Name: measurement of chitinase activity in biological samples
Uploaded: 2019-08-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples at JoVE.com

Bu araştırma Amerikan Akciğer Derneği ve Amerikan Toraks Derneği ls ödülleri tarafından desteklenmiştir. Yazarlar içtenlikle Transgenik fare suşları sağlamak için Dr Jack Elias ve Dr Chun Geun Lee teşekkür etmek istiyorum.

Tüm hayvan işlemleri Yale Üniversitesi Tıp Fakültesi'nde IACUC onaylı bir protokol altında gerçekleştirildi.
1. Fare Örnek Toplama
<ol><li>
Anestezi
	<ol>
<li>Ketamin ve ksilazin kullanarak fareler anestezik (ketamin 100 mg / kg ve ksilazin 10 mg / kg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kan örneği toplama
	<ol>
<li>Anestezinin derinliğini bir parmak ucuna yanıt vermeyen bir şekilde onaylayın.</li>
		<li>Cerrahi kalp ortaya çıkarmak için göğüs bo?...

<ol>
	<li>Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinases:+An+update.">Chitinases: An update.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).</li><li>Sharma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+Role+of+Chitotriosidase+during+Lung+Infection+with+Klebsiella+pneumoniae.">Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae.</a> Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).</li><li>Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+chitotriosidase+(chitinase+1)+under+normal+and+disease+conditions.">Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions.</a> Journal of Epithelial Biology &#38; Pharmacology. 5, 1-9 (2012).</li><li>Lee, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Chitin+and+Chitinase/Chitinase-Like+Proteins+in+Inflammation,+Tissue+Remodeling,+and+Injury.">Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury.</a> Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).</li><li>Jeuniaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase:+An+Addition+to+the+List+of+Hydrolases+in+the+Digestive+Tract+of+Vertebrates.">Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates.</a> Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).</li><li>Boot, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Acidic+Mammalian+Chitinase+Distinct+from+Chitotriosidase.">Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).</li><li>Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitotriosidase+Deficiency:+A+Mutation+Update+in+an+African+Population.">Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population.</a> JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).</li><li>Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+CHI3L-1+and+CHIT-1+Expression+in+Differentiated+and+Polarized+Macrophages.">Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages.</a> Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).</li><li>Wiesner, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitin+Recognition+via+Chitotriosidase+Promotes+Pathologic+Type-2+Helper+T+Cell+Responses+to+Cryptococcal+Infection.">Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701 (2015).</li><li>Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+Effects+of+Chitotriosidase+Enzyme.">Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme.</a> Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).</li><li>Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast,+sensitive+and+easy+colorimetric+assay+for+chitinase+and+cellulase+activity+detection.">A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection.</a> Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).</li><li>Schales, O., Schales, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+method+for+the+determination+of+glucose+in+blood.">Simple method for the determination of glucose in blood.</a> Proc Am Fed Clin Res. 2, 78 (1945).</li><li>Zarei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Chitinase+with+Antifungal+Activity+from+a+Native+Serratia+Marcescens+B4A.">Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A.</a> Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).</li><li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+Mammalian+Chitinase+in+Asthmatic+Th2+Inflammation+and+IL-13+Pathway+Activation.">Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation.</a> Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).</li><li>Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marked+elevation+of+plasma+chitotriosidase+activity.+A+novel+hallmark+of+Gaucher+disease.">Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).</li><li>Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitotriosidase+activity+in+colostrum+from+African+and+Caucasian+women.">Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).</li><li>Maddens, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase-like+Proteins+are+Candidate+Biomarkers+for+Sepsis-induced+Acute+Kidney+Injury.">Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury.</a> Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).</li><li>Hector, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase+activation+in+patients+with+fungus-associated+cystic+fibrosis+lung+disease.">Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).</li><li>Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., G&#246;tz, F., Falcone, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chitotriosidase+is+expressed+in+the+eye+and+lacrimal+gland+and+has+an+antimicrobial+spectrum+different+from+lysozyme.">Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme.</a> Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).</li><li>Kim, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMCase+is+a+crucial+regulator+of+type+2+immune+responses+to+inhaled+house+dust+mites.">AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).</li><li>Olkhovych, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitotriosidase+activity+as+additional+biomarker+in+the+diagnosis+of+lysosomal+storage+diseases.">Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases.</a> Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).</li><li>Bouayadi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease:+An+Underdiagnosed+Pathology+in+the+Eastern+Moroccan+Population.">Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population.</a> eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).</li><li>Tasci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+serum+chitotriosidase+activity+in+early+treatment+of+patients+with+active+tuberculosis+and+a+negative+sputum+smear.">Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear.</a> Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).</li><li>Barone, R., Simpor&#233;, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+chitotriosidase+activity+in+acute+Plasmodium+falciparum+malaria.">Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria.</a> Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).</li><li>Kitamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitinase+inhibition+promotes+atherosclerosis+in+hyperlipidemic+mice.">Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice.</a> American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).</li><li>Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Chitinases+and+Chitinase-Like+Proteins+as+Indicators+for+Infl+Ammation+and+Cancer.">Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer.</a> Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).</li></ol>

