Name: an ectopic chemokine expression model for testing macrophage recruitment in vivo
Uploaded: 2019-09-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo at JoVE.com

نشكر الدكتور جينغرونغ بنغ لتقاسم Tg (fabp10a: DsRed) خط المعدلة وراثيا; الدكتور زيلونغ ون لتقاسم TG (mpeg1: GFP) خطوط المعدلة وراثيا؛ د. كويتشي كاواكامي لتوفير متجه pTol2. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31771594)، ومشاريع خطة قوانغدونغ للعلوم والتكنولوجيا (2019A030317001) وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (D2191450).

ملاحظة: تم علاج جميع العينات بواسطة فينيلثيويوريا (PTU) ماء البيض لمنع الصباغ.
1. توليد TG (fabp10a: il34)المنشآت المعدلة وراثيا وحقن الأسماك
<ol><li>استنساخ 2.8 كيلو بايت fabp10a المروج8 ومناطق الترميز IL-34 (ENSDART00000126460.3) من حمار وحشي في ناقلات pTol2 لتوليد بنا...

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-34+is+a+tissue-restricted+ligand+of+CSF1R+required+for+the+development+of+Langerhans+cells+and+microglia.">IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia.</a> Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).</li><li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+cytokine+and+its+receptor+by+functional+screening+of+the+extracellular+proteome.">Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome.</a> Science. 320 (5877), 807-811 (2008).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+overlap+but+differential+expression+of+CSF-1+and+IL-34+in+their+CSF-1+receptor-mediated+regulation+of+myeloid+cells.">Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells.</a> Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).</li><li>Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-34+Induces+the+Differentiation+of+Human+Monocytes+into+Immunosuppressive+Macrophages.+Antagonistic+Effects+of+GM-CSF+and+IFNc.">IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc.</a> PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan-1+regulates+the+biological+activities+of+interleukin-34.">Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).</li><li>Zhou, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-28-5p-IL-34-macrophage+feedback+loop+modulates+hepatocellular+carcinoma+metastasis.">miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis.</a> Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).</li><li>Gordon, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+expression+and+developmental+regulation+of+two+genes+coding+for+rat+fatty+acid+binding+proteins.">Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: a practical approach. , (2002).</li><li>Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopically+Expressed+IL-34+Can+Efficiently+Induce+Macrophage+Migration+to+the+Liver+in+Zebrafish.">Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).</li></ol>

البروتوكول الموضح هنا يسمح لنا للتحقيق في وظيفة chemokine على سلوك الجسم الحي الضامة والإجراء يتطلب بعض الخبرة التقنية. وباختصار، هناك عدة خطوات حاسمة لتجنب المضاعفات في البروتوكول: 1) اختيار خط مناسب وراثيا الذي يظهر إشارة محددة وقوية المعدلة وراثيا لتسمية الخلية ذات الأهمية؛ (2) اختيار خط من?...

