Name: measurement of chitinase activity in biological samples
Uploaded: 2019-08-22T15:00:00
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Cette recherche a été soutenue par l'American Lung Association et l'American Thoracic Society Awards à LS. Les auteurs veulent sincèrement remercier le Dr Jack Elias et le Dr Chun Geun Lee d'avoir fourni des souches de souris transgéniques.

Toutes les procédures animales ont été exécutées selon un protocole approuvé par l'IACUC à l'école de médecine de l'Université Yale.
1. Collection d'échantillons de souris
<ol><li>
Anesthésie
	<ol>
<li>Anesthésiez les souris à l'aide de kétamine et de xylazine (100 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Collecte d'échantillons de sang
	<ol>
<li>Confirmer la profondeur de l'anesthésie par la non-réactivité à u...

<ol>
	<li>Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinases:+An+update.">Chitinases: An update.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).</li><li>Sharma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+Role+of+Chitotriosidase+during+Lung+Infection+with+Klebsiella+pneumoniae.">Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).</li><li>Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chitotriosidase+(chitinase+1)+under+normal+and+disease+conditions.">Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions.</a> Journal of Epithelial Biology &#38; Pharmacology. 5, 1-9 (2012).</li><li>Lee, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Chitin+and+Chitinase/Chitinase-Like+Proteins+in+Inflammation,+Tissue+Remodeling,+and+Injury.">Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury.</a> Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).</li><li>Jeuniaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase:+An+Addition+to+the+List+of+Hydrolases+in+the+Digestive+Tract+of+Vertebrates.">Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates.</a> Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).</li><li>Boot, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Acidic+Mammalian+Chitinase+Distinct+from+Chitotriosidase.">Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).</li><li>Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+Recognition+via+Chitotriosidase+Promotes+Pathologic+Type-2+Helper+T+Cell+Responses+to+Cryptococcal+Infection.">Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701 (2015).</li><li>Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+Effects+of+Chitotriosidase+Enzyme.">Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme.</a> Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).</li><li>Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast,+sensitive+and+easy+colorimetric+assay+for+chitinase+and+cellulase+activity+detection.">A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection.</a> Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).</li><li>Schales, O., Schales, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+the+determination+of+glucose+in+blood.">Simple method for the determination of glucose in blood.</a> Proc Am Fed Clin Res. 2, 78 (1945).</li><li>Zarei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Chitinase+with+Antifungal+Activity+from+a+Native+Serratia+Marcescens+B4A.">Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+Mammalian+Chitinase+in+Asthmatic+Th2+Inflammation+and+IL-13+Pathway+Activation.">Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation.</a> Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).</li><li>Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+elevation+of+plasma+chitotriosidase+activity.+A+novel+hallmark+of+Gaucher+disease.">Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).</li><li>Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitotriosidase+activity+in+colostrum+from+African+and+Caucasian+women.">Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).</li><li>Maddens, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase-like+Proteins+are+Candidate+Biomarkers+for+Sepsis-induced+Acute+Kidney+Injury.">Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury.</a> Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).</li><li>Hector, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase+activation+in+patients+with+fungus-associated+cystic+fibrosis+lung+disease.">Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).</li><li>Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., G&#246;tz, F., Falcone, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chitotriosidase+is+expressed+in+the+eye+and+lacrimal+gland+and+has+an+antimicrobial+spectrum+different+from+lysozyme.">Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme.</a> Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).</li><li>Kim, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMCase+is+a+crucial+regulator+of+type+2+immune+responses+to+inhaled+house+dust+mites.">AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).</li><li>Olkhovych, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitotriosidase+activity+as+additional+biomarker+in+the+diagnosis+of+lysosomal+storage+diseases.">Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases.</a> Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).</li><li>Bouayadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease:+An+Underdiagnosed+Pathology+in+the+Eastern+Moroccan+Population.">Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population.</a> eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).</li><li>Tasci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+serum+chitotriosidase+activity+in+early+treatment+of+patients+with+active+tuberculosis+and+a+negative+sputum+smear.">Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).</li><li>Barone, R., Simpor&#233;, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+chitotriosidase+activity+in+acute+Plasmodium+falciparum+malaria.">Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria.</a> Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).</li><li>Kitamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase+inhibition+promotes+atherosclerosis+in+hyperlipidemic+mice.">Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice.</a> American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).</li><li>Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Chitinases+and+Chitinase-Like+Proteins+as+Indicators+for+Infl+Ammation+and+Cancer.">Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer.</a> Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).</li></ol>

L'activité chitinase est apparue comme un biomarqueur important pour prédire la gravité de la maladie, la progression de la maladie, l'efficacité thérapeutique et la présence d'agents pathogènes spécifiques18. Bien que beaucoup de théories longtemps postulées sur le rôle des chitinases n'ont pas été expérimentalementprouvé19, de nouvelles études ont fourni des idées importantes sur le rôle des chitinases et chitinase comme les protéines dans diverses mala...