Kitinaz aktivitesi hastalığın şiddetini, hastalığın ilerlemesini, terapötik etkinliğini ve spesifik patojenlerin varlığını tahmin etmek için önemli bir biyobelirteç olarak ortaya çıkmıştır18. Chitinases rolü hakkında uzun postulated teorilerin çoğu deneysel olarak kanıtlanmamıştır rağmen19, Yeni çalışmalar çeşitli hastalıklarda proteinler gibi chitinases ve kitinaz rolü içine önemli bilgiler sağlamıştır2<sup...

Chitin selüloz sonra yeryüzünde ikinci en bol polisakkarit, böceklerin dış iskelet ilerlerken dahil olmak üzere organizmaların çeşitli önemli bir yapısal bileşeni olarak hizmet vermektedir, mantarlar, maya, ve yosun; bazı omurgalılar da chitin1var. Chitinases kitin yıkmak yeteneğine sahip enzimler bir aile ve son derece bakterilerden memelilere kadar türlerde evrim boyunca korunur2,3. Chitinases ek olarak, memeliler de chitin bağlamak için yeteneklerini chitinases benzer ama onlar chitin cleave enzimatik yeteneği eksikliği farklı olan kitinaz benzeri proteinler var4.
Her ne kadar chitin ve chitinases uzun incelenmiş olsa da-1900'lerin başına kadar uzanan araştırmalar ile-ana odak böcekler ve diğer omurgasızlar rollerini olmuştur. Aslında, 1960'lara kadar omurgalıların chitinases olduğu tespit edildi. Chitobiare bazlı bir test kullanılarak, kitinazların kertenkeleler ve karakuşlar da dahil olmak üzere omurgalıların sindirim sisteminde bulunduğu gösterilmiştir— bu gözlem, böcekler gibi kitin içeren organizmaların tüketimine bağlı olduğu varsayımına yol açtı5 .
Memelilerin iki enzimatik aktif kromozom formu vardır: asidik memeli kitinaz (AMCase; chit2 ve CHIA olarak da bilinir) ve kitotriosidaz (CHIT1)4. Bu proteinlerin her ikisi de kitin hidrolize yeteneğine sahiptir. Ancak, CHIT1 insanlarda daha enzimatik olarak aktiftir, hemen hemen tüm kitinaz aktivitesi CHIT1 türetilmiştir. 4 Farelerde, hem Chit1 hem de AMCase neredeyse eşitgenel kitinaz aktivitesine katkıda 6. Öte yandan, kitinaz benzeri proteinlerde kitinaz aktivitesi yok.
Chit1 esas olarak makrofajlar tarafından salgılanır ve genellikle chitin içeren patojenlere karşı bağışıklık yanıtı olarak kabul edilir7. Enzim ayrıca substrat kitinvarlığıolmadan bile, hem M1 ve M2 makrofaj alt tipleri içine monositlerin olgunlaşmadahil olduğu gösterilmiştir 8 . Ayrıca, aynı zamanda T yardımcı tip 2 de dahil olmak üzere diğer bağışıklık hücrelerinin olgunlaşma dahil olabilir (Th2) hücreleri ve eozinofiller—kriptokok akciğerenfeksiyonu9 durumda olduğu gösterilmiştir . Bu çalışmalar bağışıklık sisteminde chitinases karmaşık bir rolüne işaret.
Son yıllarda, Chit1 düzeyleri lisozomal depolama hastalıkları, bulaşıcı hastalıklar, solunum yolu hastalıkları, endokrinolojik hastalıklar, kardiyovasküler dahil olmak üzere 40'tan fazla farklı insan hastalığı için ilerleme önemli bir biyomarker olarak hizmet bulunmuştur hastalıklar, nörolojik hastalıklar vediğerleri (gözden 10). Bu hastalıkların çoğunda, Chit1 düzeyleri hastalığın şiddeti ve terapötik etkinliğigüçlübir belirleyici 10 vardır.
Chitinases Gaucher Hastalığı da dahil olmak üzere çok sayıda tıbbi durumlar için bir biyomarker olarak ün kazanmıştır gibi, araçlar ve tahliller chitinaz varlığı için test kolaylaştırmak için geliştirilmiştir. Eski yöntemler arasında Schales'in prosedürü, kan şekeri testinden uyarlanmış bir protokol ve 3,5 dinitrosalislik asit (DNS) yöntemi sayılabilir. Ancak, bu yöntemler genellikle zaman duyarlı ve teknik olarak zor11. Bu testlerin her ikisi için de prosedür inorganik oksidanların azaltılmasını gerektirir, örneğin Schales prosedürü durumunda ferricyanide, sadece spektrofotometrik olarak ölçülebilen bir renk değişikliği üreten. Ayrıca, her iki test de zaman alıcı ve renk12geliştirmekiçin gerekli bir ısıtma veya kaynama adım içerir 13 .
Burada açıklanan memeli örneklerinde kitinaz düzeylerini belirlemek için hızlı ve basit bir florimetrik test14,15. Burada kullanılan örneklerden ikisi serum ve bronkoalveoler lavaj sıvıları (BAL); kitinaz aktivitesi de anne sütü ve idrar örneklerinde ölçüldü ve teknik bu tür örneklerde yanı sıra diğer biyolojik sıvı16,17yapılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1381</td>
			<td>Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4MU-GlcNAc2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9763</td>
			<td>fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4MU-GlcNAc3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5639</td>
			<td>fluorescent chitinase substrate for use in human samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid-monohydrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in McIlvain Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4xH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in McIlvain Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4ti-0224</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of chitinase activity in biological samples

