av headspace ett snabbt sätt att kontrollera methanogenesis processen8. En headspace CH4 -koncentration på ca 50-60% i kontrollerna i slutet av inkubationstiden indikerar en lyckad användning av de applicerade näringsämnena och därmed en mineralisering av organiskt material under anaeroba förhållanden. Den teoretiska metanproduktionen och de uppsebara metankoncentrationerna under rötningsprocessen kan bestämmas i förväg enligt Buswell-Boyle-ekvationen efter elementär analys av substratet eller genom att uppskatta innehållet i kolhydrater, proteiner och fetter i underlaget. Enligt VDI 4630 15kan kolhydrater leda till en teoretisk biogasproduktion på 750 l kg-1 VSS (50% CH4 och 50% CO2), proteiner till 800 l kg-1 VSS (72% CH4 och 28% Co2) och fetter till 1 390 l kg -1- VSS (60% CH4 och 40% Co2).
Dessutom övervakades bildandet och eventuell efterföljande nedbrytning av VFAs och fenylsyror. Nedbrytningsprocessen kan utvärderas genom att analysera VFA-koncentrationerna (t. ex. acetat, propionat) vid olika tidpunkter. Ackumulering av kortkedjiga fettsyror som acetat och/eller propionat kan peka på störningar i den metanbildande gemenskapen sammansättning och till en total reaktor överbelastning. Emellertid, en väl avvägd mikrobiell nedbrytning kaskad kan även klara av mycket höga VFA och acetat koncentrationer9. Förutom, acetat/Propionate förhållandet kan ytterligare ge information om den totala reaktorn villkoret16. Det finns dock många parametrar som lämpar sig för processövervakning och som måste väljas enligt de föreslagna experimentella hypoteserna. I föreliggande exempel var målvariablerna fenylsyrikoncentrationer (figur 6).

På jorden molekyl syre i betydande koncentrationer finns i områden som har direkt kontakt med atmosfären eller i närvaro av syrerik phototrophs. Miljöer där syre är frånvarande kallas anaerob. Dock är energiomvandling fortfarande möjligt under anaeroba förhållanden via två olika metaboliska processer, jäsning och anaerob andning1.
Medan organismer som genomgår aerob andning använder syre som terminalelektronacceptor, kräver anaerob andning alternativa elektron acceptorer som nitrat eller sulfat2. I den så kallade "Electron Tower", redox par är organiserade enligt deras redoxpotential, med de mest negativa som ligger på toppen (elektron givare) och starkaste oxidationsmedel med positiva redoxpotential längst ner (elektron acceptorer). Elektron överföringen mellan givare och acceptorer leder till energisparande via den så kallade andningskedjan och elektroner kan fångas upp av elektron acceptorer-för att stanna i bilden-i olika våningar i tornet. Därmed, ju högre nedgången av elektroner genom elektron tornet, desto mer energi kan bevaras av respektive reaktion. Därför är andning också möjlig i anaeroba livsmiljöer, till exempel med redoxpar inklusive nr3-/No2-, fumarsyra/bärnstenssyra, så32-/h2s, s °/h2s, mn (IV)/mn (II ), Fe (III)/Fe (II)2,3. För det första är den resulterande energin bevaras som membran potential, som därefter används av elektrontransport fosforylering för adenosintrifosfat (ATP) syntes av membranbundna ATP-synthases. Till skillnad från aerob andning, kan mängden energi som kan bevaras genom anaerob andning minskas dramatiskt; emellertid, energiproduktionen av de flesta anaeroba respirationer är fortfarande högre jämfört med jäsning, en anaerob energibevarande väg i livsmiljöer som saknar syre och andra terminala elektron acceptorer2.
Under jäsning, energirika, organiska substrat bryts ned till olika fermenterings produkter som ofta definierar namnet på den övergripande processen, till exempel, alkoholjäsning. Till skillnad från andnings processer är ATP-generationen under jäsningen begränsad till fosforylering på substrat nivå under vilken en fosfatgrupp överförs till adenosindifosfat (ADP) från ett energirikt fosforylerat substrat2. Fermenterande mikroorganismer spelar en central roll i den anaeroba nedbrytningen av organiskt material eftersom de är nyckelspelare i substrat nedbrytning. De primära fermenterings produkterna, som organiska syror, alkoholer, CO2och h2, kan därefter användas av sekundära fermenterande mikroorganismer för att producera ättiksyra, Co2och h2. Exempel på fermenterings produkter är mjölksyra, olika flyktiga fettsyror (myrsyra-, ättiksyra-, propionsyra-, butyric-, valerisk), n-butanol, 2, 3-Butandiol, aceton och etanol.
Odling av mikroorganismer under strängt anaeroba förhållanden kräver helt olika metoder och utrustning jämfört med odling av aeroba organismer. Även syre-toleranta organismer odlas ofta på agar rätter, så kallade ytkulturer, detta är-med några få undantag-knappast möjligt för strikt anaeroba mikroorganismer. Därför är berikande kulturer av strängt anaeroba mikroorganismer huvudsakligen etablerade i flytande medier som tillämpar odlings fartyg förseglade med gas-tight septa som garanterar en syrefri headspace atmosfär4,6, 7.
Den nuvarande protokoll beskrivningen kommer att ge lämpliga odlingsmetoder för mål mikroorganismer av en blandad population som härrör från en anaerob biogas anläggning. Isolering och odling av rena kulturer är ännu mer utmanande men inte en del av detta arbete.
Här visar vi proceduren för odling av en anaerob mikrobiell gemenskap baserad på en studie om bildandet av fenylsyror vid rötning av proteanhaltiga substrat8. Den mikrobiella gemenskapen bestod av medlemmar från alla fyra faser av rötning: hydrolys, sur Genes, acetogenes och methanogenes. Ett mineralsalt medium kompletterat med en kolkälla, redox-indikator, vitamin-och spårelement lösning, och reduktionsmedel applicerades9. Mediet ändrades med respektive proteinhaltiga fenylsyriprekursor substrat8.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:703px;" width="701">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">culture flasks (120 mL, N20)</td>
			<td style="width:187px;">Ochs, Germany</td>
			<td align="right" style="width:123px;">102046</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">buty rubber septa (N20)</td>
			<td style="width:187px;">Ochs, Germany</td>
			<td align="right" style="width:123px;">102049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">aluminium caps (N20)</td>
			<td style="width:187px;">Ochs, Germany</td>
			<td align="right" style="width:123px;">102050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">N2 gas</td>
			<td style="width:187px;">Messer, Austria</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>purity 5.0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">syringes + cannulae</td>
			<td style="width:187px;">various</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">crimper</td>
			<td style="width:187px;">Ochs, Germany</td>
			<td align="right" style="width:123px;">102051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">de-crimper</td>
			<td style="width:187px;">Ochs, Germany</td>
			<td align="right" style="width:123px;">102052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">GC2010</td>
			<td style="width:187px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Shin-carbon GC column</td>
			<td style="width:187px;">Restek</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">HPLC Prominence</td>
			<td style="width:187px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fast Fruit HPLC Column</td>
			<td style="width:187px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