La chitinestine est le deuxième polysaccharide le plus abondant sur la terre après la cellulose, servant de composant structurel majeur d'une variété d'organismes, y compris l'exosquelette des insectes, des champignons, des levures et des algues; certains vertébrés ont également chitin1. Chitinases sont une famille d'enzymes qui sont capables de décomposer la chitine et sont très conservés tout au long de l'évolution des espèces allant des bactéries aux mammifères2,3. En plus des chitinases, les mammifères ont également des protéines chitinase-comme qui sont semblables aux chitinases dans leur capacité à lier la chitine mais diffèrent en ce qu'ils manquent de capacité enzymatique de cencouper la chitine4.
Bien que la chitine et les chitinases aient été étudiées depuis longtemps, avec des études remontant au début des années 1900, l'accent a été mis sur leur rôle dans les insectes et autres invertébrés. En fait, ce n'est que dans les années 1960 que l'on a découvert que les vertébrés avaient des chitinases. À l'aide d'un étosay à base de chitobiase, il a été démontré que des chitinases se trouvaient dans le tube digestif d'un certain nombre de vertébrés, y compris des lézards et des merles, une observation qui est présumée être due à la consommation d'organismes contenant de la chitine comme les insectes5. .
Les mammifères ont deux formes enzymatiquement actives de chitinase : la chitinase acide de mammifères (AMCase ; égalementconnue sous le nom chIT2 et CHIA) et la chitotriosidase (CHIT1) 4. Ces deux protéines sont capables d'hydrolyser la chitin. Cependant, CHIT1 est plus enzymatiquement actif chez l'homme, où presque toute l'activité chitinase est dérivée de CHIT1. 4 Chez la souris, Chit1 et AMCase contribuent presque également à l'activité chitinase globale6. D'autre part, les protéines chitinase-comme manquent d'activité chitinase.
Chit1 est principalement sécrété par les macrophages et est souvent considérécomme une réponse immunitaire aux agents pathogènes contenant de la chitin7 . L'enzyme a également été montré pour être impliqué dans la maturation des monocytes dans les deux sous-types de macrophage M1 et M2, même sans la présence du substrat chitin8. En outre, il peut également être impliqué dans la maturation d'autres cellules immunitaires, y compris les cellules de type 2 (Th2) d'aide T et les éosinophiles, comme cela s'est avéré être le cas dans l'infection pulmonaire cryptococcique9. Ces études indiquent un rôle complexe des chitinases dans le système immunitaire.
Ces dernières années, les niveaux de Chit1 ont été trouvés pour servir de biomarqueur important de la progression pour plus de 40 maladies humaines différentes, y compris les maladies de stockage lysosomal, les maladies infectieuses, les maladies respiratoires, les maladies endocriologiques, maladies neurologiques, et d'autres (révisé10). Dans beaucoup de ces maladies, les niveaux de Chit1 sont un prédicteur fort de la sévérité de la maladie et de l'efficacité thérapeutique10.
Comme les chitinases ont acquis une réputation de biomarqueur pour de nombreuses conditions médicales, y compris la maladie de Gaucher, des outils et des essais ont été développés pour faciliter les tests de présence de chitinase. Les méthodes plus anciennes incluent la procédure de Schales, un protocole adapté d'un essai de glucose sanguin, et la méthode de 3,5 acide dinitrosalicolilique (DNS). Cependant, ces méthodes sont souvent sensibles au temps et techniquement difficiles11. La procédure pour ces deux tests nécessite la réduction des oxydants inorganiques, ferricyanide dans le cas de la procédure des Schales par exemple, produisant un changement de couleur qui ne peut être mesuré spectrophotométriquement. En outre, les deux tests impliquent une étape de chauffage ou d'ébullition qui est à la fois long et nécessaire pour la couleur de se développer12,13.
Décrit ici est un test fluorémétrique rapide et simple pour déterminer les niveaux de chitinase dans les échantillons de mammifères14,15. Deux des échantillons utilisés ici comprennent le sérum et les liquides de lavage bronchoalvéolaire (BAL); l'activité de chitinase a également été mesurée dans le lait maternel et les échantillons d'urine, et la technique peut être exécutée dans ce type d'échantillons aussi bien que dans n'importe quel autre fluide biologique16,17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1381</td>
			<td>Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4MU-GlcNAc2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9763</td>
			<td>fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4MU-GlcNAc3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5639</td>
			<td>fluorescent chitinase substrate for use in human samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid-monohydrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in McIlvain Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4xH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in McIlvain Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0224</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of chitinase activity in biological samples