سمك الحمار الوحشي هو صغير الاستوائية الصلبة العظام أسماك المياه العذبة نشأت في الهند. وفيما يتعلق بحفظ الجينات، حمار وحشي لديها تشابه من 87٪ إلى الإنسان1. يمكن أن توفر لنا رؤى حول المواضيع ذات الصلة من الإنسان من خلال دراسة تنظيم الجينات، وظيفة البروتين وسلوك الخلية مثل الهجرة، et.al الانتشار في حمار وحشي. يمكن استخدام جنين سمك الحمار الوحشي لمراقبة تطور الأجنة المبكرة في مراحل مختلفة بعد تثبيط الصباغ. وفي الوقت نفسه، فإنه يأخذ ثلاثة أشهر فقط لحمار وحشي لتطوير إلى النضج الجنسي، ثم حمار وحشي يمكن أن تنتج مئات من البيض كل 4 أيام. صغيرة الحجم، وتربية بسيطة، والقدرة الإنجابية القوية، وهذه المزايا تجعل ثقافة حمار وحشي جدا توفير الفضاء، مما يؤدي إلى ثقافة واسعة النطاق. الماوس نموذج الثدييات التقليدية لديها تكاليف صيانة أعلى من حمار وحشي، وبالتالي الحد من حجم رفع الماوس. في جانب نمو الجنين المبكر ، من الصعب ملاحظة جنين الفأر في حالة حية بسبب خصائص نمو جنين الفئران في رحم الأم. على العكس من ذلك، تتطور أجنة حمار وحشي خارجيا ً وتتسم بالشفافية، وبالتالي يسهل ملاحظتها تحت المجهر. وعلاوة على ذلك، من السهل جدا بناء مجموعة متنوعة من الخطوط المعدلة وراثيا للبحوث ذات الصلة وظيفة الجينات. حاليا، تتوفر خطوط مختلفة من أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثيا لتسمية أنواع مختلفة من الخلايا. فمن المريح جدا الآن لبناء خطوط المعدلة وراثيا لالإفراط في التعبير عن العلاج الكيميائي في مواقع محددة ودراسة وظيفة chemokines على سلوك الخلية في حمار وحشي.
هنا، قدمنا سير العمل لاستخدام حمار وحشي خط المعدلة وراثيا للتحقيق في وظيفة IL-34 على سلوك الضامة في الجسم الحي2،3،4،5،6،7. أولا، قمنا ببناء بلازميد الإفراط في التعبير عن الكبد محددة من الجينات il34 وحقن بلازميد في مرحلة خلية واحدة TG (mpeg1: GFP) أجنة الأسماك التي وصفت على وجه التحديد الضامة من قبل GFP البروتين الفلورسنت. ثم، استخدمنا جبل كامل الفلورسنت في الموقع التهجين وتلطيخ المناعة للكشف عن نمط التعبير il34 وعدد أو موقع الضامة. تم رفع الأجنة WT حقن لتوليد خط مستقر المعدلة وراثيا. في هذه الخطوات، أنشأنا والتحقق من صحة خط إنتاج السيتوكين وتقييم بصريا الآثار التي يمكن رؤيتها على توزيع الضامة. وأخيرا، للتحقيق في سلوك الضامة ردا على السيتوكين، استخدمنا التصوير الحي البؤري لمراقبة مباشرة هجرة الضامة لتأكيد وظيفة il34 على هجرة الضامة في الجسم الحي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-Anti-Goat antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-HRP&#160;</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEF832001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183; 2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3 Plus Amplification Reagent</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E2 solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mM&#160; NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 &#181;M&#160; KH2PO4 + 50 &#181;M&#160; Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum(FBS)</td>
			<td>Life</td>
			<td>10099-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>A100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridization buffer(HB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide+ 5&#215;SSC+9 mM sodium citrate+50 &#956;g/ml heparin sodium+ 500 &#956;g/ml tRNA+ 0.1% Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>1.17112.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 &#176;C&#160; to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 &#176;C. Caution. Manipulate with mask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea(PTU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Plus Amplification Diluent</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>E00492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215;Saline sodium citrate(SSC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBLK-fabp10a-il34-sv40</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSK-il34</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For il34 probe preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (mpeg1: GFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Label macrophages with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fabp10a: DsRed)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Label liver cells with DsRed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fab10a:il34)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Over-expression IL-34 in liver cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ectopic chemokine expression model for testing macrophage recruitment in vivo

وتستخدم على نطاق واسع حمار وحشي في البحوث الأساسية والطبية الحيوية. العديد من خطوط حمار وحشي المعدلة وراثيا متاحة حاليا لتسمية أنواع مختلفة من الخلايا. بسبب الجسم الجنيني الشفاف من سمك الحمار الوحشي ، فمن المناسب بالنسبة لنا لدراسة تأثير واحد chemokine على سلوك نوع معين من الخلايا في الجسم الحي. هنا قدمنا سير العمل للتحقيق في وظيفة chemokine على هجرة الضامة في الجسم الحي. قمنا ببناء بلازميد الإفراط في التعبير الأنسجة الخاصة لالإفراط في التعبير IL-34 وحقن بلازميد في مرحلة خلية واحدة أجنة الأسماك المعدلة وراثيا التي وصفت الضامة على وجه التحديد من قبل بروتين الفلورسنت. ثم استخدمنا جبل كامل الفلورسنت في الموقع التهجين والمناعية للكشف عن نمط التعبير chemokine وعدد أو موقع الضامة. تم رفع الأجنة WT حقن لتوليد خط مستقر المعدلة وراثيا. وأخيرا، استخدمنا التصوير الحي البؤري لمراقبة سلوك الضامة مباشرة في الأسماك المعدلة وراثيا مستقرة لدراسة وظيفة IL-34 على الضامة في الجسم الحي.

ويبين الشكل 2الخطوات التي ينطوي عليها بروتوكول سمك الحمار الوحشي. أولا، قمنا بإنشاء pBLK-fabp10a-il34-sv40 الذي كان يقودها il34 من قبل المروج fabp10a (الشكل 2). تم حقن البناء ميكروين في مرحلة خلية واحدة Tg (mpeg1: GFP)أجنة حمار وحشي التي يمكن ت...

