Name: measurement of chitinase activity in biological samples
Uploaded: 2019-08-22T15:00:00
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Esta pesquisa foi apoiada pela American Lung Association e American Thoracic Society Awards para LS. Os autores sinceramente querem agradecer ao Dr. Jack Elias e Dr. Chun Geun Lee por fornecer cepas de camundongo transgênicos.

Todos os procedimentos animais foram realizados um protocolo aprovado pela IACUC na Yale University School of Medicine.
1. coleção de amostras de mouse
<ol><li>
Anesthetization
	<ol>
<li>Anestesie os camundongos com cetamina e xilazina (100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coleta de amostras de sangue
	<ol>
<li>Confirme a profundidade da anestesia por não-responsividade a uma pitada do dedo do pé.</li>
		<li>Abra cirurgi...

<ol>
	<li>Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinases:+An+update.">Chitinases: An update.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).</li><li>Sharma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+Role+of+Chitotriosidase+during+Lung+Infection+with+Klebsiella+pneumoniae.">Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).</li><li>Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chitotriosidase+(chitinase+1)+under+normal+and+disease+conditions.">Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions.</a> Journal of Epithelial Biology &#38; Pharmacology. 5, 1-9 (2012).</li><li>Lee, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Chitin+and+Chitinase/Chitinase-Like+Proteins+in+Inflammation,+Tissue+Remodeling,+and+Injury.">Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury.</a> Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).</li><li>Jeuniaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase:+An+Addition+to+the+List+of+Hydrolases+in+the+Digestive+Tract+of+Vertebrates.">Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates.</a> Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).</li><li>Boot, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Acidic+Mammalian+Chitinase+Distinct+from+Chitotriosidase.">Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).</li><li>Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+Recognition+via+Chitotriosidase+Promotes+Pathologic+Type-2+Helper+T+Cell+Responses+to+Cryptococcal+Infection.">Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701 (2015).</li><li>Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+Effects+of+Chitotriosidase+Enzyme.">Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme.</a> Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).</li><li>Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. 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A atividade da quitinase surgiu como um importante biomarcador para prever a severidade da doença, a progressão da doença, a efetividade terapêutica e a presença de patógenos específicos18. Embora muitas das teorias há muito postuladas sobre o papel das quitinases não tenham sido experimentalmente comprovadas19, novos estudos têm proporcionado importantes insights sobre o papel das quitinases e quitinase como proteínas em várias doenças2...

