Name: measurement of chitinase activity in biological samples
Uploaded: 2019-08-22T15:00:00
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Questa ricerca è stata supportata dall'American Lung Association e dai premi dell'American Thoracic Society alla LS. Gli autori vogliono sinceramente ringraziare il Dr. Jack Elias e il Dr. Chun Geun Lee per aver fornito ceppi di topi transgenici.

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite nell'ambito di un protocollo approvato dall'IACUC presso la Yale University School of Medicine.
1. Collezione di campioni di mouse
<ol><li>
Anestesizzazione
	<ol>
<li>Anestesizza reati con ketamina e xylazina (100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilanina).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raccolta di campioni di sangue
	<ol>
<li>Confermare la profondità dell'anestesia per non risposta a un pizzico di dita dei dei ...

<ol>
	<li>Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinases:+An+update.">Chitinases: An update.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).</li><li>Sharma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+Role+of+Chitotriosidase+during+Lung+Infection+with+Klebsiella+pneumoniae.">Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).</li><li>Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chitotriosidase+(chitinase+1)+under+normal+and+disease+conditions.">Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions.</a> Journal of Epithelial Biology &#38; Pharmacology. 5, 1-9 (2012).</li><li>Lee, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Chitin+and+Chitinase/Chitinase-Like+Proteins+in+Inflammation,+Tissue+Remodeling,+and+Injury.">Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury.</a> Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).</li><li>Jeuniaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase:+An+Addition+to+the+List+of+Hydrolases+in+the+Digestive+Tract+of+Vertebrates.">Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates.</a> Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).</li><li>Boot, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Acidic+Mammalian+Chitinase+Distinct+from+Chitotriosidase.">Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).</li><li>Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitotriosidase+Deficiency:+A+Mutation+Update+in+an+African+Population.">Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population.</a> JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).</li><li>Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+CHI3L-1+and+CHIT-1+Expression+in+Differentiated+and+Polarized+Macrophages.">Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages.</a> Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).</li><li>Wiesner, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+Recognition+via+Chitotriosidase+Promotes+Pathologic+Type-2+Helper+T+Cell+Responses+to+Cryptococcal+Infection.">Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701 (2015).</li><li>Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+Effects+of+Chitotriosidase+Enzyme.">Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme.</a> Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).</li><li>Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast,+sensitive+and+easy+colorimetric+assay+for+chitinase+and+cellulase+activity+detection.">A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection.</a> Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).</li><li>Schales, O., Schales, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+the+determination+of+glucose+in+blood.">Simple method for the determination of glucose in blood.</a> Proc Am Fed Clin Res. 2, 78 (1945).</li><li>Zarei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Chitinase+with+Antifungal+Activity+from+a+Native+Serratia+Marcescens+B4A.">Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+Mammalian+Chitinase+in+Asthmatic+Th2+Inflammation+and+IL-13+Pathway+Activation.">Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation.</a> Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).</li><li>Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+elevation+of+plasma+chitotriosidase+activity.+A+novel+hallmark+of+Gaucher+disease.">Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).</li><li>Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitotriosidase+activity+in+colostrum+from+African+and+Caucasian+women.">Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).</li><li>Maddens, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase-like+Proteins+are+Candidate+Biomarkers+for+Sepsis-induced+Acute+Kidney+Injury.">Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury.</a> Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).</li><li>Hector, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase+activation+in+patients+with+fungus-associated+cystic+fibrosis+lung+disease.">Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).</li><li>Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., G&#246;tz, F., Falcone, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chitotriosidase+is+expressed+in+the+eye+and+lacrimal+gland+and+has+an+antimicrobial+spectrum+different+from+lysozyme.">Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme.</a> Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).</li><li>Kim, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMCase+is+a+crucial+regulator+of+type+2+immune+responses+to+inhaled+house+dust+mites.">AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).</li><li>Olkhovych, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitotriosidase+activity+as+additional+biomarker+in+the+diagnosis+of+lysosomal+storage+diseases.">Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases.</a> Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).</li><li>Bouayadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease:+An+Underdiagnosed+Pathology+in+the+Eastern+Moroccan+Population.">Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population.</a> eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).</li><li>Tasci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+serum+chitotriosidase+activity+in+early+treatment+of+patients+with+active+tuberculosis+and+a+negative+sputum+smear.">Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).</li><li>Barone, R., Simpor&#233;, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+chitotriosidase+activity+in+acute+Plasmodium+falciparum+malaria.">Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria.</a> Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).</li><li>Kitamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase+inhibition+promotes+atherosclerosis+in+hyperlipidemic+mice.">Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice.</a> American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).</li><li>Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Chitinases+and+Chitinase-Like+Proteins+as+Indicators+for+Infl+Ammation+and+Cancer.">Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer.</a> Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).</li></ol>

L'attività della chitinasi è emersa come un importante biomarcatore per prevedere la gravità della malattia, la progressione della malattia, l'efficacia terapeutica e la presenza di specifici patogeni18. Anche se molte delle teorie a lungo postulate sul ruolo delle chitinasi non sono state provate sperimentalmente19, nuovi studi hanno fornito importanti informazioni sul ruolo delle chitinasi e della chitinasi come proteine in varie malattie2,...

