Name: measurement of chitinase activity in biological samples
Uploaded: 2019-08-22T15:00:00
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Esta investigación fue apoyada por la American Lung Association y los premios de la American Thoracic Society a LS. Los autores sinceramente quieren agradecer al Dr. Jack Elias y al Dr. Chun Geun Lee por proporcionar cepas de ratón transgénicas.

Todos los procedimientos de animales se realizaron bajo un protocolo aprobado por la IACUC en la Escuela de Medicina de la Universidad de Yale.
1. Colección de muestras de ratón
<ol><li>
Anestesia
	<ol>
<li>Anestetizar ratones usando ketamina y xilazina (100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recogida de muestras de sangre
	<ol>
<li>Confirme la profundidad de la anestesia por falta de respuesta a un pellizco del dedo del pie...

<ol>
	<li>Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinases:+An+update.">Chitinases: An update.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).</li><li>Sharma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+Role+of+Chitotriosidase+during+Lung+Infection+with+Klebsiella+pneumoniae.">Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).</li><li>Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chitotriosidase+(chitinase+1)+under+normal+and+disease+conditions.">Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions.</a> Journal of Epithelial Biology &#38; Pharmacology. 5, 1-9 (2012).</li><li>Lee, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Chitin+and+Chitinase/Chitinase-Like+Proteins+in+Inflammation,+Tissue+Remodeling,+and+Injury.">Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury.</a> Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).</li><li>Jeuniaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase:+An+Addition+to+the+List+of+Hydrolases+in+the+Digestive+Tract+of+Vertebrates.">Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates.</a> Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).</li><li>Boot, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Acidic+Mammalian+Chitinase+Distinct+from+Chitotriosidase.">Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).</li><li>Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitotriosidase+Deficiency:+A+Mutation+Update+in+an+African+Population.">Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population.</a> JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).</li><li>Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+CHI3L-1+and+CHIT-1+Expression+in+Differentiated+and+Polarized+Macrophages.">Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages.</a> Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).</li><li>Wiesner, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+Recognition+via+Chitotriosidase+Promotes+Pathologic+Type-2+Helper+T+Cell+Responses+to+Cryptococcal+Infection.">Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701 (2015).</li><li>Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+Effects+of+Chitotriosidase+Enzyme.">Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme.</a> Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).</li><li>Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast,+sensitive+and+easy+colorimetric+assay+for+chitinase+and+cellulase+activity+detection.">A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection.</a> Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).</li><li>Schales, O., Schales, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+the+determination+of+glucose+in+blood.">Simple method for the determination of glucose in blood.</a> Proc Am Fed Clin Res. 2, 78 (1945).</li><li>Zarei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Chitinase+with+Antifungal+Activity+from+a+Native+Serratia+Marcescens+B4A.">Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+Mammalian+Chitinase+in+Asthmatic+Th2+Inflammation+and+IL-13+Pathway+Activation.">Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation.</a> Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).</li><li>Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+elevation+of+plasma+chitotriosidase+activity.+A+novel+hallmark+of+Gaucher+disease.">Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).</li><li>Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitotriosidase+activity+in+colostrum+from+African+and+Caucasian+women.">Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).</li><li>Maddens, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase-like+Proteins+are+Candidate+Biomarkers+for+Sepsis-induced+Acute+Kidney+Injury.">Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury.</a> Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).</li><li>Hector, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase+activation+in+patients+with+fungus-associated+cystic+fibrosis+lung+disease.">Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).</li><li>Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., G&#246;tz, F., Falcone, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chitotriosidase+is+expressed+in+the+eye+and+lacrimal+gland+and+has+an+antimicrobial+spectrum+different+from+lysozyme.">Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme.</a> Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).</li><li>Kim, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMCase+is+a+crucial+regulator+of+type+2+immune+responses+to+inhaled+house+dust+mites.">AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).</li><li>Olkhovych, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitotriosidase+activity+as+additional+biomarker+in+the+diagnosis+of+lysosomal+storage+diseases.">Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases.</a> Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).</li><li>Bouayadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease:+An+Underdiagnosed+Pathology+in+the+Eastern+Moroccan+Population.">Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population.</a> eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).</li><li>Tasci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+serum+chitotriosidase+activity+in+early+treatment+of+patients+with+active+tuberculosis+and+a+negative+sputum+smear.">Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).</li><li>Barone, R., Simpor&#233;, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+chitotriosidase+activity+in+acute+Plasmodium+falciparum+malaria.">Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria.</a> Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).</li><li>Kitamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase+inhibition+promotes+atherosclerosis+in+hyperlipidemic+mice.">Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice.</a> American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).</li><li>Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Chitinases+and+Chitinase-Like+Proteins+as+Indicators+for+Infl+Ammation+and+Cancer.">Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer.</a> Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).</li></ol>

La actividad chitinasa ha surgido como un biomarcador importante para predecir la gravedad de la enfermedad, la progresión de la enfermedad, la eficacia terapéutica y la presencia de patógenos específicos18. Aunque muchas de las teorías de largo postulado sobre el papel de las chitinasis no han sido probadas experimentalmente19, nuevos estudios han proporcionado información importante sobre el papel de las chitinasis y las chitinasas como proteínas en varias enfermed...

