Name: measurement of chitinase activity in biological samples
Uploaded: 2019-08-22T15:00:00
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Diese Forschung wurde von der American Lung Association und der American Thoracic Society Awards an LS unterstützt. Die Autoren möchten Dr. Jack Elias und Dr. Chun Geun Lee aufrichtig für die Bereitstellung transgener Mausstämme danken.

Alle tierischen Eingriffe wurden im Rahmen eines von der IACUC zugelassenen Protokolls an der Yale University School of Medicine durchgeführt.
1. Maus-Sample-Sammlung
<ol><li>
Anästhesisierung
	<ol>
<li>Anästhesisieren Sie Mäuse mit Ketamin und Xylazin (100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Blutprobenentnahme
	<ol>
<li>Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Nicht-Reaktion auf eine Zehenklemme.</li>
		<li>Öffnen Sie ch...

<ol>
	<li>Hamid, R., Khan, M. 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Chitinase-Aktivität hat sich als wichtiger Biomarker für die Vorhersage der Schwere der Krankheit, Krankheitsprogression, therapeutische Wirksamkeit und das Vorhandensein von spezifischen Krankheitserregern18. Obwohl viele der lang postulierten Theorien über die Rolle von Chitinasen nicht experimentell nachgewiesen wurden19, neue Studien haben wichtige Einblicke in die Rolle von Chitinasen und Chitinase wie Proteine in verschiedenenKrankheiten2 ,<...

Chitin ist das zweithäufigste Polysaccharid auf der Erde nach Zellulose und dient als wichtiger struktureller Bestandteil einer Vielzahl von Organismen, einschließlich des Exoskeletts von Insekten, Pilzen, Hefen und Algen; einige Wirbeltiere haben auch Chitin1. Chitinasen sind eine Familie von Enzymen, die in der Lage sind, Chitin zu brechen und sind hoch konserviert während der Evolution in Arten von Bakterien bis Säugetiere2,3. Neben Chitinasen haben Säugetiere auch chitinaseähnliche Proteine, die Chitinasen in ihrer Fähigkeit, Chitin zu binden, ähnlich sind, sich aber dadurch unterscheiden, dass sie nicht enzymatisch in der Lage sind, das Chitin zu spalten4.
Obwohl Chitin und Chitinasen seit langem untersucht werden – mit Untersuchungen aus den frühen 1900er Jahren –, lag der Schwerpunkt auf ihrer Rolle bei Insekten und anderen wirbellosen Tieren. Tatsächlich war es erst in den 1960er Jahren, als Wirbeltiere überhaupt Chitinasen hatten. Mit Hilfe eines Chitobias-basierten Assays wurden Chitinasen im Verdauungstrakt einer Reihe von Wirbeltieren, einschließlich Eidechsen und Amseln, nachgewiesen – eine Beobachtung, die auf den Verzehr von Chitin-haltigen Organismen wie Insekten zurückzuführen ist5 .
Säugetiere haben zwei enzymatisch aktive Formen der Chitinase: saure Säugetierchitinase (AMCase; auch bekannt als CHIT2 und CHIA) und Chitotriosidase (CHIT1)4. Beide Proteine sind in der Lage, Chitin zu hydrolysieren. CHIT1 ist jedoch enzymatisch aktiver beim Menschen, wo fast die gesamte Chitinase-Aktivität von CHIT1 abgeleitet ist. 4 Bei Mäusen tragen sowohl Chit1 als auch AMCase fast zu gleichen Teilen zur Gesamtchartase-Aktivitätbei 6. Auf der anderen Seite, Chitinase-ähnliche Proteine fehlt Chitinase-Aktivität.
Chit1 wird hauptsächlich durch Makrophagen abgesondert und wird oft als Immunantwort auf Chitin-haltige Krankheitserregerangesehen 7. Das Enzym hat sich auch bei der Reifung von Monozyten in M1- und M2-Makrophagensubtypen beteiligt, auch ohne das Vorhandensein des Substrats Chitin8. Darüber hinaus kann es auch an der Reifung anderer Immunzellen einschließlich T-Helfer Typ 2 (Th2) Zellen und Eosinophile beteiligt sein – wie sich bei kryptokokkalen Lungeninfektionen gezeigt hat9. Diese Studien deuten auf eine komplexe Rolle von Chitinasen im Immunsystem hin.
In den letzten Jahren wurden Chit1-Spiegel als wichtiger Biomarker für die Progression von über 40 verschiedenen menschlichen Krankheiten, einschließlich lysosomaler Speichererkrankungen, Infektionskrankheiten, Atemwegserkrankungen, endokrinologischen Erkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Erkrankungen, neurologischen Erkrankungen und anderen (überprüft10). Bei vielen dieser Krankheiten sind die Konzentrationen von Chit1 ein starker Prädiktor für die Schwere der Erkrankung und die therapeutische Wirksamkeit10.
Da Chitinasen einen Ruf als Biomarker für zahlreiche Erkrankungen einschließlich Gaucher-Krankheit gewonnen haben, wurden Werkzeuge und Assays entwickelt, um Tests auf Chitinase-Präsenz zu erleichtern. Zu den älteren Methoden gehören Schales' Verfahren, ein Protokoll, das an einen Blutzuckertest angepasst wurde, und die 3,5 Dinitrosalicylsäure (DNS) Methode. Diese Methoden sind jedoch oft zeitsensibel und technisch schwierig11. Das Verfahren für beide Tests erfordert die Reduktion von anorganischen Oxidationsmitteln, Ferricyanid beispielsweise im Falle des Schales-Verfahrens, wodurch eine Farbänderung entsteht, die nur spektrophotometrisch gemessen werden kann. Darüber hinaus beinhalten beide Tests einen Heiz- oder Siedeschritt, der sowohl zeitaufwändig als auch notwendig ist, damit die Farbe12,13entwickelt werden kann.
Beschrieben hier ist ein schneller und einfacher fluorimetrischer Test zur Bestimmung des Chitinase-Spiegels in Säugetierproben14,15. Zwei der hier verwendeten Proben sind Serum- und Bronchoalveolar-Lavage-Flüssigkeiten (BAL); Chitinase-Aktivität wurde auch in Muttermilch- und Urinproben gemessen, und die Technik kann in dieser Art von Proben sowie in jeder anderen biologischen Flüssigkeit16,17durchgeführt werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1381</td>
			<td>Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4MU-GlcNAc2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9763</td>
			<td>fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4MU-GlcNAc3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5639</td>
			<td>fluorescent chitinase substrate for use in human samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid-monohydrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in McIlvain Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4xH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in McIlvain Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0224</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of chitinase activity in biological samples

