Name: an ectopic chemokine expression model for testing macrophage recruitment in vivo
Uploaded: 2019-09-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo at JoVE.com

Wij danken Dr. Jingrong Peng voor het delen van de TG (fabp10a: DsRed) transgene lijn; Dr. Zilong Wen voor het delen van de TG (MPEG1: GFP) transgene lijnen; Dr. Koichi Kawakami voor het leveren van de pTol2 vector. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (31771594), Guangdong Science and Technology plan Projects (2019A030317001) en de fundamentele onderzoeksfondsen voor de centrale universiteiten (D2191450).

Opmerking: Alle monsters werden behandeld met fenylthiourea (PTU) Eier water om pigment te remmen.
1. generatie van TG (fabp10a: il34) transgene constructies en visinjectie
<ol><li>Kloon de 2,8 KB fabp10a promotor8 en de Il-34 CODERINGS gebieden (ensdart 00000126460.3) van zebravis in de pTol2 vector om de fabp10a-il34 constructie te genereren. Injecteer de constructies in eencellige fase TG (MPEG1: GFP) en...

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-34+is+a+tissue-restricted+ligand+of+CSF1R+required+for+the+development+of+Langerhans+cells+and+microglia.">IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia.</a> Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).</li><li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+cytokine+and+its+receptor+by+functional+screening+of+the+extracellular+proteome.">Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome.</a> Science. 320 (5877), 807-811 (2008).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+overlap+but+differential+expression+of+CSF-1+and+IL-34+in+their+CSF-1+receptor-mediated+regulation+of+myeloid+cells.">Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells.</a> Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).</li><li>Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-34+Induces+the+Differentiation+of+Human+Monocytes+into+Immunosuppressive+Macrophages.+Antagonistic+Effects+of+GM-CSF+and+IFNc.">IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc.</a> PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan-1+regulates+the+biological+activities+of+interleukin-34.">Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).</li><li>Zhou, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-28-5p-IL-34-macrophage+feedback+loop+modulates+hepatocellular+carcinoma+metastasis.">miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis.</a> Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).</li><li>Gordon, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+expression+and+developmental+regulation+of+two+genes+coding+for+rat+fatty+acid+binding+proteins.">Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: a practical approach. , (2002).</li><li>Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopically+Expressed+IL-34+Can+Efficiently+Induce+Macrophage+Migration+to+the+Liver+in+Zebrafish.">Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).</li></ol>

Het hier beschreven protocol stelt ons in staat om de functie van een Chemokine op het gedrag van macrophagein vivo te onderzoeken en de procedure vereist enige technische expertise. Samenvattend zijn er verschillende kritieke stappen om complicaties in het protocol te voorkomen: 1) Selecteer een geschikte transgene lijn die een specifiek en sterk transgene signaal toont om de cel van belang te labelen; 2) Selecteer een geschikt weefsel dat toegankelijk is voorbeeld vorming en transgene genen overexpressie; 3) Maak een g...

