Name: an ectopic chemokine expression model for testing macrophage recruitment in vivo
Uploaded: 2019-09-25T14:30:00
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Wir danken Dr. Jingrong Peng für die gemeinsame Nutzung der transgenen Tg-Linie (fabp10a: DsRed); Dr. Zilong Wen für die gemeinsame Nutzung der transgenen Tg(mpeg1: GFP) Dr. Koichi Kawakami für die Bereitstellung des pTol2-Vektors. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31771594), Guangdong Science and Technology Plan Projects (2019A030317001) und den Fundamental Research Funds for the Central Universities (D2191450) unterstützt.

HINWEIS: Alle Proben wurden mit Phenylthiourea (PTU) Eiwasser behandelt, um Pigment zu hemmen.
1. Erzeugung von Tg (fabp10a:il34) Transgene Konstrukte und Fischinjektion
<ol><li>Klonen Sie den 2.8 kb fabp10a-Promotor 8 und die IL-34-Kodierungsbereiche (ENSDART00000126460.3) von Zebrafischen in den pTol2-Vektor, um das fabp10a-il34-Konstrukt zu erzeugen. Injizieren Sie die Konstrukte in einZellstadium Tg (mpeg1: ...

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-34+is+a+tissue-restricted+ligand+of+CSF1R+required+for+the+development+of+Langerhans+cells+and+microglia.">IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia.</a> Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).</li><li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+cytokine+and+its+receptor+by+functional+screening+of+the+extracellular+proteome.">Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome.</a> Science. 320 (5877), 807-811 (2008).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+overlap+but+differential+expression+of+CSF-1+and+IL-34+in+their+CSF-1+receptor-mediated+regulation+of+myeloid+cells.">Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells.</a> Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).</li><li>Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-34+Induces+the+Differentiation+of+Human+Monocytes+into+Immunosuppressive+Macrophages.+Antagonistic+Effects+of+GM-CSF+and+IFNc.">IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc.</a> PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan-1+regulates+the+biological+activities+of+interleukin-34.">Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).</li><li>Zhou, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-28-5p-IL-34-macrophage+feedback+loop+modulates+hepatocellular+carcinoma+metastasis.">miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis.</a> Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).</li><li>Gordon, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+expression+and+developmental+regulation+of+two+genes+coding+for+rat+fatty+acid+binding+proteins.">Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: a practical approach. , (2002).</li><li>Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopically+Expressed+IL-34+Can+Efficiently+Induce+Macrophage+Migration+to+the+Liver+in+Zebrafish.">Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).</li></ol>

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es uns, die Funktion eines Chemokins auf das Verhalten von Macrophagein vivo zu untersuchen, und das Verfahren erfordert einige technische Servierkenntnisse. Zusammenfassend gibt es mehrere kritische Schritte, um Komplikationen im Protokoll zu vermeiden: 1) Wählen Sie eine geeignete transgene Linie, die spezifisches und starkes transgenes Signal zeigt, um die Zelle von Interesse zu kennzeichnen; 2) wählen Sie ein geeignetes Gewebe, das für die Bildgebung und transgene Genüb...

