Name: an ectopic chemokine expression model for testing macrophage recruitment in vivo
Uploaded: 2019-09-25T14:30:00
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私たちは、Tg(fabp10a:DsRed)トランスジェニックラインを共有するためのジンロンペン博士に感謝します。Tg(mpeg1:GFP)トランスジェニックラインを共有するためのジロン・ウェン博士。pTol2ベクターを提供する川上浩一博士。この研究は、中国国家自然科学財団(31771594)、広東科学技術計画プロジェクト(2019A030317001)、中央大学基礎研究基金(D2191450)によって支援されました。

注:全ての試料をフェニルチオール(PTU)卵水で処理し、色素を抑制した。
1. Tgの生成 (fabp10a:il34) トランスジェニックコンストラクトと魚の注入
<ol><li>ゼブラフィッシュの2.8kb fabp10aプロモーター8およびIL-34コード領域(ENSDART0000126460.3)をpTol2ベクターにクローンし、fabp10a-il34構築物を生成する。1細胞ステージTg(mpeg1:GFP)</em...

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-34+is+a+tissue-restricted+ligand+of+CSF1R+required+for+the+development+of+Langerhans+cells+and+microglia.">IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia.</a> Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).</li><li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+cytokine+and+its+receptor+by+functional+screening+of+the+extracellular+proteome.">Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome.</a> Science. 320 (5877), 807-811 (2008).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+overlap+but+differential+expression+of+CSF-1+and+IL-34+in+their+CSF-1+receptor-mediated+regulation+of+myeloid+cells.">Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells.</a> Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).</li><li>Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-34+Induces+the+Differentiation+of+Human+Monocytes+into+Immunosuppressive+Macrophages.+Antagonistic+Effects+of+GM-CSF+and+IFNc.">IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc.</a> PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan-1+regulates+the+biological+activities+of+interleukin-34.">Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).</li><li>Zhou, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-28-5p-IL-34-macrophage+feedback+loop+modulates+hepatocellular+carcinoma+metastasis.">miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis.</a> Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).</li><li>Gordon, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+expression+and+developmental+regulation+of+two+genes+coding+for+rat+fatty+acid+binding+proteins.">Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: a practical approach. , (2002).</li><li>Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopically+Expressed+IL-34+Can+Efficiently+Induce+Macrophage+Migration+to+the+Liver+in+Zebrafish.">Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).</li></ol>

ここで説明するプロトコルは、マクロファージン生体内の挙動に関するケモカインの機能を調べ、手順にはいくつかの技術的専門知識を必要とします。要約すると、プロトコルの合併症を避けるためにいくつかの重要なステップがあります:1)目的の細胞にラベルを付けるために、特定の強いトランスジェニック信号を示す適切なトランスジェニックラインを選択します。2)イメージングおよ?...

ゼブラフィッシュは、インド発祥の小さな熱帯硬骨淡水魚です。遺伝子保全に関しては、ゼブラフィッシュはヒト1と87%の類似性を持つ。ゼブラフィッシュの遺伝子調節、タンパク質機能、細胞行動(マイブレーション、増殖et.alなどの細胞行動を研究することにより、ヒトの関連する主題に関する洞察を提供します。ゼブラフィッシュ胚は、色素を阻害した後、異なる段階で初期胚の発達を観察するために使用することができる。一方、ゼブラフィッシュが性的成熟に発展するまでに3ヶ月しかかからないうちに、ゼブラフィッシュは4日ごとに数百個の卵を産むことができる。ミニサイズ、単純な繁殖、強力な生殖能力、これらの利点は、ゼブラフィッシュ培養を非常に省スペースにし、大規模な培養に役立ちます。従来の哺乳類モデルマウスはゼブラフィッシュよりもメンテナンスコストが高いため、マウスの飼育の規模が制限されます。初期の胚の発達の側面では、マウス胚は母親の子宮におけるマウス胚の発達の特徴のために生きている状態で観察することは困難である。それどころか、ゼブラフィッシュ胚は外部から発達し透明であるため、顕微鏡下で観察しやすい。さらに、ゼブラフィッシュは、関連する遺伝子機能研究のための様々なトランスジェニックラインを構築することが非常に容易である。現在、様々なゼブラフィッシュトランスジェニックラインは、異なるタイプの細胞に標識するために利用可能である。特定の場所でケモカインを過剰発現させるトランスジェニックラインを構築し、ゼブラフィッシュの細胞挙動に関するケモカイン機能を研究することは、今や非常に便利です。
ここでは、ビボ2、3、4、5、6、7におけるマクロファージ挙動に対するIL-34の機能を調べるためにゼブラフィッシュトランスジェニックラインを使用するワークフローを提供した。まず、遺伝子il34の肝臓特異的過剰発現プラスミドを構築し、蛍光タンパク質GFPによりマクロファージを特異的に標識した1細胞ステージTg(mpeg1:GFP)魚胚にプラスミドを注入した。次いで、その場で蛍光マウント全体を使用し、il34発現のパターンとマクロファージの数または位置を検出した。注入されたWT胚を、安定なトランスジェニックラインを生成するために上げた。これらのステップでは、サイトカイン産生ラインを確立し検証し、マクロファージ分布に及ぼす影響を視覚的に評価しました。最後に、サイトカインに応答するマクロファージの挙動を調べ、共焦点ライブイメージングを用いてマクロファージ移行を直接観察し、生体内のマクロファージ移行におけるil34の機能を確認した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-Anti-Goat antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-HRP&#160;</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEF832001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183; 2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3 Plus Amplification Reagent</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E2 solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mM&#160; NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 &#181;M&#160; KH2PO4 + 50 &#181;M&#160; Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum(FBS)</td>
			<td>Life</td>
			<td>10099-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>A100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridization buffer(HB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide+ 5&#215;SSC+9 mM sodium citrate+50 &#956;g/ml heparin sodium+ 500 &#956;g/ml tRNA+ 0.1% Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>1.17112.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 &#176;C&#160; to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 &#176;C. Caution. Manipulate with mask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea(PTU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Plus Amplification Diluent</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>E00492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215;Saline sodium citrate(SSC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBLK-fabp10a-il34-sv40</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSK-il34</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For il34 probe preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (mpeg1: GFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Label macrophages with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fabp10a: DsRed)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Label liver cells with DsRed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fab10a:il34)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Over-expression IL-34 in liver cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ectopic chemokine expression model for testing macrophage recruitment in vivo