Zebravis is een kleine tropische zoet water vis afkomstig uit India. Wat betreft het behoud van genen, zebravis hebben een gelijkenis van 87% voor de menselijke1. Het kan ons inzicht geven in Verwante onderwerpen van mensen door het bestuderen van de genregulatie, eiwit functie en Celgedrag zoals migratie, proliferatie et.al in zebravis. Zebravis embryo kan worden gebruikt om de ontwikkeling van vroege embryo's in verschillende stadia na remming van pigment te observeren. Ondertussen duurt het slechts drie maanden voordat zebravis zich tot seksuele volwassenheid ontwikkelt, waarna de zebravissen elke 4 dagen honderden eieren kunnen produceren. Mini formaat, eenvoudige fokkerij, sterke reproductieve capaciteit, deze voordelen maken zebravis cultuur zeer ruimtebesparend, bevorderlijk voor grootschalige cultuur. Het traditionele zoogdier model muis heeft hogere onderhoudskosten dan zebravis, waardoor de schaal van muis verhoging wordt beperkt. In het aspect van de vroege embryo ontwikkeling is muis embryo moeilijk te observeren in levende toestand als gevolg van de kenmerken van de ontwikkeling van muizen embryo's in de moeder baarmoeder. Integendeel, zebravis embryo's ontwikkelen zich extern en zijn transparant, daarom zijn ze gemakkelijk te observeren onder een microscoop. Bovendien is zebravis heel eenvoudig om een verscheidenheid aan transgene lijnen te construeren voor gerelateerd genfunctieonderzoek. Momenteel zijn verschillende zebravis transgene lijnen beschikbaar om verschillende soorten cellen te labelen. Het is nu erg handig om transgene lijnen te construeren om chemokines op specifieke locaties te overdrukken en de chemokines-functie op Celgedrag in zebravis te bestuderen.
Hier hebben we een workflow voor het gebruik van zebravis transgene lijn voor het onderzoeken van de functie van Il-34 op macrofaag gedrag in vivo2,3,4,5,6,7. Ten eerste bouwden we een leverspecifieke overexpressie plasmide van het gen il34 en injecteerde het plasmide in ééncellige fase TG (MPEG1: GFP) visembryo's die specifiek de macrofagen met fluorescerende proteïne GFP gelabeld. Vervolgens gebruikten we hele Mount fluorescerende in-situ hybridisatie en immunokleuring om het patroon van de il34 expressie en het aantal of de locatie van macrofagen te detecteren. De geïnjecteerde WT-embryo's werden verhoogd om een stabiele transgene lijn te genereren. In deze stappen hebben we de cytokine-producerende lijn vastgesteld en gevalideerd en visueel beoordeeld welke effecten kunnen worden gezien op de macrofaag verdeling. Tot slot, om het macrofaag gedrag te onderzoeken in reactie op de cytokine, gebruikten we confocale Live Imaging om direct de macrofaag migratie te observeren om de functie van il34 op de macrofaag migratie in vivo te bevestigen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-Anti-Goat antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-HRP&#160;</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEF832001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183; 2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3 Plus Amplification Reagent</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E2 solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mM&#160; NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 &#181;M&#160; KH2PO4 + 50 &#181;M&#160; Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum(FBS)</td>
			<td>Life</td>
			<td>10099-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>A100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridization buffer(HB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide+ 5&#215;SSC+9 mM sodium citrate+50 &#956;g/ml heparin sodium+ 500 &#956;g/ml tRNA+ 0.1% Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>1.17112.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 &#176;C&#160; to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 &#176;C. Caution. Manipulate with mask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea(PTU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Plus Amplification Diluent</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>E00492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215;Saline sodium citrate(SSC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBLK-fabp10a-il34-sv40</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSK-il34</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For il34 probe preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (mpeg1: GFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Label macrophages with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fabp10a: DsRed)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Label liver cells with DsRed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fab10a:il34)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Over-expression IL-34 in liver cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ectopic chemokine expression model for testing macrophage recruitment in vivo

Zebravis wordt veel gebruikt in het basis-en biomedisch onderzoek. Veel zebravis transgene lijnen zijn momenteel beschikbaar om verschillende soorten cellen te labelen. Door het transparante embryonale lichaam van zebravis is het voor ons handig om het effect van één Chemokine op het gedrag van een bepaald type cellen in vivo te bestuderen. Hier hebben we een workflow gegeven om de functie van een Chemokine op macrofaag migratie in vivo te onderzoeken. We bouwden een Weefselspecifieke overexpressie plasmide om de IL-34 te overdrukken en injecteerde het plasmide in ééncellige transgene visembryo's waarvan de macrofagen specifiek werden gelabeld door een fluorescerend eiwit. Vervolgens gebruikten we hele Mount fluorescerende in-situ hybridisatie en immunokleuring om het patroon van de Chemokine expressie en het aantal of de locatie van macrofagen op te sporen. De geïnjecteerde WT-embryo's werden verhoogd om een stabiele transgene lijn te genereren. Tot slot gebruikten we confocale Live beeldvorming om het macrofaag gedrag in de stabiele transgene vis direct te observeren om de functie van IL-34 op macrofagen in vivo te bestuderen.

De stappen in het Protocol van zebravis worden geïllustreerd in Figuur 2. Eerst genereerden we de pBLK-fabp10a-il34-SV40 construct waarin il34 werd gedreven door de Fabp10a Promoter (Figuur 2). De constructie werd microgeïnjecteerd in eencellige fase TG (MPEG1: GFP) zebravis embryo's die macrofagen kunnen labelen met GFP en WT embryo's die aan volwassenen werden verhoogd om transgene stabiele...