Zebrafisch ist ein kleiner tropischer Süßwasserfisch aus Indien. In Bezug auf die Generhaltung haben Zebrafische eine Ähnlichkeit von 87% mit dem Menschlichen1. Es kann uns Einblicke zu verwandten Themen des Menschen geben, indem es die Genregulation, Proteinfunktion und Zellverhalten wie Migration, Proliferation et.al in Zebrafischen untersucht. Zebrafisch-Embryo kann verwendet werden, um die Entwicklung von frühen Embryonen in verschiedenen Stadien nach der Hemmung des Pigments zu beobachten. Inzwischen dauert es nur drei Monate, bis sich Zebrafische zu einer Geschlechtsreife entwickeln, dann kann der Zebrafisch alle 4 Tage Hunderte von Eiern produzieren. Mini-Größe, einfache Zucht, starke Fortpflanzungsfähigkeit, diese Vorteile machen Zebrafischkultur sehr platzsparend, förderlich für großflächige Kultur. Die traditionelle Säugetiermodellmaus hat höhere Wartungskosten als Zebrafische, wodurch der Umfang des Anhebens von Mäusen begrenzt wird. Im Bereich der frühen Embryoentwicklung ist der Mausembryon aufgrund der Eigenschaften der Entwicklung von Mausembryonen im Mutterleib schwer im Leben zu beobachten. Im Gegenteil, Zebrafischembryonen entwickeln sich äußerlich und sind transparent, daher sind sie unter dem Mikroskop leicht zu beobachten. Darüber hinaus ist Zebrafisch sehr einfach, eine Vielzahl von transgenen Linien für die verwandte Genfunktionsforschung zu konstruieren. Derzeit stehen verschiedene transgene Zebrafische zur Verfügung, um verschiedene Zelltypen zu kennzeichnen. Es ist jetzt sehr praktisch, transgene Linien zu konstruieren, um Chemokine an bestimmten Stellen zu überexprimieren und die Chemokinfunktion auf zellzelliges Verhalten bei Zebrafischen zu untersuchen.
Hier haben wir einen Workflow zur Verwendung von Zebrafisch transgene Linie zur Untersuchung der Funktion von IL-34 auf Makrophagen Verhalten in vivo2,3,4,5,6,7. Zunächst konstruierten wir ein leberspezifisches Überexpressionsplasmid des Gens il34 und injizierten das Plasmid in einzellige Tg-Embryos (mpeg1: GFP), die die Makrophagen durch das fluoreszierende Protein GFP spezifisch kennzeichnen. Dann verwendeten wir ganze Mount-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung und Immunostainierung, um das Muster des il34-Ausdrucks und die Anzahl oder Position von Makrophagen zu erkennen. Die injizierten WT-Embryonen wurden erhöht, um eine stabile transgene Linie zu erzeugen. In diesen Schritten haben wir die Zytokin-produzierende Linie etabliert und validiert und die Auswirkungen, die auf die Makrophagenverteilung zu sehen sind, visuell bewertet. Schließlich haben wir zur Untersuchung des Makrophagenverhaltens als Reaktion auf das Zytokin konfokale Live-Bildgebung verwendet, um die Makrophagenmigration direkt zu beobachten, um die Funktion von il34 auf der Makrophagenmigration in vivo zu bestätigen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-Anti-Goat antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-HRP&#160;</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEF832001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183; 2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3 Plus Amplification Reagent</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E2 solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mM&#160; NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 &#181;M&#160; KH2PO4 + 50 &#181;M&#160; Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum(FBS)</td>
			<td>Life</td>
			<td>10099-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>A100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridization buffer(HB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide+ 5&#215;SSC+9 mM sodium citrate+50 &#956;g/ml heparin sodium+ 500 &#956;g/ml tRNA+ 0.1% Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>1.17112.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 &#176;C&#160; to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 &#176;C. Caution. Manipulate with mask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea(PTU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Plus Amplification Diluent</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>E00492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215;Saline sodium citrate(SSC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBLK-fabp10a-il34-sv40</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSK-il34</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For il34 probe preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (mpeg1: GFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Label macrophages with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fabp10a: DsRed)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Label liver cells with DsRed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fab10a:il34)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Over-expression IL-34 in liver cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ectopic chemokine expression model for testing macrophage recruitment in vivo

Zebrafische sind weit verbreitet in der Grundlagen- und biomedizinischen Forschung verwendet. Viele transgene Zebrafische sind derzeit verfügbar, um verschiedene Arten von Zellen zu kennzeichnen. Aufgrund des transparenten embryonalen Körpers von Zebrafischen ist es für uns bequem, die Wirkung eines Chemokins auf das Verhalten einer bestimmten Art von Zellen in vivo zu untersuchen. Hier haben wir einen Workflow zur Untersuchung der Funktion eines Chemokins zur Makrophagenmigration in vivo bereitgestellt. Wir konstruierten ein gewebespezifisches Überexpressionsplasmid, um IL-34 zu überexpressen und injizierten das Plasmid in transgene Fischembryonen im Einzellstadium, deren Makrophagen speziell durch ein fluoreszierendes Protein gekennzeichnet wurden. Wir verwendeten dann ganze Mount-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung und Immunostaining, um das Muster der Chemokin-Expression und die Anzahl oder Position von Makrophagen zu erkennen. Die injizierten WT-Embryonen wurden erhöht, um eine stabile transgene Linie zu erzeugen. Schließlich verwendeten wir konfokale Live-Bildgebung, um das Makrophagenverhalten in den stabilen transgenen Fischen direkt zu beobachten, um die Funktion von IL-34 auf Makrophagen in vivo zu untersuchen.

Die Schritte im Protokoll der Zebrafische sind in Abbildung 2dargestellt. Zuerst haben wir das pBLK-fabp10a-il34-sv40 Konstrukt generiert, in dem il34 vom promotorium enwerter Bauart "fabp10a" angetrieben wurde (Abbildung 2). Das Konstrukt wurde mikroinjiziert in ein-Zell-Stadium Tg (mpeg1: GFP) Zebrafisch-Embryonen, die Makrophagen mit GFP- und WT-Embryonen kennzeichnen können, die zu Erwachs...