ゼブラフィッシュは、基礎研究や生物医学研究で広く使用されています。多くのゼブラフィッシュトランスジェニックラインは、現在、様々なタイプの細胞に標識するために利用可能です。ゼブラフィッシュの透明な胚体のために、生体内の特定のタイプの細胞の挙動に対する1つのケモカインの影響を研究することは便利です。ここでは、生体内でのマクロファージ移行に関するケモカインの機能を調べるためのワークフローを提供した。IL-34を過剰発現させる組織特異的過剰発現プラスミドを構築し、マクロファージが蛍光タンパク質によって特異的に標識された1細胞段階のトランスジェニック魚胚にプラスミドを注入した。その後、その場で蛍光全体を使用し、ケモカイン発現のパターンとマクロファージの数または位置を検出した。注入されたWT胚を、安定なトランスジェニックラインを生成するために上げた。最後に、共焦点ライブイメージングを用いて、安定したトランスジェニック魚のマクロファージ挙動を直接観察し、生体内のマクロファージに対するIL-34の機能を調べた。

ゼブラフィッシュのプロトコルに関与する手順を図2に示します。まず、il34がfabp10aプロモーターによって駆動されたpBLK-fabp10a-il34-sv40コンストラクトを生成した(図2)。この構築物を、トランスジェニック安定線を生成するために成人に提起したGFPおよびWT胚でマクロファージに標識できるゼブラフィッシ?...

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An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

生体内でのマクロファージ募集に対するケモカインの効果を試験するために、その位置ハイブリダイゼーション中のマウント全体を使用してケモカインの異所性発現を検出し、免疫染色を用いてマクロファージの標識を行った。ライブイメージングは、マクロファージ移行のリアルタイム観察に使用されました。