Chitinasen sind die Enzyme, die Chitin spalten. Auch in Ermangelung von Chitin, Säugetiere haben erhebliche Mengen an Chitinasen im Körper vorhanden, auch an der Basis. Die genaue Rolle der Chitinase ist nicht bekannt, aber es wurde geglaubt, um eine wichtige Rolle bei der Verdauung und Host-Verteidigung gegen Chitin-haltige Lebensmittel und Krankheitserreger zu spielen. Jüngste Arbeiten, einschließlich unserer, haben eine wichtige Rolle von Chitinase und Chitinase-ähnlichen Proteinen bei der Wirtsimmunität und allergischen Erkrankungen gezeigt. Wichtig ist, dass Chitinase-Aktivitäten als wichtige Biomarker der Krankheitsschwere bei einer Vielzahl von Krankheiten dienen, einschließlich typ-2-entzündlichen Erkrankungen wie Asthma und Lungenfibrose. In ähnlicher Weise haben Patienten mit genetischen Störungen wie der Gaucher-Krankheit deutlich erhöhte Chitinase-Spiegel, die nicht nur mit der Schwere der Erkrankung korrelieren, sondern auch als zuverlässiger Biomarker für die therapeutische Wirksamkeit dienen. Das hier skizzierte Protokoll beschreibt eine einfache, schnelle und unkomplizierte Methode zur Messung der Chitinase-Aktivität in BAL- oder Serumproben von Mäusen und kann aufgrund der stark konservierten Natur der Enzyme weitgehend an menschliche Probanden und andere Modellorganismen angepasst werden.