Watch this Scientific Journal Video about An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo at JoVE.com

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

لاختبار تأثير chemokine على تجنيد الضامة في الجسم الحي، تم استخدام جبل كامل في الموقع التهجين للكشف عن التعبير خارج الرحم من chemokine، واستخدمت تلطيخ المناعة لتسمية الضامة. تم استخدام التصوير الحي للمراقبة في الوقت الحقيقي لهجرة الضامة.

نموذج تعبير كيميائي خارج الرحم لاختبار توظيف الضامة في فيفو

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

البروتوكول الموصوف هنا يسمح لنا بالتحقيق في وظيفة chemokine وسلوك الضامة في الجسم الحي. وتستند معظم النماذج التجريبية الموجودة من chemotaxis الخلية على تجارب الخلايا في المختبر. ولكن التجارب في المختبر في بعض الأحيان بسيطة جداً لنميث البيئة المعقدة في الجسم الحي.أيضا، فإنها قد لا تمثل القدرة على العلاج الكيميائي في الجسم الحي. هذه الأساليب تستخدم ميزة محددة من الأسماك حمار وحشي لمراقبة سلوك الخلية مباشرة، وهو أمر صعب بالنسبة للفئران. ابدأ بتوليد 10A interleukin-34 الانشاءات المعدلة وراثيا.حقن FABP-10A إنترلوكين-34 يبني في مرحلة واحدة خلية Tg (mpeg1:GFP) المعدلة وراثيا وأجنة الأسماك من نوع البرية جنبا إلى جنب مع MRNA transposase. رفع وجمع الأجنة وفقا لتعليمات المخطوطات. ثم، إصلاح لهم مع 4٪ شبهformaldehyde بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.بعد التثبيت، وغسل الأجنة مع PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسل. يجفف الأجنة بشكل منفصل مع 50٪ من الميثانول في PBST ، يليه 100٪ من الميثانول ، ثم يتغير إلى ميثانول جديد بنسبة 100٪، ويخزنها عند درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل. عندما تكون جاهزة للتهجين التحقيق، إعادة هيدرات الأجنة بشكل منفصل في 50٪ الميثانول في PBST.ثم، وغسلها مع PBST ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل غسل. اهضم الأجنة بالبروتينات K في PBST في درجة حرارة الغرفة. ثم، والتخلص من حل الهضم، وتكرار التثبيت مع 4٪ شبهformaldehyde لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد التثبيت، وغسل الأجنة مرتين مع PBST لمدة 10 دقيقة لكل غسل. تنفيذ prehybridization مع العازلة التهجين ساخنة في 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. ثم، سخني مسبار إنترلوكين-34 إلى 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.إعادة تدوير العازلة التهجين في أنبوب الأصلي وتنفيذ التهجين مع مسبار مسخن في 65 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، قم بغسل الأجنة بنسبة 50٪ و2X SSCT متبوعة بـ 2X SSCT ثم 0.2x SSCT عند 65 درجة مئوية. كرر كل غسل ثلاث مرات مع 20 دقيقة لكل غسل.ثم، غسل الأجنة ثلاث مرات مع PBST لمدة خمس دقائق لكل غسل. منع العينات مع 600 ملليلتر من العازلة حظر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم، إضافة 400 ميكرولترات من المضادة للأجسام المضادة للحفر digoxigenin حل واحتضان الأجنة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.في اليوم التالي، قم بإزالة الجسم المضاد وغسل الأجنة ست مرات مع PBST لمدة 20 دقيقة لكل غسل. بعد الغسيل الأخير، شطف كل عينة مع 30 ميكرولترات من 1X بالإضافة إلى diluent التضخيم لمدة خمس دقائق. احتضان العينات في محلول الثيامين الفلوروفور لمدة خمس إلى 15 دقيقة في الظلام.تمديد فترة الحضانة إلى 30 دقيقة إذا كانت الإشارات ضعيفة. ثم، غسل الأجنة مع PBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل غسل. واحتضانهم مع الأجسام المضادة الأولية في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.في اليوم التالي، يغسل الأجنة خمس مرات مع PBST لمدة 30 دقيقة لكل غسل، واحتضان لهم مع الأجسام المضادة الثانوية في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وغسل الأجنة ثلاث مرات في PBST لمدة 10 دقائق لكل غسل، وتخزينها في 70٪ الجلسرين في الظلام في أربع درجات مئوية أو سلبية 20 درجة مئوية لفترة أطول. قبل التصوير، استخدم مجهر الفلوريسين لتحديد الأجنة الإيجابية المزدوجة الحمراء وGFP.لتركيب الأسماك، واستخدام حمام معدني لتسخين ملليلتر واحد من 1٪ ذوبان agarose منخفضة إلى أكثر من 90 درجة مئوية. ثم، تبريده لدرجة حرارة الجسم ومزيج في 50 ميكرولترات من 0.2٪ tricaine. نقل الأجنة تخدير إلى طبق صغير مثبت مع شريحة غطاء على الجزء السفلي.إزالة المياه المحيطة بها وإسقاط ببطء agarose ذوبان منخفضة على الأجنة. تعيين بعناية موقف الأسماك قبل أن تتوطد agarose، والحفاظ على منطقة الكبد قريبة من الشريحة الغطاء. بمجرد أن تتوطد agarose ، وتغطي بعناية مع طبقة أخرى من agarose لتعزيز ذلك.ضع الطبق على طاولة الناقل المجهر confocal، وتغطية الأسماك مع حل E2 مع tricaine، وبدء التصوير. لتشغيل المجهر confocal، افتح برنامج Zen Black 2.3 وانقر فوق تحديد موقع، ثم الحضانة، ثم قم بتعيين درجة الحرارة إلى 29 درجة مئوية. انقر على قائمة الامتلاك وحدد وضع المسح الضوئي المطلوب وأشعة الليزر في قائمة الإعداد الذكية.ثم حدد Z-المكدس والموضع. انقر على قائمة المصمم التجريبية وحدد تمكين تجربة كتلة متعددة في الكتلة الأولى للعثور على العينة تحت التكبير منخفضة. ثم قم بالتبديل إلى التكبير العالي والسماح للمنطقة الملاحظة في وسط المجال المرئي.تعيين الموقع وZ-المكدس المعلومات. ثم حدد كثافة الليزر المناسبة، وطبقات المسح الضوئي، وسرعة التصوير. مرة واحدة يتم إعداد كافة الكتل، تعيين العدد المناسب من الحلقات وبدء التسجيل.تم استخدام هذا البروتوكول لحقن إنترلوكين-34 الكبد محددة على التعبير plasmid في أجنة الأسماك المعدلة وراثيا، الذي تم تصنيف الضامة مع GFP. واستخدمت الفلورية الكاملة في التهجين الموضعي والمناعة لتحليل التعبير عن interleukin-34 وطبقة الضامة المسماة على GFP. تم تحليل أرقام خلايا الضامة كمياً في منطقة الأجنة التي تم حقنها وبناءها.تم استخدام التصوير الحي لمراقبة الضامة مباشرة ، وصفت الخضراء ، وتمرير الكبد من الأسماك التحكم والهجرة إلى كبد interleukin - 34 على التعبير عن الأسماك. وتشمل الخطوات الهامة لهذا البروتوكول اختيار خط تحويلي مناسب لتسمية خلية الاهتمام. والأنسجة المناسبة لتصوير التعبير عن الجين المعدلة وراثيا وكذلك نافذة زمنية الملاحظة المناسبة.يمكن تطبيق هذه التقنية لدراسة وظيفة العلاج الكيميائي الأخرى على سلوك الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا التائية والعدلات في الجسم الحي.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