La chitina è il secondo polisaccaride più abbondante sulla terra dopo la cellulosa, servendo come componente strutturale principale di una varietà di organismi tra cui l'esoscheletro di insetti, funghi, lieviti e alghe; alcuni vertebrati hanno anche la chitina1. Le chitinasi sono una famiglia di enzimi che sono in grado di abbattere la chitina e sono altamente conservati durante tutta l'evoluzione in specie che vanno dai batteri ai mammiferi2,3. Oltre alle chitinasi, i mammiferi hanno anche proteine simili alla chitinasi che sono simili alle chitinasi nella loro capacità di legare la chitina, ma differiscono in quanto mancano di capacità enzimatica di fendere la chitina4 .
Anche se le chitine e le chitinasi sono state studiate da tempo, con indagini risalenti ai primi anni del 1900, l'attenzione principale è stata sul loro ruolo negli insetti e in altri invertebrati. Infatti, non è stato fino al 1960, quando i vertebrati sono stati trovati ad avere chitinasi a tutti. Utilizzando un saggio a base di chitobiasi, è stato dimostrato che le chitinasi si trovano nel tratto digestivo di un certo numero di vertebrati, tra cui lucertole e merli, un'osservazione ipotizzata sia dovuta al consumo di organismi contenenti chitina come gli insetti5 .
I mammiferi hanno due forme enzimaticamente attive di chitinasi: chitinasi dei mammiferi acidi (AMCase, noti anche come CHIT2 e CHIA) e chitotriosidasi (CHIT1)4. Entrambe queste proteine sono in grado di chitina idrolmente. Tuttavia, CHIT1 è più enzimaticamente attivo negli esseri umani, dove quasi tutta l'attività della chitinasi è derivata da CHIT1. 4 Nei topi, sia Chit1 che AMCase contribuiscono quasi equamente all'attività complessiva della chitinasi6. D'altra parte, le proteine simili alle chitinasi non hanno attività di chitinasi.
Chit1 è principalmente secreto dai macrofagi ed è spesso considerato una risposta immunitaria agli agenti patogeni contenenti chitina7. È stato anche dimostrato che l'enzima è coinvolto nella maturazione dei monociti in sottotipi di macrofagio M1 e M2, anche senza la presenza del substrato chitina8. Inoltre, può anche essere coinvolto nella maturazione di altre cellule immunitarie tra cui cellule T helper di tipo 2 (Th2) ed eosinofili, come è stato dimostrato di essere il caso in infezione polmonare criptococcale9. Questi studi indicano un ruolo complesso delle chitinasi nel sistema immunitario.
Negli ultimi anni, i livelli di Chit1 sono stati trovati come un importante biomarcatore della progressione per oltre 40 diverse malattie umane, tra cui malattie da accumulo lisosomiale, malattie infettive, malattie respiratorie, malattie endocrinologiche, malattie cardiovascolari malattie neurologiche e altre (riviste10). In molte di queste malattie, i livelli di Chit1 sono un forte predittore di gravità della malattia e l'efficacia terapeutica10.
Come chitinasi hanno guadagnato una reputazione come biomarcatore per numerose condizioni mediche tra cui malattia di Gaucher, strumenti e saggi sono stati sviluppati per facilitare i test per la presenza di chitinasi. I metodi più vecchi includono la procedura di Schales, un protocollo adattato da un test della glicemia e il metodo 3,5 dell'acido dinitrosalicilico (DNS). Tuttavia, questi metodi sono spesso sensibili al tempo e tecnicamente difficili11. La procedura per entrambi questi test richiede la riduzione di ossidanti inorganici, ferricianide nel caso della procedura di Schales, ad esempio, producendo un cambiamento di colore che può essere misurato solo spettrofotometricamente. Inoltre, entrambi i test comportano una fase di riscaldamento o ebollizione che richiede tempo e necessaria per lo sviluppo del colore12,13.
Descritto qui è un rapido e semplice saggio fluorimetrico per determinare i livelli di chitinasi nei campioni di mammiferi14,15. Due dei campioni qui utilizzati includono fluidi di lavaggio del siero e del bronchoalveolar (BAL); L'attività della chitinasi è stata misurata anche in campioni di latte materno e urina, e la tecnica può essere eseguita in quel tipo di campioni così come in qualsiasi altro fluido biologico16,17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1381</td>
			<td>Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4MU-GlcNAc2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9763</td>
			<td>fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4MU-GlcNAc3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5639</td>
			<td>fluorescent chitinase substrate for use in human samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid-monohydrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in McIlvain Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4xH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in McIlvain Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0224</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of chitinase activity in biological samples

