Name: an ectopic chemokine expression model for testing macrophage recruitment in vivo
Uploaded: 2019-09-25T14:30:00
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Ringraziamo il Dr. Jingrong Peng per aver condiviso la linea transgenica Tg (fabp10a: DsRed); Dr. .ilong Wen per la condivisione delle linee transgeniche Tg (mpeg1: GFP); Dr. Koichi Kawakami per aver fornito il vettore pTol2. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (31771594), dai progetti del Guangdong Science and Technology Plan (2019A030317001) e dai Fondi fondamentali di ricerca per le università centrali (D2191450).

NOT:</</c0> Tutti i campioni sono stati trattati con l'acqua uovo fenilthiourea (PTU) per inibire il pigmento.
1. Generazione di Tg (fabp10a:il34) Costrutti transgenici e iniezione di pesce
<ol><li>Clonare il promotore di 2,8 kb fabp10a 8 e le aree di codifica IL-34 (ENSDART00000126460.3) del pesce zebra nel vettore pTol2 per generare il costrutto fabp10a-il34. Iniettare i costrutti nello stadio a una cellula Tg (<...

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-34+is+a+tissue-restricted+ligand+of+CSF1R+required+for+the+development+of+Langerhans+cells+and+microglia.">IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia.</a> Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).</li><li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+cytokine+and+its+receptor+by+functional+screening+of+the+extracellular+proteome.">Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome.</a> Science. 320 (5877), 807-811 (2008).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+overlap+but+differential+expression+of+CSF-1+and+IL-34+in+their+CSF-1+receptor-mediated+regulation+of+myeloid+cells.">Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells.</a> Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).</li><li>Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-34+Induces+the+Differentiation+of+Human+Monocytes+into+Immunosuppressive+Macrophages.+Antagonistic+Effects+of+GM-CSF+and+IFNc.">IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc.</a> PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan-1+regulates+the+biological+activities+of+interleukin-34.">Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).</li><li>Zhou, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-28-5p-IL-34-macrophage+feedback+loop+modulates+hepatocellular+carcinoma+metastasis.">miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis.</a> Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).</li><li>Gordon, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+expression+and+developmental+regulation+of+two+genes+coding+for+rat+fatty+acid+binding+proteins.">Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: a practical approach. , (2002).</li><li>Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopically+Expressed+IL-34+Can+Efficiently+Induce+Macrophage+Migration+to+the+Liver+in+Zebrafish.">Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).</li></ol>

Il protocollo qui descritto ci permette di indagare la funzione di una chemiochina sul comportamento di macrophagein vivo e la procedura richiede una certa competenza tecnica. In sintesi, ci sono diversi passaggi critici per evitare complicazioni nel protocollo: 1) selezionare una linea transgenica adatta che mostra un segnale transgenico specifico e forte per etichettare la cellula di interesse; 2) selezionare un tessuto appropriato accessibile per l'imaging e la sovraespressione genica transgenica; 3) fare una sonda di...

