Name: measurement of chitinase activity in biological samples
Uploaded: 2019-08-22T15:00:00
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この研究は、米国肺協会と米国胸部学会賞のLSに対する支援を受けました。著者は、トランスジェニックマウス株を提供してくれたジャック・イライアス博士とチュン・ジュン・リー博士に心から感謝したいと思います。

すべての動物の手順は、イェール大学医学部でIACUC承認プロトコルの下で行われました.
1. マウスサンプルコレクション
<ol><li>
麻酔
	<ol>
<li>ケタミンとキシラジンを使用してマウスを麻酔する (ケタミンの 100 mg/kg とキシラジンの 10 mg/kg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
血液サンプル収集
	<ol>
<li>つま先のピンチに対する非応答性によって麻酔の深さを確認す?...

<ol>
	<li>Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinases:+An+update.">Chitinases: An update.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).</li><li>Sharma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+Role+of+Chitotriosidase+during+Lung+Infection+with+Klebsiella+pneumoniae.">Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).</li><li>Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chitotriosidase+(chitinase+1)+under+normal+and+disease+conditions.">Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions.</a> Journal of Epithelial Biology &#38; Pharmacology. 5, 1-9 (2012).</li><li>Lee, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Chitin+and+Chitinase/Chitinase-Like+Proteins+in+Inflammation,+Tissue+Remodeling,+and+Injury.">Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury.</a> Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).</li><li>Jeuniaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase:+An+Addition+to+the+List+of+Hydrolases+in+the+Digestive+Tract+of+Vertebrates.">Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates.</a> Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).</li><li>Boot, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Acidic+Mammalian+Chitinase+Distinct+from+Chitotriosidase.">Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).</li><li>Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitotriosidase+Deficiency:+A+Mutation+Update+in+an+African+Population.">Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population.</a> JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).</li><li>Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+CHI3L-1+and+CHIT-1+Expression+in+Differentiated+and+Polarized+Macrophages.">Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages.</a> Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).</li><li>Wiesner, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+Recognition+via+Chitotriosidase+Promotes+Pathologic+Type-2+Helper+T+Cell+Responses+to+Cryptococcal+Infection.">Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701 (2015).</li><li>Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+Effects+of+Chitotriosidase+Enzyme.">Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme.</a> Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).</li><li>Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast,+sensitive+and+easy+colorimetric+assay+for+chitinase+and+cellulase+activity+detection.">A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection.</a> Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).</li><li>Schales, O., Schales, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+the+determination+of+glucose+in+blood.">Simple method for the determination of glucose in blood.</a> Proc Am Fed Clin Res. 2, 78 (1945).</li><li>Zarei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Chitinase+with+Antifungal+Activity+from+a+Native+Serratia+Marcescens+B4A.">Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+Mammalian+Chitinase+in+Asthmatic+Th2+Inflammation+and+IL-13+Pathway+Activation.">Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation.</a> Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).</li><li>Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+elevation+of+plasma+chitotriosidase+activity.+A+novel+hallmark+of+Gaucher+disease.">Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).</li><li>Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitotriosidase+activity+in+colostrum+from+African+and+Caucasian+women.">Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).</li><li>Maddens, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase-like+Proteins+are+Candidate+Biomarkers+for+Sepsis-induced+Acute+Kidney+Injury.">Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury.</a> Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).</li><li>Hector, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase+activation+in+patients+with+fungus-associated+cystic+fibrosis+lung+disease.">Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).</li><li>Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., G&#246;tz, F., Falcone, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chitotriosidase+is+expressed+in+the+eye+and+lacrimal+gland+and+has+an+antimicrobial+spectrum+different+from+lysozyme.">Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme.</a> Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).</li><li>Kim, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMCase+is+a+crucial+regulator+of+type+2+immune+responses+to+inhaled+house+dust+mites.">AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).</li><li>Olkhovych, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitotriosidase+activity+as+additional+biomarker+in+the+diagnosis+of+lysosomal+storage+diseases.">Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases.</a> Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).</li><li>Bouayadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease:+An+Underdiagnosed+Pathology+in+the+Eastern+Moroccan+Population.">Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population.</a> eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).</li><li>Tasci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+serum+chitotriosidase+activity+in+early+treatment+of+patients+with+active+tuberculosis+and+a+negative+sputum+smear.">Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).</li><li>Barone, R., Simpor&#233;, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+chitotriosidase+activity+in+acute+Plasmodium+falciparum+malaria.">Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria.</a> Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).</li><li>Kitamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase+inhibition+promotes+atherosclerosis+in+hyperlipidemic+mice.">Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice.</a> American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).</li><li>Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Chitinases+and+Chitinase-Like+Proteins+as+Indicators+for+Infl+Ammation+and+Cancer.">Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer.</a> Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).</li></ol>

チチナゼ活性は、疾患の重症度、疾患の進行、治療効果および特定病原体の存在を予測するための重要なバイオマーカーとして出現している18。チチラーゼの役割に関する長い仮定理論の多くは実験的に証明されていないが、新しい研究は、様々な疾患におけるタンパク質のようなチチナゼとチチナゼの役割に重要な洞察を提供している2、</su...