Watch this Scientific Journal Video about An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo at JoVE.com

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Om het effect van een Chemokine op macrofaag werving in vivo te testen, werd de hele mount in situ-hybridisatie gebruikt om de ectopische uitdrukking van de Chemokine te detecteren en werd immunokleuring gebruikt om macrofagen te labelen. Live Imaging werd gebruikt voor real-time observatie van macrofaag migratie.

Een Ectopic Chemokine-expressie model voor het testen van macrophage Recruitment in vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

Het hier beschreven protocol stelt ons in staat om de functie van een chemokine en het gedrag van macrofaag in vivo te onderzoeken. De meeste bestaande experimentele modellen van cel chemotaxi's zijn gebaseerd op in vitro cel experimenten. Maar in vitro experimenten zijn soms te eenvoudig om de complexe omgeving in vivo te modelleren.Ook kunnen ze niet vertegenwoordigen de chemoattractie vermogen in vivo. Deze methoden maken gebruik van het specifieke voordeel van zebravissen voor directe celgedragsobservatie, wat moeilijk is voor muizen. Begin met het genereren van TGFABP-10A interleukine-34 transgene constructies.Injecteer de FABP-10A interleukine-34 constructen in één celstadium Tg(mpeg1:GFP)transgene en een wild-type visembryo's samen met de transposase MRNA. Hef en verzamel de embryo's volgens manuscriptinstructies. Bevestig ze vervolgens met 4% paraformaldehyde 's nachts bij 4 graden Celsius of gedurende twee uur bij kamertemperatuur.Na fixatie was je de embryo's drie keer met PBST gedurende vijf minuten per wasbeurt. Dehydrateer de embryo's afzonderlijk met 50% methanol in PBST, gevolgd door 100% methanol, verander vervolgens in verse 100% methanol en bewaar ze minstens 2 uur bij negatieve 20 graden Celsius. Wanneer u klaar bent voor sondehybrideisatie, rehydrateert u de embryo's afzonderlijk in 50% methanol in PBST.Was ze vervolgens drie keer vijf minuten per wasbeurt met PBST. Verteren de embryo's met proteinase K in PBST bij kamertemperatuur. Gooi vervolgens de spijsverteringsoplossing weg en herhaal fixatie met 4%paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.Na fixatie was je de embryo's twee keer met PBST gedurende 10 minuten per wasbeurt. Voer prehybridisatie uit met verwarmde hybridisatiebuffer bij 65 graden Celsius gedurende ten minste één uur. Verwarm vervolgens de interleukine-34 sonde voor op 65 graden Celsius gedurende 10 minuten.Recycle de hybridisatiebuffer in de originele buis en voer 's nachts hybridisatie uit met de voorverwarmde sonde bij 65 graden Celsius. Op de volgende dag, was de embryo's met 50% formamide en 2X SSCT gevolgd door 2X SSCT en vervolgens 0,2X SSCT bij 65 graden Celsius. Herhaal elke was drie keer met 20 minuten per wasbeurt.Was vervolgens de embryo's drie keer met PBST gedurende vijf minuten per wasbeurt. Blokkeer de monsters met 600 milliliter blokkeerbuffer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 400 microliter anti-digoxigenin HRP-antilichaamoplossing toe en broed de embryo's 's nachts bij vier graden Celsius uit.Verwijder de volgende dag het antilichaam en was de embryo's zes keer met PBST gedurende 20 minuten per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt spoelt u elk monster gedurende vijf minuten af met 30 microliter 1x plus versterkingsverwijding. Incubeer de monsters in de fluorofoftoer tyramine werkoplossing gedurende vijf tot 15 minuten in het donker.Uitbreiding van de incubatietijd tot 30 minuten als de signalen zwak zijn. Was vervolgens de embryo's met PBST drie keer gedurende 10 minuten per wasbeurt. En broed ze uit met het primaire antilichaam op vier graden Celsius 's nachts.Op de volgende dag, was de embryo's vijf keer met PBST gedurende 30 minuten per wasbeurt, en broed ze met de secundaire antilichamen op vier graden Celsius 's nachts. Op de volgende dag, was de embryo's drie keer in PBST gedurende 10 minuten per wasbeurt, en bewaar ze in 70% glycerol in het donker op vier graden Celsius of negatieve 20 graden Celsius langer. Gebruik voorafgaand aan de beeldvorming een fluorescentiemicroscoop om de DS-rode en GFP-dubbele positieve