Il pesce zebra è un piccolo pesce dolce tropicale che ha avuto origine in India. Per quanto riguarda la conservazione genica, i pesci zebra hanno una somiglianza dell'87% con l'umano1. Può fornirci informazioni su argomenti correlati dell'uomo studiando la regolazione genica, la funzione delle proteine e il comportamento cellulare come la migrazione, la proliferazione et.al nel pesce zebra. L'embrione di pesce zebra può essere utilizzato per osservare lo sviluppo di embrioni precoci in diverse fasi dopo aver inibito il pigmento. Nel frattempo, ci vogliono solo tre mesi perché il pesce zebra si sviluppi in maturità sessuale, quindi il pesce zebra può produrre centinaia di uova ogni 4 giorni. Mini-dimensioni, allevamento semplice, forte capacità riproduttiva, questi vantaggi rendono la cultura del pesce zebra molto risparmio di spazio, favorevole alla cultura su larga scala. Il topo modello tradizionale di mammiferi ha costi di manutenzione più elevati rispetto al pesce zebra, limitando così la scala di sollevamento del mouse. Nell'aspetto dello sviluppo precoce dell'embrione, l'embrione di topo è difficile da osservare in condizioni vive a causa delle caratteristiche dello sviluppo dell'embrione di topo nel grembo materno. Al contrario, gli embrioni di pesce zebra si sviluppano esternamente e sono trasparenti, quindi sono facili da osservare al microscopio. Inoltre, il pesce zebra è molto facile da costruire una varietà di linee transgeniche per la ricerca sulle funzioni geniche correlate. Attualmente, sono disponibili varie linee transgeniche di pesci zebra per etichettare diversi tipi di cellule. Ora è molto conveniente costruire linee transgeniche per sovraesprimere le chemiochine in luoghi specifici e studiare la funzione delle chemiochine sul comportamento cellulare nel pesce zebra.
Qui, abbiamo fornito un flusso di lavoro per utilizzare la linea transgenica di pesce zebra per studiare la funzione di IL-34 sul comportamento del macrofago in vivo2,3,4,5,6,7. In primo luogo, abbiamo costruito una plasmida di sovraespressione specifica del fegato del gene il34 e iniettato il plasmide in uno stadio unicellulare Tg (mpeg1: GFP) embrioni di pesce che specificamente etichettavano i macrofagi dalla proteina fluorescente GFP. Quindi, abbiamo usato l'intero monte fluorescente in situ ibridazione e immunostaining per rilevare il modello dell'espressione il34 e il numero o la posizione dei macrofagi. Gli embrioni di WT iniettati sono stati sollevati per generare una linea transgenica stabile. In questi passaggi, abbiamo stabilito e convalidato la linea di produzione della citochina e valutato visivamente gli effetti che si possono vedere sulla distribuzione dei macrofafi. Infine, per studiare il comportamento dei macrofagi in risposta alla citochina, abbiamo usato l'imaging dal vivo confocale per osservare direttamente la migrazione dei macrofagi per confermare la funzione di il34 sulla migrazione del macrofago in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-Anti-Goat antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-HRP&#160;</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEF832001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183; 2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3 Plus Amplification Reagent</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E2 solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mM&#160; NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 &#181;M&#160; KH2PO4 + 50 &#181;M&#160; Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum(FBS)</td>
			<td>Life</td>
			<td>10099-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>A100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridization buffer(HB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide+ 5&#215;SSC+9 mM sodium citrate+50 &#956;g/ml heparin sodium+ 500 &#956;g/ml tRNA+ 0.1% Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>1.17112.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 &#176;C&#160; to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 &#176;C. Caution. Manipulate with mask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea(PTU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Plus Amplification Diluent</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>E00492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215;Saline sodium citrate(SSC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBLK-fabp10a-il34-sv40</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSK-il34</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For il34 probe preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (mpeg1: GFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Label macrophages with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fabp10a: DsRed)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Label liver cells with DsRed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fab10a:il34)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Over-expression IL-34 in liver cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ectopic chemokine expression model for testing macrophage recruitment in vivo

I pesci zebra sono ampiamente utilizzati nella ricerca di base e biomedica. Molte linee transgeniche di pesci zebra sono attualmente disponibili per etichettare vari tipi di cellule. A causa del corpo embrionale trasparente del pesce zebra, è conveniente per noi studiare l'effetto di una chemiochina sul comportamento di un certo tipo di cellule in vivo. Qui abbiamo fornito un flusso di lavoro per studiare la funzione di una chemiochina sulla migrazione dei macrofaghi in vivo. Abbiamo costruito un plasmide di sovraespressione per itessuti specifici dei tessuti per sovraesprimere l'IL-34 e abbiamo iniettato il plasmide in embrioni di pesci transgenici con stadio unicellulare i cui macrofagi sono stati specificamente etichettati da una proteina fluorescente. Abbiamo quindi usato l'intero montaggio fluorescente in situ ibridazione e immunostaining per rilevare il modello dell'espressione chemiochina e il numero o la posizione dei macrofagi. Gli embrioni di WT iniettati sono stati sollevati per generare una linea transgenica stabile. Infine, abbiamo usato l'imaging dal vivo confocale per osservare direttamente il comportamento dei macrofagi nel pesce transgenico stabile per studiare la funzione dell'IL-34 sui macrofagi in vivo.