Die hier gezeigten Ergebnisse stammen aus einer Studie zur Messung der Chitinase-Aktivität in Serum- und BAL-Proben des wilden Typs (C57BL/6) und der transgenen Chit1-Mäuse (auf C57BL/6-Hintergrund), die das Chit1-Gen auf einem Doxycyclin-Promotor überexprimieren. Unsere Daten zeigen, dass sowohl Serum- als auch BAL-Proben eine nachweisbare Chitinase-Aktivität bei Derkgrundwerten von 698,2 x 189,9 nmol/ml und 485,7 x 114 nmol/ml-h aufweisen. Die Überexpression des Chit1-Gens unter Verwendung von Doxycyclin im Trinkw...

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Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

Hier wird eine einfache Methode zur Messung der Chitinase-Aktivität in biologischen Flüssigkeiten wie Bronchoalveolar-Lavage oder Serum vorgestellt.

Messung der Chitinase-Aktivität in biologischen Proben

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Diese Methode ermöglicht eine effektivere Möglichkeit, die Chitinase-Aktivität in biologischen Proben zu quantifizieren. Chitinase-Aktivität hat sich als ein guter Marker für die Diagnose und therapeutische Wirksamkeit bei zahlreichen Bedingungen und Krankheiten dienen. Frühere Methoden zur Messung der Chitinase-Aktivität waren oft zeitaufwändig und schwierig durchzuführen, beides Probleme, die durch den hier gezeigten Test gelöst wurden.Diese Technik wird dazu beitragen, die potenziellen Chitinasen als diagnostischen und therapeutischen Marker zu erfüllen, indem sie es einfacher macht, die Chitinase-Aktivität zu messen; zum Beispiel kann es verwendet werden, um die Behandlung der Gaucher-Krankheit zu überwachen, da die Chitinase-Aktivität nachweislich während der effektiven Behandlung abnimmt. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Substraten, Standards und Lösungen für den Assay. Bereiten Sie 1x McIlvain Puffer nach den Manuskriptrichtungen vor und verwenden Sie ihn, um Chitinsubstrate auf jeweils 500 Mikromolar zu verdünnen.4-Methylumbelliferon, den Standard, auf eine Konzentration von 0,1 Millimolar im Stop-Puffer auflösen, um eine Standard-Kurvenstammlösung zu erstellen. Mischen Sie für 10 Proben 2,17 Milliliter 1x McIlvain-Puffer mit 100 Mikrolitern des Chitinsubstrats, um eine funktionierende Lösung zu schaffen, und pipette dann 95 Mikroliter der Arbeitslösung in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte. Fügen Sie fünf Mikroliter der Testprobe zu jedem Brunnen hinzu und mischen Sie sie in die Arbeitslösung.Bedecken Sie die Platte und schütteln Sie sie für fünf Sekunden, und bebrüten Sie die Platte dann 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit die enzymatische Reaktion stattfinden kann. In der Zwischenzeit verdünnen Sie die Stammlösung von 4-Methylumbelliferon, um eine Fünf-Mikromolar-Arbeitsstandardlösung zu machen und eine Standardkurve zu erstellen, indem Sie eine Reihe von Verdünnungen nach dem Manuskript vorbereiten. Beginnen Sie mit der Fünf-Mikromolar-Konzentration und mischen Sie jede Verdünnung gut.Nach der Inkubation 200 Mikroliter Stop-Puffer zu jedem Brunnen hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen. Fügen Sie 300-Mikroliter-Duplikate jedes Standards auf dieselbe Platte, dann lesen Sie die Platte bei einer Anregung von 360 Nanometern und einer Emission von 455 Nanometern. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um die Chitinase-Aktivität in bronchoalveolaren Spülen und Serumflüssigkeit endenden Wilden und Chitotriosidase zu exzierenden transgenen Mäusen zu messen.Der Test bestätigt, dass eine Überexpression des CHIT-1-Gens bei Mäusen zu einer erhöhten Chitinase-Aktivität führt. Eine Standardkurve wurde verwendet, um Chitinase basierend auf der Fluoreszenz der Proben zu bestimmen. Das Wichtigste, was Sie beim ersten Versuch des Protokolls beachten sollten, ist, die Proben so schnell und effizient wie möglich hinzuzufügen und dabei noch gründlich zu mischen.Wenn Sie zum ersten Mal beginnen, kann es vorteilhaft sein, weniger Proben pro Durchlauf zu machen, um die Genauigkeit der Messungen zu gewährleisten, aufgrund einer kürzeren Inkubationszeit.

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