La quitina es el segundo polisacárido más abundante en la tierra después de la celulosa, sirviendo como un componente estructural importante de una variedad de organismos incluyendo el exoesqueleto de insectos, hongos, levaduras y algas; algunos vertebrados también tienen quitina1. Las chitinasas son una familia de enzimas que son capaces de descomponer la quitina y están altamente conservadas a lo largo de la evolución en especies que van desde bacterias hasta mamíferos2,3. Además de las chitinasis, los mamíferos también tienen proteínas similares a las chitinasas que son similares a las chitinasas en su capacidad para unir la quitina pero difieren en que carecen de capacidad enzimática para cortar la quitina4.
Aunque la quitina y las chitinasis han sido estudiadas durante mucho tiempo, con investigaciones que se remontan a principios de 1900, el enfoque principal ha estado en su papel en insectos y otros invertebrados. De hecho, no fue hasta la década de 1960 cuando se encontró que los vertebrados tenían chitinasis en absoluto. Utilizando un ensayo a base de chitobiase, se demostró que las chitinasas se encuentran en el tracto digestivo de una serie de vertebrados, incluyendo lagartos y mirlos, una observación que se presume que se debe al consumo de organismos que contienen quitina como insectos5 .
Los mamíferos tienen dos formas enzimáticamente activas de chitinasa: chitinasa de mamíferoá ácida (AMCase; también conocida como CHIT2 y CHIA) y chitotriosidasa (CHIT1)4. Ambas proteínas son capaces de hidrolizar la quitina. Sin embargo, CHIT1 es más activo en los seres humanos, donde casi toda la actividad chitinasa se deriva de CHIT1. 4 En ratones, tanto Chit1 como AMCase contribuyen casi por igual a la actividad general de la chitinasa6. Por otro lado, las proteínas similares a la chitinasa carecen de actividad de la chitinasa.
Chit1 se secreta principalmente por macrófagos y a menudo se considera como una respuesta inmune a los patógenos que contienen quitina7. La enzima también ha demostrado estar implicada en la maduración de monocitos en los subtipos de macrófagos M1 y M2, incluso sin la presencia de la quitinadesustrato 8. Además, también puede estar involucrado en la maduración de otras células inmunitarias, incluyendo t helper tipo 2 (Th2) células y eosinófilos, como se demostró que era el caso en la infección pulmonar criptocócica9. Estos estudios apuntan a un papel complejo de las chitinasas en el sistema inmunológico.
En los últimos años, se ha encontrado que los niveles de Chit1 sirven como un importante biomarcador de progresión para más de 40 enfermedades humanas diferentes, incluyendo enfermedades de almacenamiento lisosomal, enfermedades infecciosas, enfermedades respiratorias, enfermedades endocrinológicas, enfermedades neurológicas y otras (revisadas10). En muchas de estas enfermedades, los niveles de Chit1 son un fuerte predictor de la gravedad de la enfermedad y la eficacia terapéutica10.
Como las chitinasis se han ganado una reputación como un biomarcador para numerosas condiciones médicas incluyendo la enfermedad de Gaucher, se han desarrollado herramientas y ensayos para facilitar las pruebas de presencia de chitinasa. Los métodos más antiguos incluyen el procedimiento de Schales, un protocolo adaptado de una prueba de glucosa en sangre y el método de ácido dinitrosalicílico 3,5 (DNS). Sin embargo, estos métodos son a menudo sensibles al tiempo y técnicamente difíciles11. El procedimiento para ambas pruebas requiere la reducción de oxidantes inorgánicos, ferricyanida en el caso del procedimiento de los Schales, por ejemplo, produciendo un cambio de color que sólo puede medirse espectrofotométricamente. Además, ambas pruebas implican un paso de calentamiento o ebullición que consume mucho tiempo y es necesario para que el color se desarrolle12,13.
Aquí se describe un ensayo fluorado rápido y simple para determinar los niveles de chitinasa en muestras de mamíferos14,15. Dos de las muestras utilizadas aquí incluyen suero y líquidos de lavado broncoalveolar (BAL); la actividad de la chitinasa también se ha medido en muestras de leche materna y orina, y la técnica se puede realizar en ese tipo de muestras, así como en cualquier otro fluido biológico16,17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1381</td>
			<td>Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4MU-GlcNAc2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9763</td>
			<td>fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4MU-GlcNAc3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5639</td>
			<td>fluorescent chitinase substrate for use in human samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid-monohydrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in McIlvain Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4xH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in McIlvain Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0224</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of chitinase activity in biological samples