I passaggi coinvolti nel protocollo del pesce zebra sono illustrati nella Figura 2. In primo luogo, è stato generato il costrutto pBLK-fabp10a-il34-sv40 in cui il34 è stato guidato dal promotore fabp10a (Figura 2). Il costrutto è stato microiniettato in embrioni di pesce zebra Tg (mpeg1: GFP) che possono etichettare i macrofagi con embrioni GFP e WT che sono stati innalzati agli adulti per g...

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An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Per testare l'effetto di una chemiochina sul reclutamento di macrofagi in vivo, l'intero montaggio in situ ibridazione è stato utilizzato per rilevare l'espressione ectopica della chemiochina, e l'immunostainizzazione è stata utilizzata per etichettare i macrofagi. L'imaging dal vivo è stato utilizzato per l'osservazione in tempo reale della migrazione dei macrofafi.

Un modello di espressione della chemiochina ectopica per testare il reclutamento macrofrofo in vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

Il protocollo qui descritto ci permette di indagare la funzione di una chemiochina e il comportamento del macrofago in vivo. La maggior parte dei modelli sperimentali esistenti di chemiotassi cellulare si basano su esperimenti su cellule in vitro. Ma gli esperimenti in vitro a volte sono troppo semplici per modellare l'ambiente complesso in vivo.Inoltre, potrebbero non rappresentare l'abilità di chemioa attrazione in vivo. Questi metodi utilizzano il vantaggio specifico del pesce zebra per l'osservazione diretta del comportamento cellulare, che è difficile per i topi. Inizia generando costrutti transgenici TGFABP-10A interleuchina-34.Iniettare i costrutti interleuchina-34 FABP-10A in uno stadio cellulare Tg(mpeg1:GFP)transgenico e un embrione di pesce di tipo selvatico insieme alla MRNA traspostasi. Sollevare e raccogliere gli embrioni secondo le istruzioni del manoscritto. Quindi, fissarli con paraformaldeide al 4% durante la notte a 4 gradi Celsius o per due ore a temperatura ambiente.Dopo la fissazione, lavare gli embrioni con PBST tre volte per cinque minuti per lavaggio. Disidratare gli embrioni separatamente con il 50% di metanolo in PBST, seguito dal 100% di metanolo, quindi passare al metanolo fresco al 100% e conservarli a -20 gradi Celsius per almeno 2 ore. Quando è pronto per l'ibridazione della sonda, reidratare gli embrioni separatamente nel 50% di metanolo in PBST.Quindi, lavarli con PBST tre volte per cinque minuti per lavaggio. Digerire gli embrioni con proteinasi K in PBST a temperatura ambiente. Quindi, scartare la soluzione di digestione e ripetere la fissazione con paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente.Dopo la fissazione, lavare gli embrioni due volte con PBST per 10 minuti per lavaggio. Eseguire la preibridizzazione con buffer di ibridazione riscaldato a 65 gradi Celsius per almeno un'ora. Quindi, preriscaldare la sonda interleuchina-34 a 65 gradi Celsius per 10 minuti.Riciclare il buffer di ibridazione nel tubo originale ed eseguire l'ibridazione con la sonda preriscaldata a 65 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare gli embrioni con 50%formamide e 2X SSCT seguito da 2X SSCT e poi 0.2X SSCT a 65 gradi Celsius. Ripetere ogni lavaggio tre volte con 20 minuti per lavaggio.Quindi, lavare gli embrioni tre volte con PBST per cinque minuti per lavaggio. Bloccare i campioni con 600 millilitri di tampone di blocco per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 400 microlitri di soluzione anticorpale HRP anti-digoxigenina e incubare gli embrioni a quattro gradi Celsius durante la notte.Il giorno successivo, rimuovere l'anticorpo e lavare gli embrioni sei volte con PBST per 20 minuti per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, sciacquare ogni campione con 30 microlitri