Chitinases kitin cleave enzimleridir. Hatta kitin yokluğunda, memeliler bazada da dahil olmak üzere vücutta mevcut chitinases önemli miktarda var. Konitinazın kesin rolü bilinmemektedir, ancak sırasıyla kitin içeren gıda ve patojenlere karşı sindirim ve konak savunmaönemli bir rol oynadığına inanılmaktadır. Son çalışmalar, bizim de dahil olmak üzere, konak bağışıklık ve alerjik hastalıklarda konitinaz ve konitinaz benzeri proteinlerin önemli bir rol göstermiştir. Daha da önemlisi, kitinaz aktiviteleri astım ve pulmoner fibrozis gibi tip 2 inflamatuar hastalıklar da dahil olmak üzere çok çeşitli hastalıklarda hastalık şiddetinin önemli biyobelirteçleri olarak hizmet vermektedir. Benzer şekilde, Gaucher hastalığı gibi genetik bozuklukları olan hastalar önemli ölçüde yüksek kitinaz düzeyleri var, hangi sadece hastalığın şiddeti ile ilişkili değil, aynı zamanda terapötik etkinliği için güvenilir bir biyomarker olarak hizmet vermektedir. Burada özetlenen protokol, BAL veya fare lerin serum örneklerindeki kitinaz aktivitesini ölçmenin basit, hızlı ve basit bir yolunu açıklar ve enzimlerin yüksek derecede korunmuş doğası nedeniyle insan deneklere ve diğer model organizmalara yaygın olarak adapte edilebilir.

Burada gösterilen sonuçlar, yabani tip (C57BL/6) ve Chit1 transgenik farelerin (C57BL/6 arka planda) serum ve BAL örneklerinde (C57BL/6 arka planda) kitinaz aktivitesini ölçen ve Chit1 genini doksisiklin promotöründe aşırı eksprese eden bir çalışmadan elde edilebilmektedir. Verilerimiz hem serum hem de BAL örneklerinin bazal 698.2 ± 189.9 nmol/mL·h ve 485.7 ± 114 nmol/ml·h'de saptanabilir kitinaz aktivitesine sahip olduğunu göstermektedir. 4 hafta boyunca içme suyunda doksisiklin kullanılarak Chit1 ...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples at JoVE.com

Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples

Burada bronkoalveolar lavaj veya serum gibi biyolojik sıvılarda kitinaz aktivitesini ölçmek için basit bir yöntemdir.

Biyolojik Örneklerde Konitinaz Aktivitesinin Ölçülmesi

Chitinases are the enzymes that cleave chitin. Even in the absence of chitin, mammalians have significant amounts of chitinases present in the body ...