キチンは、セルロースに次いで地球上で2番目に豊富な多糖類で、昆虫、真菌、酵母、藻類の外骨格を含む様々な生物の主要な構造成分として機能します。一部の脊椎動物はまた、チチン1を持っています.チチナセは、チチンを分解することができる酵素のファミリーであり、細菌から哺乳類2、3に至るまで種の進化を通じて高度に保存されています。哺乳類は、チチナーゼに加えて、チチナーゼに似たチチナーゼ様タンパク質を持ち、チチナーゼを結合する能力はありますが、チチン4を包丁する酵素能力が欠如しているという点で異なります。
1900年代初頭にさかのぼる調査で、チチンとチチナセは長い間研究されてきましたが、主な焦点は昆虫や他の無脊椎動物における役割に焦点を当ててきました。実際、脊椎動物がチチナラを全く持つことが判明したのは1960年代になってからでした。キトビアスベースのアッセイを用いて、トカゲやブラックバードを含む多数の脊椎動物の消化管にキチナセが見つかることを示した。.
哺乳類は、酸性哺乳動物キチチナゼ(AMCase;CHIT2およびCHIAとも呼ばれる)とキトトリオシダーゼ(CHIT1)4の2つの酵素活性形態を有する。これらのタンパク質の両方が加水分解チチンが可能である。しかし、CHIT1はヒトにおいてより酵素的に活性であり、そこではほとんどすべてのチチナゼ活性がCHIT1に由来する。4マウスにおいて、Chit1およびAMCaseの両方が、全体的なチチナゼ活性6にほぼ等しく寄与する。一方、チチナゼ様タンパク質はチチナゼ活性を欠いている。
Chit1は主にマクロファージによって分泌され、しばしばチチン含有病原体7に対する免疫応答であると考えられている。この酵素はまた、基板キチン8の存在がなくても、M1およびM2マクロファージサブタイプの両方に単球の成熟に関与することが示されている。さらに、Tヘルパー2(Th2)細胞および好酸球を含む他の免疫細胞の成熟に関与し得る-クリプトコッカス肺感染症9の場合に示された。これらの研究は、免疫系におけるチチナセの複雑な役割を指摘している。
近年、Chit1レベルは、リソソーム貯蔵疾患、感染症、呼吸器疾患、内分泌疾患、心血管を含む40種類以上のヒト疾患の進行の重要なバイオマーカーとして機能することが見出されている。疾患、神経疾患、およびその他(レビュー10)。これらの疾患の多くにおいて、Chit1のレベルは、疾患の重症度および治療効果10の強力な予測変数である。
チチナゼは、ガウチャー病を含む多数の病状のバイオマーカーとしての評判を得ているように、ツールやアッセイは、チチラーゼの存在のためのテストを容易にするために開発されています。古い方法には、Schalesの手順、血糖試験から適応されたプロトコル、および3,5ジトロサルチル酸(DNS)法が含まれる。しかし、これらの方法は、多くの場合、時間に敏感で技術的に困難です 11.これらの試験の両方の手順は、無機酸化剤の減少を必要とし、例えばシェールの手順の場合にはフェリシアニドは、分光光量測定のみ測定することができる色の変化を生み出す。さらに、両方のテストは、時間がかかり、色が12、13を開発するために必要な加熱または沸騰ステップを伴います。
ここで説明する哺乳動物試料14,15におけるキチナゼレベルを決定するための迅速かつ簡単なフッ素測定アッセイである。ここで使用されるサンプルの2つは血清および気管支胞洗浄液(BAL)を含む;キチターゼ活性は母乳および尿試料でも測定されており、その技術は、これらのタイプのサンプルおよび他の生物学的流体16、17において行うことができる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1381</td>
			<td>Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4MU-GlcNAc2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9763</td>
			<td>fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4MU-GlcNAc3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5639</td>
			<td>fluorescent chitinase substrate for use in human samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid-monohydrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in McIlvain Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4xH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in McIlvain Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0224</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of chitinase activity in biological samples