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An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Um die Wirkung eines Chemokins auf die Makrophagenrekrutierung in vivo zu testen, wurde die gesamte Mount-in-situ-Hybridisierung verwendet, um die ektopische Expression des Chemokins zu erkennen, und Immunstaining wurde verwendet, um Makrophagen zu kennzeichnen. Live-Bildgebung wurde für die Echtzeitbeobachtung der Makrophagenmigration verwendet.

Ein ektopisches Chemokin-Expressionsmodell zum Testen der Makrophagenrekrutierung in Vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht es uns, die Funktion eines Chemokins und das Verhalten von Makrophagen in vivo zu untersuchen. Die meisten bestehenden experimentellen Modelle von Zellchemotaxis basieren auf In-vitro-Zellexperimenten. Aber In-vitro-Experimente sind manchmal zu einfach, um die komplexe Umgebung in vivo zu modellieren.Außerdem stellen sie möglicherweise nicht die Chemoanziehungsfähigkeit in vivo dar. Diese Methoden nutzen den spezifischen Vorteil von Zebrafischen für die direkte Zellverhaltensbeobachtung, was für Mäuse schwierig ist. Beginnen Sie mit der Erzeugung von transgenen KONSTRUKTen TGFABP-10A interleukin-34.Injizieren Sie die FABP-10A Interleukin-34-Konstrukte in eine Zellstufe Tg(mpeg1:GFP)transgenic und eine wildartige Fischembryonen zusammen mit der Transposase MRNA. Heben und sammeln Sie die Embryonen nach Manuskriptanweisungen. Dann fixieren Sie sie mit 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 Grad Celsius oder für zwei Stunden bei Raumtemperatur.Waschen Sie die Embryonen nach der Fixierung dreimal fünf Minuten pro Wäsche mit PBST. Dehydrieren Sie die Embryonen separat mit 50% Methanol in PBST, gefolgt von 100%methanol, dann wechseln Sie zu frischem 100%methanol, und lagern Sie sie bei negativen 20 Grad Celsius für mindestens 2 Stunden. Wenn Sie für die Sondenhybridisierung bereit sind, rehydrieren Sie die Embryonen separat in 50% Methanol in PBST.Dann waschen Sie sie mit PBST dreimal für fünf Minuten pro Wäsche. Verdauen Sie die Embryonen mit Proteinase K in PBST bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie dann die Verdauungslösung und wiederholen Sie die Fixierung mit 4% Paraformaldehyd für 20 Minuten bei Raumtemperatur.Waschen Sie die Embryonen nach der Fixierung zweimal mit PBST für 10 Minuten pro Wäsche. Führen Sie eine Vorhybridisierung mit einem erhitzten Hybridisierungspuffer bei 65 Grad Celsius für mindestens eine Stunde durch. Dann die Interleukin-34 Sonde 10 Minuten auf 65 Grad Celsius vorheizen.Recyceln Sie den Hybridisierungspuffer in das Originalrohr und führen Sie die Hybridisierung mit der vorgeheizten Sonde bei 65 Grad Celsius über Nacht durch. Am nächsten Tag die Embryonen mit 50% Formamid und 2X SSCT, gefolgt von 2X SSCT und dann 0,2X SSCT bei 65 Grad Celsius waschen. Wiederholen Sie jede Wäsche dreimal mit 20 Minuten pro Wäsche.Dann waschen Sie die Embryonen dreimal mit PBST für fünf Minuten pro Wäsche. Blockieren Sie die Proben mit 600 MilliliterBlockiden für eine Stunde bei Raumtemperatur. Dann 400 Mikroliter Anti-Digoxigenin HRP-Antikörperlösung hinzufügen und die Embryonen bei vier Grad Celsius über Nacht inkubieren.Am nächsten Tag den Antikörper entfernen und die Embryonen sechsmal mit PBST für 20 Minuten pro Wäsche waschen. Nach der letzten Wäsche jede Probe mit 30 Mikrolitern 1X plus Amplifikationsverdünnung für fünf Minuten abspülen. Inkubieren Sie die Proben in der Fluorophor-Tyramin-Arbeitslösung für fünf bis 15 Minuten im Dunkeln.Verlängerung der Inkubationszeit auf 30 Minuten, wenn die Signale schwach sind. Dann waschen Sie die Embryonen mit PBST dreimal für 10 Minuten pro Wäsche. Und bebrüten sie mit dem primären Antikörper bei vier Grad Celsius über Nacht.Am nächsten Tag die Embryonen fünfmal mit PBST für 30 Minuten pro Wäsche waschen und mit den sekundären Antikörpern bei vier Grad Celsius über Nacht bebrüten. Am nächsten Tag die Embryonen dreimal in PBST für 10 Minuten pro Wäsche waschen und länger in 70% Glycerin im Dunkeln bei vier Grad Celsius oder minus 20 Grad Celsius lagern. Wählen Sie vor der Bildgebung ein Fluoreszenzmikroskop aus, um die doppelten positiven DS- und GFP-Embryonen auszuwählen.Um die Fische zu montieren, verwenden Sie ein Metallbad, um einen Milliliter 1%niedriger Schmelzagarose auf über 90 Grad Celsius zu erhitzen. Dann kühlen Sie es auf Körpertemperatur und mischen Sie in 50 Mikroliter 