Les chitinases sont les enzymes qui cisaillent la chitine. Même en l'absence de chitine, les mammifères ont des quantités significatives de chitinases présentes dans le corps, y compris à la ligne de base. Le rôle précis de la chitinase n'est pas connu, mais on croyait qu'il jouait un rôle important dans la digestion et la défense de l'hôte contre les aliments contenant de la chitine et les agents pathogènes, respectivement. Des travaux récents, y compris le nôtre, ont montré un rôle important de protéines chitinase et chitinase-like dans l'immunité de l'hôte et les maladies allergiques. Fait important, les activités de chitinase servent de biomarqueurs importants de la gravité de la maladie dans un large éventail de maladies, y compris les maladies inflammatoires de type 2 comme l'asthme et la fibrose pulmonaire. De même, les patients atteints de troubles génétiques comme la maladie de Gaucher ont des niveaux de chitinase significativement élevés, qui non seulement sont en corrélation avec la gravité de la maladie, mais servent également de biomarqueur fiable pour l'efficacité thérapeutique. Le protocole décrit ici une façon simple, rapide et directe de mesurer l'activité chitinase dans les échantillons de bal ou de sérum de souris et peut être largement adapté aux sujets humains et à d'autres organismes modèles en raison de la nature hautement conservée des enzymes.

Les résultats présentés ici proviennent d'une étude mesurant l'activité chitinase dans des échantillons de sérum et de BAL de type sauvage (C57BL/6) et de souris transgéniques Chit1 (sur le fond C57BL/6) qui surexpriment le gène Chit1 sur un promoteur de doxycycline. Nos données montrent que les échantillons de sérum et de BAL ont une activité de chitinase détectable à la ligne de base 698,2 - 189,9 nmol/mL-h et 485,7 - 114 nmol/mlâh, respectivement. La surexpression du gène Chit1 à l'aide de la doxycyc...

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Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

Présenté ici est une méthode simple pour mesurer l'activité chitinase dans les fluides biologiques tels que le lavage bronchoalvéolaire ou le sérum.

Mesure de l'activité chitinase dans les échantillons biologiques

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Cette méthode permet un moyen plus efficace de quantifier l’activité de la chitinase dans les échantillons biologiques. L’activité de chitinase s’est montrée pour servir de bon marqueur pour le diagnostic et l’efficacité thérapeutique dans de nombreuses conditions et maladies. Les méthodes antérieures de mesure de l’activité chitinase étaient souvent longues et difficiles à exécuter, deux problèmes qui ont été résolus par l’analyse montrée ici.Cette technique aidera à réaliser les chitinases potentielles ont comme marqueur diagnostique et thérapeutique en le rendant plus facile à mesurer l’activité de chitinase ; par exemple, il peut être employé pour surveiller le traitement de la maladie de Gaucher parce que l’activité de chitinase a été montrée pour diminuer pendant le traitement efficace. Commencez par préparer des substrats, des normes et des solutions pour l’analyse. Préparez 1x tampon McIlvain selon les instructions manuscrites et utilisez-le pour diluer les substrats de chitine à 500 micromolaires chacun.Dissoudre le 4-méthylumbelliferone, la norme, à une concentration de 0,1 millimolaire dans le tampon d’arrêt pour créer une solution standard de stock de courbe. Pour chaque 10 échantillons, mélanger 2,17 millilitres de tampon 1x McIlvain avec 100 microlitres du substrat de chitine pour créer une solution de travail, puis pipette 95 microlitres de la solution de travail dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter cinq microlitres de l’échantillon d’essai à chaque puits et le mélanger à la solution de travail.Couvrez la plaque et secouez-la pendant cinq secondes, puis incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour permettre la réaction enzymatique. Pendant ce temps, diluer la solution stock de 4-méthylumbelliferone pour faire une solution standard de travail de cinq micromolaires et créer une courbe standard en préparant une série de dilutions selon le manuscrit. Commencez par la concentration de cinq micromolaires et mélangez bien chaque dilution.Après l’incubation, ajouter 200 microlitres de tampon d’arrêt à chaque puits pour arrêter la réaction. Ajouter des doublons de 300 microlitres de chaque norme à la même plaque, puis lire la plaque à une excitation de 360 nanomètres et une émission de 455 nanomètres. Ce protocole a été avec succès employé pour mesurer l’activité de chitinase dans le lavage bronchoalveolar et le fluide de sérum du type sauvage et des souris transgéniques sur-exprimantes de chitotriosidase.L’analyse confirme que la surexpression du gène CHIT-1 chez la souris entraîne une augmentation de l’activité chitinase. Une courbe standard a été utilisée pour déterminer la chitinase en fonction de la fluorescence des échantillons. La chose la plus importante à retenir lors de la première tentative du protocole est d’ajouter les échantillons aussi rapidement et efficacement que possible tout en mélangeant complètement.Lorsque vous commencez, il peut être avantageux de faire moins d’échantillons par course pour assurer l’exactitude des mesures, en raison d’une période d’incubation plus courte.

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