medium preparation for the cultivation of microorganisms under strictly anaerobic/anoxic conditions

I motsats till aeroba organismer, strikt anaeroba mikroorganismer kräver frånvaro av syre och oftast en låg redox potential att initiera tillväxt. Eftersom syre är allmänt förekommande i luften, behålla O2-fria förhållanden under alla odlings steg är utmanande men en förutsättning för anaerob odling. Det protokoll som presenteras här visar på en lyckad odling av en anaerob blandad kultur som härstammar från en biogasanläggning med en enkel och billig metod. En exakt beskrivning av hela anoxiska odlingsprocessen ges inklusive media beredning, fyllning av odlingsflaskor, tillskott med redox indikator och reducerande medel för att ge låga redoxpotentialer samt utbyte av headspace att hålla medier fria från syre. Dessutom ges en detaljerad översikt över aseptiskt inokulerande gas täta serum flaskor (med användning av sterila sprutor och nålar) och lämpliga inkubationsförhållanden. I detta protokoll behandlar man även gas-och vätske provtagning för efterföljande analyser avseende gassammansättning och flyktiga fett syrgaskoncentrationer med gaskromatografi (GC) och vätskekromatografi (HPLC) med hög prestanda respektive beräkning av biogas-och metanavkastning med tanke på den ideala gas lagstiftningen.