Las chitinasas son las enzimas que se paran la quitina. Incluso en ausencia de quitina, los mamíferos tienen cantidades significativas de chitinasis presentes en el cuerpo, incluso al inicio. El papel preciso de la chitinasa no se conoce, sin embargo se creía que desempeña un papel importante en la digestión y la defensa del huésped contra los alimentos y patógenos que contienen quitina, respectivamente. El trabajo reciente, incluido el nuestro, ha demostrado un importante papel de las proteínas de chitinasa y las proteínas similares a las chitinasas en la inmunidad al huésped y las enfermedades alérgicas. Es importante destacar que las actividades de la chitinasa sirven como biomarcadores importantes de la gravedad de la enfermedad en una amplia gama de enfermedades, incluidas enfermedades inflamatorias de tipo 2 como el asma y la fibrosis pulmonar. Del mismo modo, los pacientes con trastornos genéticos como la enfermedad de Gaucher tienen niveles significativamente elevados de chitinasa, que no sólo se correlacionan con la gravedad de la enfermedad, sino que también sirven como un biomarcador fiable para la eficacia terapéutica. El protocolo descrito aquí describe una manera simple, rápida y directa de medir la actividad de la chitinasa en BAL o muestras séricas de ratones y puede ser ampliamente adaptado a sujetos humanos y otros organismos modelo debido a la naturaleza altamente conservada de las enzimas.

Los resultados mostrados aquí provienen de un estudio que mide la actividad de la chitinasa en muestras de suero y BAL de tipo silvestre (C57BL/6) y ratones transgénicos Chit1 (sobre fondo C57BL/6) que sobreexpresan el gen Chit1 en un promotor de doxiciclina. Nuestros datos muestran que tanto las muestras de suero como de BAL tienen una actividad de chitinasa detectable en la línea de base 698,2 a 189,9 nmol/mL-h y 485,7 a 114 nmol/ml-h, respectivamente. La sobreexpresión del gen Chit1 utilizando doxiciclina en el ag...

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Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

Aquí se presenta un método sencillo para medir la actividad de la chitinasa en fluidos biológicos como el lavado broncoalveolar o el suero.

Medición de la actividad de la chitinasa en muestras biológicas

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Este método permite una forma más eficaz de cuantificar la actividad de la chitinasa en muestras biológicas. Se ha demostrado que la actividad chitinasa sirve como un buen marcador para el diagnóstico y la eficacia terapéutica en numerosas condiciones y enfermedades. Los métodos anteriores para la medición de la actividad de la chitinasa eran a menudo lentos y difíciles de realizar, ambos problemas que han sido resueltos por el ensayo que se muestra aquí.Esta técnica ayudará a cumplir las posibles chitinasas tienen como marcador diagnóstico y terapéutico al facilitar la medición de la actividad de la chitinasa;por ejemplo, se puede utilizar para controlar el tratamiento de la enfermedad de Gaucher porque se ha demostrado que la actividad chitinasa disminuye durante el tratamiento eficaz. Comience preparando sustratos, estándares y soluciones para el ensayo. Prepare 1 tampón de McIlvain de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y utilícelo para diluir sustratos de quitina a 500 micromolares cada uno.Disolver 4-methylumbelliferone, el estándar, a una concentración de 0,1 milimolar en tampón de parada para crear una solución de stock de curva estándar. Por cada 10 muestras, mezcle 2,17 mililitros de 1x tampón de McIlvain con 100 microlitros del sustrato de quitina para crear una solución de trabajo, luego pipetee 95 microlitros de la solución de trabajo en cada pozo de una placa de 96 pozos. Agregue cinco microlitros de la muestra de prueba a cada pozo y mezcle en la solución de trabajo.Cubra el plato y agítelo durante cinco segundos, luego incuba la placa a 37 grados Celsius durante 15 minutos para permitir que la reacción enzimática tenga lugar. Mientras tanto, diluir la solución de stock de 4-methylumbelliferone para hacer una solución estándar de trabajo de cinco micromolares y crear una curva estándar mediante la preparación de una serie de diluciones según el manuscrito. Comience con la concentración de cinco micromolares y mezcle bien cada dilución.Después de la incubación, añadir 200 microlitros de tampón de parada a cada pocóltil para detener la reacción. Añadir duplicados de 300 microlitros de cada estándar a la misma placa, luego leer la placa en una excitación de 360 nanómetros y una emisión de 455 nanómetros. Este protocolo se utilizó con éxito para medir la actividad de la cintinasa en el lavado broncoalveolar y el líquido sérico de tipo salvaje y chitotriosidasa sobre-expresar ratones transgénicos.El ensayo confirma que la sobreexpresión del gen CHIT-1 en ratones da lugar a un aumento de la actividad de la chitinasa. Se utilizó una curva estándar para determinar la chitinasa basándose en la fluorescencia de las muestras. Lo más importante a recordar al intentar el protocolo por primera vez es agregar las muestras de la forma más rápida y eficiente posible mientras se mezcla a fondo.Cuando comience, puede ser beneficioso hacer menos muestras por carrera para garantizar la precisión en las mediciones, debido a un período de incubación más corto.

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