Bu yöntem biyolojik numunelerde kitinaz aktivitesini ölçmek için daha etkili bir yol sağlar. Kitinaz aktivitesi çok sayıda durum ve hastalıklarda tanı ve terapötik etkinlik için iyi bir belirteç olarak hizmet ettiği gösterilmiştir. Kitinaz aktivitesinin ölçümü için daha önceki yöntemler genellikle zaman alıcı ve gerçekleştirmek zor, burada gösterilen tsurça tarafından çözülmüş olan her iki sorun.Bu teknik, kitinaz aktivitesinin ölçülmesini kolaylaştırarak tanısal ve terapötik belirteç olarak sahip oldukları potansiyel chitinas'ın yerine getirilmesine yardımcı olacaktır;örneğin, etkili tedavi sırasında şitinaz aktivitesinin azaldığı gösterilmiştir, çünkü Gaucher hastalığının tedavisini izlemek için kullanılabilir. Tayiyiz için yüzeyler, standartlar ve çözümler hazırlayarak başlayın. El yazması yönlere göre 1x McIlvain tampon hazırlayın ve her biri 500 mikromolar için chitin yüzeyleri seyreltmek için kullanabilirsiniz.Standart bir eğri stok çözeltisi oluşturmak için dur tamponunda 0,1 milimolar konsantrasyona 4-methylumbelliferone, standart çözünür. Her 10 örnek için, 2,17 mililitre 1x McIlvain tamponu ile 100 mikrolitre chitin substratını karıştırarak bir çalışma çözümü, ardından 96 kuyulu bir plakanın her kuyunun içine çalışan çözeltinin 95 mikrolitrepipe'ı yerleştirin. Her kuyuya test numunesinin beş mikrolitresini ekleyin ve çalışma çözeltisine karıştırın.Plakayı kapatın ve beş saniye sallayın, sonra enzimatik reaksiyonun gerçekleşmesini sağlamak için 37 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. Bu arada, beş mikromolar çalışma standart çözüm yapmak ve el yazmasına göre seyreltme bir dizi seyreltme hazırlayarak standart bir eğri oluşturmak için 4-methylumbelliferone stok çözeltisi seyreltmek. Beş mikromolar konsantrasyonu ile başlayın ve iyi her seyreltme karıştırın.Kuluçkadan sonra, reaksiyonu durdurmak için her kuyuya 200 mikrolitre dur tamponu ekleyin. Aynı plakaya her standart 300 mikrolitre kopyaları ekleyin, sonra 360 nanometre bir uyarma ve 455 nanometre bir emisyon plaka okuyun. Bu protokol bronkoalveoler lavaj ve yabani tip ve chitotriosidaz aşırı ifade transgenik fareler serum sıvısında kitiyolaktiviteölçmek için başarıyla kullanılmıştır.Taht, farelerde CHIT-1 geninin aşırı ekspresyonunun kitinaz aktivitesinin artmasına neden olduğunu doğrular. Örneklerin floresansına göre konitinazı belirlemek için standart bir eğri kullanılmıştır. Protokolü ilk çalışırken hatırlanması gereken en önemli şey, numuneleri mümkün olduğunca hızlı ve verimli bir şekilde eklerken, tam olarak karıştırmaktır.İlk başladığınızda, daha kısa kuluçka süresi nedeniyle ölçümlerde doğruluğu sağlamak için her çalıştırma da daha az numune yapmak yararlı olabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Sitosolik Ca ölçümü 2 + İzole Kontraktil Lenfatikler

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

Measurement of ÃƒÅ½Ã‚Â³HV68 Infection in Mice

Farelerde γHV68 Enfeksiyon ölçümü

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Klinik Antikor Örnekleri fagositik Aktivitesi Belirlenmesi

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Bir Mikroplaka Pıhtılaşma Analiz Kullanarak İnsan Plazma Faktör V Aktivitenin Ölçümü

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ixodes scapularis Keneler gelen tükürük, Tükürük Bezi ve hemolimf Koleksiyonu

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â² in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Aktivasyon ve İnsan monosit türevli dendritik hücreler, IL-1β kullanarak NLRP3 Inflammasome Aktivitenin Ölçümü

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

Kullanımı Çevre Örneklerinde Yeni Faustoviruses İzolasyonunda bir Hızlı Stratejisi<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

Lökosit zenginleştirilmiş Kan Örneklerinde Halojenleyici Peroksidaz Faaliyet Hızlı ve Özgül Değerlendirme

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

Ölçümü<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV-1 Preintegration Kompleksleri Entegrasyon Etkinliği

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...