Odlingsflaskor fylldes med medium under anaeroba förhållanden enligt det protokoll som beskrivs ovan, kontrolleras för lämplig färg (figur 1), och används som miniatyr batch bioreaktorer som utför rötning. Dessa ändrades med substrat som potentiellt orsakar fenylsyras bildning och inkuberas med hjälp av anaerob rötslam som inokulum (figur 2). Tryptofan, tyrosin och fenylalanin, liksom det komplexa proteinhaltiga prekursorer köttextrakt och kasein tillämpades i två och tre olika koncentrationer, respektive. Kontroller bereddes utan ytterligare substrat tillskott. Olika substrat koncentrationer som syftar till simulering av olika stadier av överbelastning. Kolvar inkuberades vid 37 ° c (mesophilic) i 4 veckor.
Biogas produktion och-sammansättning (H2, CH4, Co2) övervakades regelbundet via gaskromatografi (GC TCD)10 och utvärdering av headspace-tryck. Figur 3 visar skillnader i den kumulativa metanproduktionen som härrör från nedbrytning av de applicerade substrat i varierande koncentrationer under 4 veckor av inaerob inkubering. Förutom, var methanogens visualiseras genom bestråling av coenzym F420, en elektron bärare i methanogenesis, uppvisar en blågrön fluorescens med en absorption maximum vid 420 nm (figur 4).
Parallellt med gasanalys drogs prover för mätningar av VFA-och fenylsyrekoncentrationer via HPLC11 ut och frystes upp tills vidare bearbetning. Figur 5 visar effekten av olika stadier av överbelastning som återspeglas av en ackumulering i mycket överbelastade prover exemplarily avbildas för acetat. Figur 6 visar dynamiken i koncentrationerna av fenylacetat under inkubationstiden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60155/60155fig1.jpg"> Bild 1: redoxindikator. Rätt redoxpotential i odlings kolvar kan styras genom att lägga till en redox-indikator. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60155/60155fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60155/60155fig2.jpg"> Figur 2: miniatyr parti bioreaktorer. Miniatyr parti bioreaktorer beredda i 120 mL odlingsflaskor för anaerob nedbrytning experiment. Flaskor fylldes med medel och inokulerades med utspädd rötslam. Reaktorerna var gas tätt förseglade med butylgummiproppar och aluminiumlock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60155/60155fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60155/60155fig3.jpg"> Figur 3: metanproduktion. Ackumulerad metanproduktion under 28 dagar av mesofil inkubation från reaktorer som återspeglar olika överbelastningsförhållanden (låg, medelhög, hög). CONT: kontroll; Tryp: tryptofan; Tyr: tyrosin; Phe: fenylalanin; MIG: köttextrakt; CAS: kasein. Detta är en modifierad siffra som härrör från en tidigare studie8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60155/60155fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60155/60155fig4.jpg"> Figur 4: fluorescera i metanogener. Methanogens avger ett blåaktig ljus när de är glada med UV-ljus. Här, methanogens är knutna till växt partiklar (ljusgrön). Proverna togs från en parti reaktor, späddes för mikroskopi, och omedelbart analyseras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60155/60155fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60155/60155fig5.jpg"> Figur 5: acetatkoncentration. Acetatkoncentrationen under 28 dagar av mesofil inkubering i reaktorer som återspeglar olika överbelastningsförhållanden (låg, medelhög, hög). CONT: kontroll; Tryp: tryptofan; Tyr: tyrosin; Phe: fenylalanin; MIG: köttextrakt; CAS: kasein. Detta är en modifierad siffra som härrör från en tidigare studie8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60155/60155fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60155/60155fig6.jpg"> Figur 6: Fenylacetatkoncentration. Fenylacetatkoncentration under 28 dagar av mesofil inkubering i reaktorer som återspeglar olika överbelastningsförhållanden (låg, medelhög, hög). CONT: kontroll; Tryp: tryptofan; Tyr: tyrosin; Phe: fenylalanin; MIG: köttextrakt; CAS: kasein. Detta är en modifierad siffra som härrör från en tidigare studie8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60155/60155fig6large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60155/60155fig7.jpg"> Figur 7: Resazurin-reaktion. Blå färgade resazurin genomgår en oåterkallelig reduktion till resorufin (rosa) och ytterligare reversibel reduktion till den färglös dihydroresorufin enligt Uzarski et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60155/60155fig7large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cyanocobalamin</td>