チチナセは、チチンをクアッヒする酵素です。チチンが存在しない場合でも、哺乳類はベースラインを含む体内に大量のチチナラが存在する。キチナゼの正確な役割は知られていないが、キチン含有食品および病原体に対する消化および宿主防御において重要な役割を果たすと考えられていた。私たちをはじめとする最近の研究は、宿主免疫およびアレルギー疾患におけるチチナゼおよびチチラーゼ様タンパク質の重要な役割を示している。重要なことに、キチナゼ活性は、喘息や肺線維症などの2型炎症性疾患を含む広範囲の疾患における疾患重症度の重要なバイオマーカーとして機能する。同様に、ガウチャー病のような遺伝性疾患を有する患者は、病気の重症度と相関するだけでなく、治療効果のための信頼性の高いバイオマーカーとしても機能するチチラーゼレベルを有意に上昇させました。ここで概説するプロトコルは、マウスのBALまたは血清サンプルにおけるチチラーゼ活性を測定する簡単で迅速かつ簡単な方法を説明し、酵素の高度に保存された性質のためにヒト被験者および他のモデル生物に広く適応することができる。

ここで示す結果は、ドキシサイクリンプロモーター上でChit1遺伝子を過剰発現する野生型(C57BL/6)およびChit1トランスジェニックマウス(C57BL/6バックグラウンド上)の血清およびBALサンプルにおけるキチネーゼ活性を測定した研究から得られたものである。我々のデータは、血清およびBALサンプルの両方がベースライン698.2±189.9 nmol/mL·hおよび485.7 ±114 nmol/ml·hで検出可能なキチナーゼ活性を有する...

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Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

ここでは、気管支肺胞洗浄剤や血清などの生体液中のキチナーゼ活性を測定する簡単な方法を示す。

生体試料中のキチナセ活性の測定

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

この方法は、生物学的サンプルにおけるキチナーゼ活性を定量化するより効果的な方法を可能にする。チチナーゼ活性は、多くの状態および疾患における診断および治療効果のための良好なマーカーとして役立つことを示している。チチナーゼ活性の測定のための以前の方法は、多くの場合、時間がかかり、実行することが困難であった、ここで示すアッセイによって解決された両方の問題。この技術は、チチナーゼ活性を測定しやすくすることで、診断および治療マーカーとしての潜在的なチチナーゼを満たすのに役立ちます;例えば、チチナス活性が効果的な治療中に減少することが示されているので、ゴーシェ病の治療を監視するために使用することができます。まず、アッセイ用の基板、規格、およびソリューションを準備します。原稿の指示に従って1x McIlvainバッファーを調製し、キチン基板をそれぞれ500マイクロモルに希釈するために使用します。4-メチルウンベリフェロン、標準、停止バッファー内の0.1ミリモルの濃度に溶解し、標準的な曲線ストック溶液を作成します。10サンプルごとに、1x McIlvainバッファーの2.17ミリリットルをキチン基板の100マイクロリットルと混合して、作業溶液を作り、96ウェルプレートの各ウェルに95マイクロリットルの作業溶液を作ります。テストサンプルを5マイクロリットルずつ各ウェルに加え、作業溶液に混ぜます。プレートを覆い、5秒間振り、37°Cで15分間インキュベートして酵素反応を起こす。一方、4-メチルウンベリフェロンのストック溶液を希釈して5マイクロモル作動標準溶液を作り、原稿に従って一連の希釈を調製して標準曲線を作成する。5マイクロモル濃度から始め、各希釈をよく混ぜます。インキュベーション後、各ウェルに200マイクロリットルのストップバッファーを加えて反応を停止します。各規格の300マイクロリットルの複製を同じプレートに加え、360ナノメートルの励起と455ナノメートルの放出でプレートを読み取ります。このプロトコルは、野生型の気管支肺胞洗浄および血清液中のキチナーゼ活性と、トランスジェニックマウスを過剰発現するキトトリシダーゼの測定に成功した。このアッセイは、マウスにおけるCHIT-1遺伝子の過剰発現が、チチナーゼ活性の増加をもたらすことを確認する。サンプルの蛍光に基づいてキチナーゼを決定するために標準曲線を使用した。最初にプロトコルを試みる際に覚えておくべきことは、完全に混合しながら、できるだけ迅速かつ効率的にサンプルを追加することです。最初に開始する場合、インキュベーション期間が短いため、測定の精度を確保するために、1回の実行あたりのサンプル数を減らすことが有益な場合があります。

Research

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&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

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