di 1X più diluente di amplificazione per cinque minuti. Incubare i campioni nella soluzione di lavoro della tiroramina del fluorofo per cinque-15 minuti al buio.Estensione del tempo di incubazione a 30 minuti se i segnali sono deboli. Quindi, lavare gli embrioni con PBST tre volte per 10 minuti per lavaggio. E incubarli con l'anticorpo primario a quattro gradi Celsius durante la notte.Il giorno successivo, lavare gli embrioni cinque volte con PBST per 30 minuti per lavaggio e incubarli con gli anticorpi secondari a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, lavare gli embrioni tre volte in PBST per 10 minuti per lavaggio e conservarli nel 70% di glicerolo al buio a quattro gradi Celsius o -20 gradi Celsius più a lungo. Prima dell'imaging, utilizzare un microscopio a fluorescenza per selezionare gli embrioni doppi positivi DS rossi e GFP.Per montare il pesce, utilizzare un bagno di metallo per riscaldare un millilitro dell'1% di agarosio fuso basso fino a oltre 90 gradi Celsius. Quindi, raffreddarlo a temperatura corporea e mescolare in 50 microlitri dello 0,2% di tricaina. Trasferire gli embrioni anestetizzati su un piccolo piatto montato con uno scivolo di copertura sul fondo.Rimuovere l'acqua circostante e far cadere lentamente l'agarosio a bassa fusione sugli embrioni. Impostare con cura la posizione del pesce prima che l'agarosio si sia solidificato, mantenendo l'area epatica vicino allo scivolo di copertura. Una volta che l'agarosio si è solidificato, coprirlo con cura con un altro strato di agarosio per rinforzarlo.Posizionare il piatto sul tavolo porta microscopio confocale, coprire il pesce con la soluzione E2 con tricaina e iniziare l'imaging. Per utilizzare il microscopio confocale, aprire il software Zen Black 2.3 e fare clic su individua, quindi incubare, quindi impostare la temperatura su 29 gradi Celsius. Fare clic sul menu di acquisizione e selezionare la modalità di scansione e i laser necessari nel menu di configurazione intelligente.Quindi selezionare Z-stack e posizione. Fate clic sul menu di progettazione sperimentale e selezionate Abilita esperimento multiblobloglio nel primo blocco per trovare l'esempio con un ingrandimento basso. Quindi, passare all'ingrandimento elevato e lasciare che l'area osservata al centro del campo visivo.Impostare le informazioni sulla posizione e sulla pila Z. Quindi, seleziona l'intensità del laser appropriata, gli strati di scansione e la velocità di imaging. Una volta che tutti i blocchi sono stati configurati, impostare il numero appropriato di cicli e iniziare la registrazione.Questo protocollo è stato utilizzato per iniettare un interleuchina-34 specifico per il fegato sul plasmide di espressione in embrioni di pesce transgenico, i macrofagi sono stati etichettati con GFP. L'ibridazione e l'immunosocienza a montaggio completo in situ sono state utilizzate per analizzare l'espressione dell'interleuchina-34 e dei macrofagi etichettati GFP. I numeri delle cellule macrofagi sono stati analizzati quantitativamente in interiettati e costruiscono la regione epatica e di coda degli embrioni iniettati.L'imaging dal vivo è stato utilizzato per osservare direttamente i macrofagi, etichettati come verdi, passando dal fegato di un pesce di controllo e migrando nel fegato di un interleuchina-34 sull'espressione del pesce. I passaggi importanti di questo protocollo includono la selezione di una linea transgenica adatta per etichettare la cellula di interesse. E tessuto appropriato per l'imaging della tua espressione di gene transgenico e un'adeguata finestra di tempo di osservazione.Questa tecnica potrebbe essere applicata per studiare la funzione di altre chemiochine sul comportamento di altre cellule, come cellule T e neutrofili in vivo.

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