A quitina é o segundo polissacárido mais abundante na terra após a celulose, servindo como um componente estrutural importante de uma variedade de organismos, incluindo o exoesqueleto de insetos, fungos, leveduras e algas; alguns vertebrados também têm quitina1. Quitinases são uma família de enzimas que são capazes de quebrar a quitina e são altamente conservadas ao longo da evolução em espécies que variam de bactérias a mamíferos2,3. Além de quitinases, os mamíferos também têm quitinase-como proteínas que são semelhantes às quitinases em sua capacidade de ligar a quitina, mas diferem em que falta capacidade enzimática para Cleave a quitina4.
Embora a quitina e as quitinases tenham sido estudadas há muito tempo — com investigações que datam do início de 1900 — o foco principal tem sido o seu papel em insetos e outros invertebrados. Na verdade, não foi até a década de 1960, quando os vertebrados foram encontrados para ter quitinases em tudo. Usando um ensaio à base de quitobiase, as quitinases mostraram-se no trato digestivo de um número de vertebrados, incluindo lagartos e melros — uma observação hipotética para ser devido ao consumo de organismos contendo quitina, como insetos5 .
Os mamíferos têm duas formas enzimaticamente ativas de quitinase: quitinase de mamíferos ácidos (AMCase; também conhecida como CHIT2 e CHIA) e quitotriosidase (CHIT1)4. Ambas as proteínas são capazes de hidrolisando quitina. No entanto, CHIT1 é mais enzimaticamente ativo em seres humanos, onde quase toda a atividade de quitinase é derivada de CHIT1. 4 em camundongos, tanto o Chit1 quanto o amcase contribuem quase igualmente para a atividade geral da quitinase6. Por outro lado, as proteínas quitinase-like falta de atividade quitinase.
Chit1 é secretado principalmente por macrófagos e é muitas vezes considerado uma resposta imune aos patógenos contendo quitina7. A enzima também demonstrou estar envolvida na maturação dos monócitos nos subtipos de macrófago M1 e m2, mesmo sem a presença do substrato quitina8. Além disso, também pode estar envolvida na maturação de outras células imunes, incluindo células T auxiliares tipo 2 (Th2) e eosinófilos — como se mostrou ser o caso na infecção pulmonar criptocócica9. Estes estudos apontam para um papel complexo de quitinases no sistema imunológico.
Nos últimos anos, Chit1 níveis foram encontrados para servir como um importante biomarcador de progressão para mais de 40 diferentes doenças humanas, incluindo doenças de armazenamento lisossomal, doenças infecciosas, doenças respiratórias, doenças endocrinológicas, cardiovascular doenças neurológicas e outras (revistas10). Em muitas dessas doenças, os níveis de Chit1 são um forte preditor de severidade da doença e efetividade terapêutica10.
Como quitinases ganharam uma reputação como um biomarcador para inúmeras condições médicas, incluindo a doença de Gaucher, ferramentas e ensaios foram desenvolvidos para facilitar o teste para a presença de quitinase. Os métodos mais antigos incluem o procedimento de schales, um protocolo adaptado de um teste de glicose no sangue, e o método de ácido 3, 5 dinitrosalicílico (DNS). No entanto, esses métodos são muitas vezes sensíveis ao tempo e tecnicamente difícil11. O procedimento para ambos os testes exige a redução de oxidantes inorgânicos, ferricianeto no caso do schales ' procedimento por exemplo, produzindo uma mudança de cor que só pode ser medido espectrofotometricamente. Adicionalmente, ambos os testes envolvem um aquecimento ou uma etapa de ebulição que seja demorado e necessário para que a cor desenvolva12,13.
Descrito aqui é um ensaio fluimétrico rápido e simples para determinar os níveis de quitinase em amostras de mamíferos14,15. Duas das amostras utilizadas aqui incluem fluidos de lavagem de soro e broncoalveolar (LBA); a atividade da quitinase também foi mensurada em amostras de leite materno e urina, e a técnica pode ser realizada nessas amostras, bem como em qualquer outro fluido biológico16,17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1381</td>
			<td>Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4MU-GlcNAc2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9763</td>
			<td>fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4MU-GlcNAc3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5639</td>
			<td>fluorescent chitinase substrate for use in human samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid-monohydrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in McIlvain Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4xH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in McIlvain Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0224</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of chitinase activity in biological samples

As quitinases são as enzimas que cliam em quitina. Mesmo na ausência de quitina, os mammalianos têm quantidades significativas de quitinases presentes no corpo, incluindo no início do estudo. O papel preciso da quitinase não é conhecido, no entanto, acreditava-se que desempenham um papel importante na digestão e defesa do hospedeiro contra a quitina contendo alimentos e patógenos, respectivamente. O trabalho recente, incluindo o nosso, tem demonstrado um papel importante de quitinase e proteínas de quitinase-like na imunidade do hospedeiro e doenças alérgicas. É importante ressaltar que as atividades de quitinase servem como biomarcadores importantes da severidade da doença em uma ampla gama de doenças, incluindo doenças inflamatórias do tipo 2, como asma e fibrose pulmonar. Da mesma forma, pacientes com distúrbios genéticos como a doença de Gaucher têm níveis significativamente elevados de quitinase, que não só se correlacionam com a severidade da doença, mas também servem como um biomarcador confiável para efetividade terapêutica. O protocolo esboçado aqui descreve uma maneira simples, rápida, e direta de medir a atividade do quitinase no Bal ou em amostras do soro dos ratos e pode extensamente ser adaptado aos assuntos humanos e aos outros organismos modelo devido à natureza altamente conservada das enzimas.