			<td>0,050 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>4-Aminobenzoic syra</td>
			<td>0,050 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-biotin</td>
			<td>0,010 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nikotinsyra</td>
			<td>0,100 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pyridoxin</td>
			<td>0,250 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-pantotensyra</td>
			<td>0,025 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiaminium klorid HCl</td>
			<td>0,18 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Destillerat vatten</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: vitamin lösning.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>25% (vikt/volym) HCl</td>
			<td>10,0 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FeCl2 x 4 H2O</td>
			<td>1,50 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZnCl2
</td>
			<td>0,070 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2 x 4 H2O</td>
			<td>0,100 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>H3bo3
</td>
			<td>0,006 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CoCl2 x 6 H2O</td>
			<td>0,190 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CuCl2 x 2 H2O</td>
			<td>0,002 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NiCl2 x 6 H2O</td>
			<td>0,024 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2Moo4 x 2 H2O</td>
			<td>0,036 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Destillerat vatten</td>
			<td>990,0 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Förberedelse rekommendation</td>
			<td>Tillsätt HCl och lös upp FeCl2, tillsätt 100 ml destillerat vatten, lös upp övriga ingredienser och gör upp till 1000 ml.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: lösning för spårelement.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>1,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 x 6 H2O</td>
			<td>0,4 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2Po4
</td>
			<td>0,2 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>0,5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2 x 2 H2O</td>
			<td>0,15 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-cystein</td>
			<td>0,5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Jästextrakt</td>
			<td>1,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Resazurin lösning</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vitamin lösning</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lösning för spårelement</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Destillerat vatten</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ph</td>
			<td>7,2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 3: minimalt salt medium.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Variabel</td>
			<td>Enhet</td>
			<td>Beskrivning</td>
		</tr>
<tr>
<td>tY
</td>
			<td>d</td>
			<td>Tidspunkt för mätningen</td>
		</tr>
<tr>
<td>tX
</td>
			<td>d</td>
			<td>Timepoint för föregående mätning</td>
		</tr>
<tr>
<td>(malm )
</td>
			<td>mbar</td>
			<td>Uppmätt övertryck vid tY
</td>
		</tr>
<tr>
<td>pen
</td>
			<td>mbar</td>
			<td>Omgivningstryck vid tY
</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAX
</td>
			<td>mbar</td>
			<td>Omgivningstryck vid tX
</td>
		</tr>
<tr>
<td>(Nacka)
</td>
			<td>mbar</td>
			<td>Standard tryck, 1013, 25 mbar ACC. DIN 1343</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tjag
</td>
			<td>K</td>
			<td>Inkubations temperatur</td>
		</tr>
<tr>
<td>()
</td>
			<td>K</td>
			<td>Standard temperatur, 273, 15 K (motsvarar 0 ° C) ACC. DIN 1343</td>
		</tr>
<tr>
<td>VH
</td>
			<td>ml</td>
			<td>Headspace-volym vid tY
</td>
		</tr>
<tr>
<td>VHX
</td>
			<td>ml</td>
			<td>Headspace-volym vid tX
</td>
		</tr>
<tr>
<td>CH4%
</td>
			<td>[VOL%]</td>
			<td>Metankoncentrationen enligt GC-mätning vid tY
</td>
		</tr>
<tr>
<td>CH4% X
</td>
			<td>[VOL%]</td>
			<td>Metankoncentrationen enligt GC-mätning vid tX
</td>
		</tr>
<tr>
<td>VCH4T
</td>
			<td>NML</td>
			<td>Totala metanmängden i serum flaskan vid tY
</td>
		</tr>
<tr>
<td>VCH4R
</td>
			<td>NML</td>
			<td>Restmetangas belopp i headspace vid tX
</td>
		</tr>
<tr>
<td>VCH4N
</td>
			<td>NML</td>
			<td>Nyproducerad metan från tX till tY
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 4: Beskrivning av variablerna i ekvation 1-3.