Le chitinasi sono gli enzimi che fendono la chitina. Anche in assenza di chitina, i mammiferi hanno quantità significative di chitinasi presenti nel corpo anche al basale. Il ruolo preciso della chitinasi non è noto, tuttavia si credeva che svolgesse un ruolo importante nella digestione e nella difesa dell'ospite contro il cibo e gli agenti patogeni che contengono la chitina, rispettivamente. Recenti lavori, tra cui il nostro, hanno mostrato un ruolo importante della chitinasi e delle proteine simili alla chitinasi nell'immunità dell'ospite e nelle malattie allergiche. È importante sottolineare che le attività di chitinasi fungono da importanti biomarcatori della gravità della malattia in un'ampia gamma di malattie, tra cui malattie infiammatorie di tipo 2 come l'asma e la fibrosi polmonare. Allo stesso modo, i pazienti con disturbi genetici come la malattia di Gaucher hanno livelli di chitinasi significativamente elevati, che non solo correlano con la gravità della malattia, ma servono anche come un biomarcatore affidabile per l'efficacia terapeutica. Il protocollo qui descritto descrive un modo semplice, rapido e diretto per misurare l'attività delle chitinasi in campioni di BAL o siero di topi e può essere ampiamente adattato a soggetti umani e altri organismi modello a causa della natura altamente conservata degli enzimi.

I risultati mostrati di seguito provengono da uno studio che misura l'attività della chitinasi nei campioni di siero e BAL di tipo selvatico (C57BL/6) e topi transgenici Chit1 (su sfondo C57BL/6) che sovraesprimono il gene Chit1 su un promotore di doxyciclina. I nostri dati mostrano che sia i campioni di siero che di BAL hanno attività di chitinasi rilevabili in base alla linea di base 698,2 x 189,9 nmol/mL-h e 485,7 x 114 nmol/ml-h, rispettivamente. La sovraespressione del gene Chit1 che utilizza la doxycycline nell'a...

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Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

Presentato qui è un metodo semplice per misurare l'attività delle chitinasi nei fluidi biologici come la lavanda bronchoalveolare o il siero.

Misurazione dell'attività della chitinasi nei campioni biologici

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Questo metodo consente un modo più efficace per quantificare l'attività della chitinasi nei campioni biologici. L'attività chitinasi ha dimostrato di servire come un buon marcatore per la diagnosi e l'efficacia terapeutica in numerose condizioni e malattie. I metodi precedenti per la misurazione dell'attività chitinasi erano spesso dispendiosi in termini di tempo e difficili da eseguire, entrambi problemi che sono stati risolti dal saggio qui mostrato.Questa tecnica aiuterà a soddisfare le potenziali chitinasi come marcatore diagnostico e terapeutico rendendo più facile misurare l'attività chitinasi;ad esempio, può essere utilizzata per monitorare il trattamento della malattia di Gaucher perché l'attività chitinasi ha dimostrato di diminuire durante un trattamento efficace. Inizia preparando substrati, standard e soluzioni per il test. Preparare 1 tampone McIlvain secondo le indicazioni del manoscritto e utilizzarlo per diluire i substrati di chitina a 500 micromolari ciascuno.Sciogliere 4-metillumbelliferone, lo standard, a una concentrazione di 0,1 millimolare in tampone di arresto per creare una soluzione standard di stock di curve. Per ogni 10 campioni, mescolare 2,17 millilitri di tampone McIlvain 1x con 100 microlitri del substrato di chitina per creare una soluzione di lavoro, quindi pipettare 95 microlitri della soluzione di lavoro in ogni pozzo di una piastra da 96. Aggiungere cinque microlitri del campione di prova a ciascun pozzo e mescolarlo nella soluzione di lavoro.Coprire la piastra e scuoterla per cinque secondi, quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 15 minuti per consentire la reazione enzimatica. Nel frattempo, diluire la soluzione stock di 4-metillumbelliferone per creare una soluzione standard di lavoro a cinque micromolari e creare una curva standard preparando una serie di diluizioni secondo il manoscritto. Iniziare con la concentrazione di cinque micromolari e mescolare bene ogni diluizione.Dopo l'incubazione, aggiungere 200 microlitri di tampone di arresto ad ogni pozzo per fermare la reazione. Aggiungere 300 microliter duplicati di ogni standard alla stessa piastra, quindi leggere la piastra ad un'eccitazione di 360 nanometri e un'emissione di 455 nanometri. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per misurare l'attività della chitinasi nella lavanda broncoalveolare e nel liquido siero di tipo selvatico e nella chitotriosidasi che esprime esente da topi transgenici.Il saggio conferma che l'iperespressione del gene CHIT-1 nei topi si traduce in un aumento dell'attività chitinasi. Una curva standard è stata utilizzata per determinare la chitinasi in base alla fluorescenza dei campioni. La cosa più importante da ricordare quando si tenta per la prima volta il protocollo è aggiungere i campioni nel modo più rapido ed efficiente possibile pur mescolando accuratamente.Quando inizi per la prima volta, potrebbe essere utile fare meno campioni per corsa per garantire l'accuratezza nelle misurazioni, a causa di un periodo di incubazione più breve.

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