Os resultados mostrados aqui são de um estudo que mede a atividade da quitinase em amostras do soro e do Bal do tipo selvagem (C57Bl/6) e de ratos transgênicas Chit1 (no fundo C57Bl/6) que sobre-expressão o gene Chit1 em um promotor do doxiciclina. Nossos dados mostram que as amostras do soro e do Bal têm a atividade detectável do quitinase na linha de base 698,2 ± 189,9 nmol/ml · h e 485,7 ± 114 nmol/ml · h, respectivamente. A superexpressão do gene Chit1 utilizando doxiciclina em água potável por 4 semanas ...

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Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

Aqui apresentamos um método simples para medir a atividade da quitinase em fluidos biológicos, como lavagem broncoalveolar ou soro.

Medição da atividade da quitinase em amostras biológicas

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Este método permite uma maneira mais eficaz de quantificar a atividade da chitinase em amostras biológicas. A atividade de chitinase tem se mostrado como um bom marcador para o diagnóstico e eficácia terapêutica em inúmeras condições e doenças. Os métodos anteriores para a medição da atividade de chitinase eram muitas vezes demorados e difíceis de realizar, ambos os problemas que foram resolvidos pelo ensaio aqui mostrado.Essa técnica ajudará a cumprir o potencial que as quitinases têm como marcador diagnóstico e terapêutico, facilitando a medição da atividade de chitinase;por exemplo, pode ser usada para monitorar o tratamento da doença de Gaucher, pois a atividade de chitinase tem se mostrado diminuída durante o tratamento eficaz. Comece preparando substratos, padrões e soluções para o ensaio. Prepare 1x tampão McIlvain de acordo com as instruções do manuscrito e use-o para diluir substratos de quittina a 500 micromolar cada.Dissolver 4-metilumbelliferone, o padrão, a uma concentração de 0,1 milimiliar no buffer de parada para criar uma solução padrão de estoque de curva. Para cada 10 amostras, misture 2,17 mililitros de 1x tampão McIlvain com 100 microlitres do substrato de quitina para criar uma solução de trabalho, depois pipeta 95 microliters da solução de trabalho em cada poço de uma placa de 96 poços. Adicione cinco microliters da amostra de ensaio a cada poço e misture-a na solução de trabalho.Cubra a placa e agite-a por cinco segundos, depois incubar a placa a 37 graus Celsius por 15 minutos para permitir que a reação enzimática ocorra. Enquanto isso, diluir a solução de estoque de 4-metilumbelliferone para fazer uma solução padrão de trabalho de cinco micromolares e criar uma curva padrão preparando uma série de diluições de acordo com o manuscrito. Comece com a concentração de cinco micromolares e misture bem cada diluição.Após a incubação, adicione 200 microliters de buffer stop a cada poço para parar a reação. Adicione duplicatas de 300 microliter de cada padrão à mesma placa, em seguida, leia a placa em uma excitação de 360 nanômetros e uma emissão de 455 nanômetros. Este protocolo foi usado com sucesso para medir a atividade de chitinase em lavagem broncoalveolar e fluido soro de tipo selvagem e camundongos transgênicos que expressam demais.O ensaio confirma que a superexpressão do gene CHIT-1 em camundongos resulta em aumento da atividade de chitinase. Uma curva padrão foi utilizada para determinar a quitinase com base na fluorescência das amostras. A coisa mais importante a ser lembrada ao tentar pela primeira vez o protocolo é adicionar as amostras o mais rápido e eficientemente possível enquanto ainda se mistura minuciosamente.Quando você começa, pode ser benéfico fazer menos amostras por corrida para garantir a precisão nas medições, devido a um período de incubação mais curto.

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