Name: an ectopic chemokine expression model for testing macrophage recruitment in vivo
Uploaded: 2019-09-25T14:30:00
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Tg (fabp10a: DsRed) 형질전환 라인을 공유해 주신 징롱 펑 박사에게 감사드립니다. Tg (mpeg1: GFP) 형질전환 선을 공유하기 위한 지롱 웬 박사; pTol2 벡터를 제공하는 가와카미 고이치 박사. 이 사업은 중국 국립자연과학재단(31771594), 광동과학기술계획사업(2019A030317001), 중앙대학교 기초연구기금(D2191450)의 지원을 받았다.

참고: 모든 시료를 페닐티우레아(PTU) 난자물에 의해 처리하여 안료를 억제하였다.
1. Tg의 생성(fabp10a:il34)형질전환 구성 및 물고기 주입
<ol><li>2.8 kb fabp10a 프로모터8 및 IL-34 코딩 영역(ENSDART0000000126460.3)을 pTol2 벡터내로 복제하여 fabp10a-il34 구획을 생성한다. 생성을 트랜스포사제 mRNA와 함께 1세포 단계Tg(mpeg1: GFP)및 WT 어?...

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-34+is+a+tissue-restricted+ligand+of+CSF1R+required+for+the+development+of+Langerhans+cells+and+microglia.">IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia.</a> Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).</li><li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+cytokine+and+its+receptor+by+functional+screening+of+the+extracellular+proteome.">Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome.</a> Science. 320 (5877), 807-811 (2008).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+overlap+but+differential+expression+of+CSF-1+and+IL-34+in+their+CSF-1+receptor-mediated+regulation+of+myeloid+cells.">Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells.</a> Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).</li><li>Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-34+Induces+the+Differentiation+of+Human+Monocytes+into+Immunosuppressive+Macrophages.+Antagonistic+Effects+of+GM-CSF+and+IFNc.">IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc.</a> PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan-1+regulates+the+biological+activities+of+interleukin-34.">Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).</li><li>Zhou, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-28-5p-IL-34-macrophage+feedback+loop+modulates+hepatocellular+carcinoma+metastasis.">miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis.</a> Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).</li><li>Gordon, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+expression+and+developmental+regulation+of+two+genes+coding+for+rat+fatty+acid+binding+proteins.">Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: a practical approach. , (2002).</li><li>Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopically+Expressed+IL-34+Can+Efficiently+Induce+Macrophage+Migration+to+the+Liver+in+Zebrafish.">Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).</li></ol>

여기에 설명된 프로토콜은 우리가 대식세포 생체의 행동에 대한 케모카인의 기능을 조사할 수 있게 해주며, 절차는 몇 가지 기술적 전문 지식이 필요합니다. 요약하면, 프로토콜내의 합병증을 피하기 위한 몇 가지 중요한 단계가 있다: 1) 관심 있는 세포를 라벨화하는 특이적이고 강한 형질전환 신호를 보여주는 적합한 형질전환 라인을 선택; 2) 이미징 및 형질전환 유전자 과발현에 접근할 수 있?...

제브라피쉬는 인도에서 유래한 작은 열대성 경뼈 민물고기입니다. 유전자 보존에 관해서는, 제브라피쉬는 인간1과87%의 유사성을 갖는다. 그것은 저희에게 유전자 조절, 단백질 기능 및 제브라피시에 있는 et.al 이동과 같은 세포 행동을 공부하여 인간의 관련 주제에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. Zebrafish 배아는 안료를 억제한 후 다른 단계에서 초기 배아의 발달을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 한편, 제브라피쉬가 성숙해지면 3개월밖에 걸리지 만, 제브라피쉬는 4일마다 수백 개의 알을 생산할 수 있습니다. 미니 크기, 간단한 번식, 강한 생식 능력, 이러한 장점은 제브라피시 문화를 매우 공간 절약, 대규모 문화에 도움이됩니다. 전통적인 포유류 모델 마우스는 제브라피시보다 유지 보수 비용이 높기 때문에 마우스 기르기의 규모를 제한합니다. 초기 배아 발달의 양태에서, 마우스 배아는 모체 자궁에서 마우스 배아 발달의 특성으로 인해 살아있는 상태에서 관찰하기 어렵다. 반대로, 제브라피시 배아는 외부에서 발달하고 투명하기 때문에 현미경으로 관찰하기 쉽습니다. 더욱이, 제브라피쉬는 관련 유전자 기능 연구를 위한 다양한 형질전환라인을 구성하기가 매우 용이하다. 현재 다양한 제브라피쉬 형질전환 라인을 사용하여 다양한 유형의 세포에 라벨을 부착할 수 있습니다. 특정 위치에서 화학모카인을 과도하게 표현하고 제브라피시의 세포 행동에 대한 케모카인 기능을 연구하기 위해 형질전환 선을 구성하는 것이 매우 편리합니다.
여기서, 우리는 생체2, 3,4,5,6,7에서대식세포 행동에 IL-34의 기능을 조사하기 위해 제브라피시 형질전환 라인을 사용하는 워크플로우를 제공했다. 첫째, 우리는 유전자 il34의 간 특이적 과발현 플라스미드를 구성하고 형광 단백질 GFP에 의해 대식세포를 특이적으로 표지한 1세포 단계 Tg(mpeg1: GFP) 물고기 배아에 플라스미드를 주입하였다. 이어서, 우리는 il34 발현의 패턴 및 대식세포의 수 또는 위치를 검출하기 위해 전체 마운트 형광을 실재화 및 면역 염색을 사용했다. 주입된 WT 배아는 안정적인 형질전환 라인을 생성하도록 제기되었다. 이 단계에서, 우리는 사이토카인 생산 라인을 설치하고 검증하고 대식세포 분포에서 볼 수 있는 효력을 시각적으로 평가했습니다. 마지막으로, 사이토카인에 반응하여 대식세포 거동을 조사하기 위해, 우리는 생체 내에서 대식세포 이동에 대한 il34의 기능을 확인하기 위해 대식세포 이동을 직접 관찰하기 위해 공초점 라이브 이미징을 사용했다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-Anti-Goat antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-HRP&#160;</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEF832001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183; 2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3 Plus Amplification Reagent</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E2 solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mM&#160; NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 &#181;M&#160; KH2PO4 + 50 &#181;M&#160; Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum(FBS)</td>
			<td>Life</td>
			<td>10099-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>A100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridization buffer(HB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide+ 5&#215;SSC+9 mM sodium citrate+50 &#956;g/ml heparin sodium+ 500 &#956;g/ml tRNA+ 0.1% Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>1.17112.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 &#176;C&#160; to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 &#176;C. Caution. Manipulate with mask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea(PTU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Plus Amplification Diluent</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>E00492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215;Saline sodium citrate(SSC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBLK-fabp10a-il34-sv40</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSK-il34</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For il34 probe preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (mpeg1: GFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Label macrophages with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fabp10a: DsRed)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Label liver cells with DsRed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fab10a:il34)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Over-expression IL-34 in liver cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ectopic chemokine expression model for testing macrophage recruitment in vivo