embryo's te selecteren.Om de vis te monteren, gebruik een metalen bad om een milliliter van 1% laag smelten agarose warmte tot boven de 90 graden Celsius. Vervolgens, afkoelen tot lichaamstemperatuur en meng in 50 microliter van 0,2% tricaine. Breng de verdoofde embryo's naar een kleine schaal gemonteerd met een cover slide op de bodem.Verwijder het omringende water en laat langzaam de laag smeltende agarose op de embryo's vallen. Stel de positie van de vis zorgvuldig in voordat de agarose is gestold, waardoor het levergebied dicht bij de afdekplaat blijft. Zodra de agarose is gestold, zorgvuldig te bedekken met een andere laag van agarose om het te versterken.Plaats de schotel op de confocale microscoop drager tafel, bedek de vis met de E2-oplossing met tricaine, en start beeldvorming. Om de confocale microscoop te bedienen, opent u de Zen Black 2.3-software en klikt u op lokaliseren, dan incubatie en stelt u de temperatuur in op 29 graden Celsius. Klik op het acquisitiemenu en selecteer de vereiste scanmodus en lasers in het menu slimme instellingen.Selecteer vervolgens Z-stack en positie. Klik op het experimentele ontwerpmenu en selecteer multiblokexperiment inschakelen in het eerste blok om het voorbeeld onder lage vergroting te vinden. Schakel vervolgens over naar de hoge vergroting en laat het waargenomen gebied in het midden van het gezichtsveld.Stel de positie en Z-stack informatie in. Selecteer vervolgens de juiste laserintensiteit, scanlagen en beeldsnelheid. Zodra alle blokken zijn ingesteld, stelt u het juiste aantal lussen in en begint u met opnemen.Dit protocol werd gebruikt om een leverspecifieke interleukine-34 over expressieplasmid te injecteren in transgene visembryo's, die macrofagen werden aangeduid met GFP. Volledige mount fluorescentie in situ hybridisatie en immunostaining werden gebruikt om de expressie van interleukine-34 en de GFP gelabelde macrofagen te analyseren. Macrofaagcelnummers werden kwantitatief geanalyseerd in niet-geïnjecteerde en construeren geïnjecteerde embryo's lever- en staartgebied.Live imaging werd gebruikt om direct te observeren macrofagen, gelabeld groen, die door de lever van een controle vis en migreren in de lever van een interleukine-34 over het uitdrukken van vis. De belangrijke stappen van dit protocol zijn de selectie van een geschikte transgene lijn om de cel van belang te etiketteren. En geschikt weefsel voor het beeldvorming van uw expressie van transgeen gen, evenals een geschikte observatie tijd venster.Deze techniek kan worden toegepast om de functie van andere chemokines op het gedrag van andere cellen, zoals T-cellen en neutrofielen in vivo te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Live-Imaging van aangeboren immuunsysteem en preneoplastische cel interacties Met behulp van een Inducible Gal4 / UAS Expression System in larvale zebravis Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Een optogenetische Aanpak voor het beoordelen van de vorming van neuronale verbindingen in een co-cultuur systeem

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever Model in zebravis om te studeren Progenitor Cell-gemedieerde Hepatocyt Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Drug Treatment en<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging van Osteoblast osteoclasten Interacties in een Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Een<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode voor Time-lapse imaging van gekweekte Rat Mesenteriale microvasculaire Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Oprichting van larvale zebravis als Model van een dier te onderzoeken Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Toepassing van RNAi en warmte-schok-geïnduceerde transcriptie Factor expressie te herprogrammeren kiemcellen aan neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Kweken van de epitheliale cellen van de retinale Pigment op een Ex Vivo Model van leeftijd menselijke Bruch membraan

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Een In Vitro Model van een Parallel-plaat perfusie-systeem te bestuderen van de naleving van de bacteriële om te enten van weefsels

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...