生体内でのマクロファージ募集をテストするための異所性ケモカイン発現モデル

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

ここで説明するプロトコルは、ケモカインの機能とin vivoでのマクロファージの挙動を調べることができます。細胞の細胞の既存の実験モデルのほとんどは、インビトロ細胞実験に基づいています。しかし、インビトロ実験は、時には複雑な環境をvivoでモデル化するには単純すぎることがあります。また、生体内の化学引き上げ能力を表さない場合もある。これらの方法は、マウスにとって困難である直接細胞行動観察のためにシマウマ魚の特定の利点を利用する。TGFABP-10A インターロイキン-34 トランスジェニックコンストラクトを生成して開始します。.FABP-10Aインターロイキン-34コンストラクトをトランスジェニックなTg(mpeg1:GFP)トランスジェニックおよび野生型魚の胚にトランスポザーゼMRNAと一緒に注入します。原稿の指示に従って胚を上げて収集します。その後、摂氏4度または室温で2時間一晩4%パラホルムアルデヒドでそれらを固定します。固定後、PBSTで胚を洗浄ごとに5分間3回洗浄します。胚をPBSTで50%メタノールで別々に脱水し、続いて100%メタノールを脱水し、次いで新鮮な100%メタノールに変え、少なくとも2時間はマイナス20°Cで保存する。プローブハイブリダイゼーションの準備ができたら、胚をPBSTで50%メタノールで別々に再水和する。その後、PBSTで1回5分間3回洗浄します。室温でPBSTでプロテアーゼKで胚を消化する。次いで、消化液を廃棄し、室温で20分間4%パラホルムアルデヒドで固定を繰り返した。固定後、1回の洗浄で10分間PBSTで胚を2回洗浄します。65°Cの加熱ハイブリダイゼーションバッファを少なくとも1時間プリハイブリダイゼーションします。その後、インターロイキン-34プローブを摂氏65度に予熱し、10分間加熱します。ハイブリダイゼーションバッファーを元のチューブにリサイクルし、予熱プローブを摂氏65度で一晩でハイブリダイゼーションを行います。翌日、胚を50%ホルムアミドと2X SSCTで洗い、続いて2倍のSSCTを、次に摂氏65度で0.2X SSCTを洗浄します。各洗浄を1回20分で3回繰り返します。その後、1回の洗浄につき5分間PBSTで胚を3回洗浄する。室温で1時間のブロッキングバッファーの600ミリリットルでサンプルをブロックします。その後、抗ジゴキシゲニンHRP抗体溶液の400マイクロリットルを追加し、一晩摂氏4度で胚をインキュベートします。翌日、抗体を取り除き、PBSTで6回、洗浄ごとに20分間洗浄します。最後の洗浄後、各サンプルを30マイクロリットルの1Xプラス増幅希釈液で5分間洗い流します。フルオロフォア・チラミンの働く溶液中のサンプルを暗闇の中で5~15分間インキュベートします。信号が弱い場合はインキュベーション時間を30分に延長する。次いで、PBSTで1回10分間、胚を洗浄します。そして、一晩摂氏4度で一次抗体でそれらをインキュベートします。翌日、PBSTで5回洗浄して1回30分間洗浄し、一晩摂氏4度で二次抗体でインキュベートする。翌日、PBSTで1回10分間胚を3回洗い、暗闇の中で摂氏4度またはマイナス20度のグリセロールに長く保管します。画像化の前に、蛍光顕微鏡を使用してDS赤およびGFPの二重陽性胚を選択してください。魚を取り付けるには、金属浴を使用して1%低融解アガロースの1ミリリットルを摂氏90度以上に加熱します。その後、体温に冷却し、0.2%トリケーヌの50マイクロリットルで混合します。麻酔した胚を底面にカバースライド付きの小皿に移します。周囲の水を取り除き、ゆっくりと胚に低融解アガロースを落とします。アガロースが固まる前に魚の位置を慎重に設定し、肝臓領域をカバースライドの近くに保ちます。アガロースが固まったら、それを補強するためにアガロースの別の層で慎重に覆います。コンフォーカル顕微鏡キャリアテーブルに皿を置き、トリカインでE2溶液で魚を覆い、イメージングを開始します。共焦点顕微鏡を操作するには、Zen Black 2.3ソフトウェアを開いて[位置指定]をクリックし、インキュベーションを行い、温度を摂氏29度に設定します。取得メニューをクリックし、スマートセットアップメニューで必要なスキャンモードとレーザーを選択します。次に、Z スタックと位置を選択します。実験用デザイナーメニューをクリックし、最初のブロックでマルチブロック実験を有効にして、低倍率でサンプルを見つけます。次に、高倍率に切り替え、視野の中央に観察領域を入れましょう。位置とZスタック情報を設定します。次に、適切なレーザー強度、走査層、および撮像速度を選択します。すべてのブロックが設定されたら、適切なループ数を設定し、記録を開始します。このプロトコルは、GFPで標識されたマクロファージであるトランスジェニック魚の胚に発現プラスミドを介して肝臓特異的インターロイキン-34を注入するために使用された。フルマウント蛍光をその蛍光ハイブリダイゼーションおよび免疫染色で使用し、インターロイキン-34およびGFP標識マクロファージの発現を解析した。マクロファージ細胞数を未注入で定量的に分析し、注入された胚の肝臓および尾領域を構築した。ライブイメージングは、緑色とラベル付けされたマクロファージを直接観察し、対照魚の肝臓を通過し、魚を発現する上でインターロイキン-34の肝臓に移行するために使用されました。このプロトコルの重要なステップは、関心のある細胞にラベルを付けるために適切なトランスジェニックラインの選択を含む。そして、トランスジェニック遺伝子の発現を画像化するための適切な組織と同様、適切な観察時間枠。この技術は、生体内のT細胞および好中球のような他の細胞の挙動に関する他のケモカインの機能を研究するために適用することができる。

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