0,2%Tricaine. Übertragen Sie die anästhesierten Embryonen auf eine kleine Schale, die mit einer Abdeckungsrutsche auf der Unterseite montiert ist.Entfernen Sie das umgebende Wasser und lassen Sie langsam die niedrig schmelzende Agarose auf die Embryonen fallen. Stellen Sie die Position der Fische sorgfältig ein, bevor sich die Agarose verfestigt hat, sodass der Leberbereich in der Nähe des Deckschlittens gehalten wird. Sobald die Agarose verfestigt ist, bedecken Sie sie vorsichtig mit einer anderen Schicht Von Agarose, um sie zu verstärken.Legen Sie die Schale auf den konfokalen Mikroskopträgertisch, bedecken Sie den Fisch mit der E2-Lösung mit Tricain und beginnen Sie mit der Bildgebung. Um das konfokale Mikroskop zu betreiben, öffnen Sie die Zen Black 2.3 Software und klicken Sie auf Locate, dann inkubieren und dann die Temperatur auf 29 Grad Celsius einstellen. Klicken Sie auf das Erfassungsmenü und wählen Sie den gewünschten Scanmodus und die Laser im Smart-Setup-Menü aus.Wählen Sie dann Z-Stack und Position aus. Klicken Sie auf das experimentelle Designermenü und wählen Sie Multiblock-Experiment im ersten Block aktivieren, um die Probe unter geringer Vergrößerung zu finden. Wechseln Sie dann zur hohen Vergrößerung und lassen Sie den beobachteten Bereich in der Mitte des Gesichtsfeldes.Legen Sie die Position und die Z-Stack-Informationen fest. Wählen Sie dann die entsprechende Laserintensität, Scan-Schichten und Bildgeschwindigkeit aus. Sobald alle Blöcke eingerichtet sind, legen Sie die entsprechende Anzahl von Schleifen fest und starten Sie die Aufnahme.Dieses Protokoll wurde verwendet, um ein leberspezifisches Interleukin-34 über Expressionplasmid in transgene Fischembryonen zu injizieren, deren Makrophagen mit GFP gekennzeichnet wurden. Zur Analyse der Expression von Interleukin-34 und der GFP-bezeichneten Makrophagen wurden die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung und Immunfärbung mit voller Mount-Fluoreszenz und Immunfärbung verwendet. Makrophagenzellzahlen wurden quantitativ in nicht injiziert und konstruieren injizierte Embryos Leber und SchwanzRegion.Live-Bildgebung wurde verwendet, um Makrophagen direkt zu beobachten, grün markiert, vorbei an der Leber eines Kontrollfisches und Wandern in die Leber eines Interleukin-34 über extierbaren Fisch. Zu den wichtigen Schritten dieses Protokolls gehört die Auswahl einer geeigneten transgenen Linie zur Kennzeichnung der Zelle von Interesse. Und geeignetes Gewebe für die Abbildung Ihrer Expression des transgenen Gens sowie ein geeignetes Beobachtungszeitfenster.Diese Technik könnte angewendet werden, um die Funktion anderer Chemokine auf das Verhalten anderer Zellen, wie T-Zellen und Neutrophilen in vivo, zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Live-Imaging von angeborenen Immun und Präkanzeröse Zell-Interaktionen unter Verwendung eines induzierbaren Gal4 / UAS Expression System in Zebrafisch-Larven Haut

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Entwicklung einer fibrotischen Leber Modell in Zebrabärbling Ethanol-induzierte zur Untersuchung Progenitor-vermittelte Zell Hepatozyten-Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Medikamentöse Behandlung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging von Osteoblasten-Osteoklasten-Wechselwirkungen in Medaka-Fisch Osteoporose Modell

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

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Ein<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode für Time-Lapse-Imaging von kultivierten Ratten Mesenteriale mikrovaskuläre Netzwerke

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

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In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

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Gründung der Larven Zebrafisch als Tier-Modell zu untersuchen Trypanosomen Trypanosoma Motilität In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

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Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Kultivierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen auf einem Ex Vivo Modell der alten menschlichen Bruch-Membran

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Ein In-vitro- Modell eines Systems Parallel-Platte Perfusion, bakteriellen Einhaltung der Gewebe Transplantat zu studieren

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...