تصوير لايف الفطرية المناعي والتفاعلات سابق للورم الخلية باستخدام نظام التعبير / UAS محرض GAL4 في اليرقات الزرد الجلد

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

مقاربة Optogenetic لتقييم تشكيل الوصلات العصبية في نظام المشارك الثقافة

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

تطوير متليفة الكبد نموذج الناجم عن الإيثانول في الزرد لدراسة السلف بوساطة الخلايا الكبدية التجديد

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

علاج المخدرات و<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير من خلية بناء العظم، تآكل العظام Osteoclast التفاعلات في نموذج الميداكا السمك هشاشة العظام

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; طريقة التصوير الوقت الفاصل بين الجرذ شبكات الاوعية الدموية الدقيقة مساريقي مثقف

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

في فيفو التصوير التعبير المعدلة وراثيا الجينات في الفرد الشبكية الأسلاف في الجنين اسماك الزرد همي لدراسة الخلية التأثيرات Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

إنشاء الزرد اليرقات "نموذج الحيوان" للتحقيق مثقبيه الكروزية حركية في فيفو

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

تطبيق [رني] والحرارة الناجمة عن صدمة "التعبير عامل النسخ" إلى "إعادة برمجة الخلايا الجرثومية" إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

استزراع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية على طراز السابقين فيفو غشاء بروخ البشرية الذين تتراوح أعمارهم بين

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

نموذج في المختبر نظام التروية التوازي-لوحة لدراسة البكتيريا التمسك Graft الأنسجة

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...