Watch this Scientific Journal Video about Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions at JoVE.com

Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions

Eftersom obligate anaeroba organismer inte kan växa på syre exponering, användning av anaerob odlingstekniker är oumbärlig. Här visar vi en enkel och effektiv metod för att odla en blandad kultur som härstammar från en biogasanläggning från media beredning till gas och flyktiga fettsyror kvantifiering.

Medellång förberedelse för odling av mikroorganismer under strängt anaeroba/syrefria förhållanden

In contrast to aerobic organisms, strictly anaerobic microorganisms require the absence of oxygen and usually a low redox potential to initiate growth. As ...

I motsats till aeroba organismer kräver strikt anaeroba mikroorganismer frånvaro av syre. Eftersom syre är allestädes närvarande i luft, behålla syrefria förhållanden under odling är en förutseende för anaerobkulerande. Den tillämpade tekniken representerar en enkel och billig metod för att ge anoxiska förhållanden för att odla en blandad mikrobiell befolkning i flytande kultur.Denna teknik kan också tillämpas för odling av rena kulturer. För mycket syrekänsliga mikroorganismer kanske dock detta förfarande inte är tillämpligt. Börja med att väga medelstora ingredienser i en lämplig kolv, och lösa upp dem med halv volym destillerat vatten.Lägg sedan till milliliter av REDOX-indikator, följt av vitaminer i spårämneslösning. Justera pH enligt organismkrav, och föra den slutliga volymen till 1 liter med destillerat vatten. Färgen på REDOX-indikatorn är pH-beroende, och kan kräva lite tid att justera.Fyll 120 milliliter serum kolvar med 50 milliliter medium, sedan inkubera dem i en 100 graders Celsius vattenbad i 20 till 30 minuter, för att minska lösligheten av syret i vätskefasen. Spola huvudet utrymme med kväve. Ta hand om lämplig rumsventilation vid arbete med kväve.Stäng kolvarna med butylgummi septa, och fixera aluminiumlocken. Därefter lägger du till 0,1 milliliter reduktionsmedel till varje kolv, för att ytterligare minska REDOX-potentialen. Och autoklavera kolvarna i 20 minuter vid 121 grader Celsius.En autoklav certifierad för sterilisering av slutna kärl måste användas vid tillämpning av detta protokoll. Annars kan övertryck som härrör från temperaturökning orsaka att serumkolvar exploderar. För att förbereda inokulat från anaerob rötkammare, tillsätt 400 milliliter destillerat vatten till en kolv och koka upp den.Kyl ner den till cirka 30 grader Celsius medan permanent spola huvudet utrymme med kväve. Tillsätt cirka 100 gram slam, som härrör från en anaerob rötkammare, se till att journalera den exakta massan av slammet för bestämning av utspädning. Byt kolvens huvudutrymme med kväve, och stäng den med en butylgummiskilde.Skaka kolven i 30 minuter vid 120 RPM. Låt större slampartiklar sediment, använd sedan en spruta och kanyl för att avlägsna 5 milliliter inokulat och injicera den i en tidigare beredd serumkolv. Inkubera den inokulerade serumkolven vid en lämplig temperatur för försöket, se till att dränera övertrycket som orsakas av temperaturökningen, cirka 15 till 30 minuter efter inkubationens början.För att utvärdera biogasproduktion och sammansättning under inkubationstiden, registrera det aktuella atmosfärstrycket och förbereda en manometer för att utvärdera trycket inom kolven. Skaka kolvarna och ta bort 1 milliliter huvudutrymmesgas med hjälp av sprutan och kanylen. Mät väte-, syre-, metan- och koldioxidkoncentrationen med hjälp av gaskromatografi.Använd 1 milliliter vätska från kolven för att övervaka koncentrationerna av alla höga fettsyror, enligt manuskriptriktningar, och dränera kolvarna över tryck efter att ha återfört den till lämplig temperatur. Detta protokoll användes för att skapa miniatyr bioreaktorer bedriver anaerob matsmältningar. Tryptofan, tyrosin, fenylalanin, köttextrakt och casein tillsattes vid 3 olika koncentrationer, och metanproduktionen övervakades under en 28 dagars inkubationstid.Methanogener visualiserades genom att utstråla co-enzymet F420, som är en elektronbärare i methanogenesis, och uppvisar en blågrön fluorescens med en absorptions maximum på 420 nanometer. Samtidiga med gas analys, prover analyserades för flyktiga fettsyra och fenylsyra koncentrationer under inkubationsperioden. Molekylärbiologiska metoder som riktar sig till överflödet av specifika mikroorganismer och/eller sammansättning av det mikrobiella samhället, vid en viss punkt av försöket, kan tillämpas med hjälp av det beskrivna förfarandet.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications

Framställning av Homogena MALDI Prover för kvantitativa Applications

This protocol demonstrates a simple sample preparation to reduce spatial heterogeneity in ion signals during matrix-assisted laser desorption/ionization ...

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Beredning och leverans av protein mikrokristaller i lipida kubiska fasen för Serial Femtosecond Kristallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Framställning av Giant vesiklar inkapslande mikrosfärer genom centrifugering av en vatten-i-olja-emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Hydrolys av en Ni-Schiff-Base Complex Använda betingelser som är lämpliga för Bibehållande av syralabil skydds Grupper

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Tallrik-baserade storskalig odling av Caenorhabditis elegans: provberedning för studie av metabola förändringar i Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Beredning av kloroplast sub fack från Arabidopsis för analys av Protein lokalisering av Immunoblotting eller proteomik

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

Proteomiska analys av mänskliga makrofag polarisering Under en låg syrehalt miljö

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Provberedning för probe electrospray jonisering Masspektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

Beredning av högkvalitativ fermenterad fisk produkt

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En provförberedande pipeline för mikrokritaler vid VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...