제브라피쉬는 기초 및 생물의학 연구에 널리 사용됩니다. 많은 제브라피쉬 형질전환 선은 현재 다양한 유형의 세포에 라벨을 붙일 수 있습니다. 제브라피시의 투명한 배아 몸으로 인해 생체 내에서 특정 유형의 세포의 행동에 대한 하나의 케모카인의 효과를 연구하는 것이 편리합니다. 여기서 우리는 생체 내에서 대식세포 마이그레이션에 대한 케모카인의 기능을 조사하는 워크플로우를 제공했습니다. 우리는 IL-34를 과발현하기 위하여 조직 특정 과발현 플라스미드를 건설하고 그의 대식세포가 형광 성 단백질에 의해 특별히 표지된 1 세포 단계 형질전환 물고기 태아로 플라스미드를 주입했습니다. 그런 다음 전체 마운트 형광을 계면 혼성화 및 면역 염색을 사용하여 케모카인 발현의 패턴과 대식세포의 수 또는 위치를 감지했습니다. 주입된 WT 배아는 안정적인 형질전환 라인을 생성하도록 제기되었다. 마지막으로, 우리는 생체 내에서 대식세포에 대한 IL-34의 기능을 연구하기 위해 안정적인 형질전환 어류에서 대식세포 거동을 직접 관찰하기 위해 공초점 라이브 이미징을 사용했습니다.

제브라피시 프로토콜에 관련된 단계는 그림 2에나와 있습니다. 먼저, 우리는 il34가 fabp10a 프로모터에 의해 구동된 pBLK-fabp10a-il34-sv40 구문(그림2)을생성하였다. 이 구획은 1세포 단계 Tg(mpeg1:GFP)로미세주입하였으며, 이는 성인용으로 사육된 GFP 및 WT 배아로 대식세포를 라벨링할 수 있는 제브라피시 배아...

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An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

생체 내에서 대식세포 모집에 대한 케모카인의 효과를 시험하기 위해, 시투 혼성화에서 전체 마운트를 사용하여 케모카인의 자궁외 발현을 검출하고, 면역염색을 사용하여 대식세포에 라벨을 붙이도록 하였습니다. 라이브 이미징은 대식세포 이동의 실시간 관찰에 사용되었다.

생체내 대식세포 모집 테스트를 위한 자궁외 체모카인 발현 모델

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

여기에 설명된 프로토콜은 우리가 생체 내에서 화학 요법의 기능과 대식세포의 행동을 조사 할 수 있습니다. 세포 화학증의 기존 실험 모델의 대부분은 체외 세포 실험에 기초한다. 그러나 시험관 내 실험은 때때로 생체 내복잡한 환경을 모델링하기에는 너무 간단합니다.또한, 그들은 생체 내에서 화학 능력의 화학을 나타내지 않을 수 있다. 이러한 방법은 마우스가 어려운 직접 세포 행동 관찰을 위해 얼룩말 물고기의 특정 이점을 활용합니다. TGFABP-10A 인터류키인-34 형질전환 구체를 생성하여 시작합니다.FABP-10A 인터류킨-34를 1개의 세포 단계 Tg(mpeg1:GFP)의 트랜스제닉 및 트랜스포사제 MRNA와 함께 야생형 물고기 배아로 주입한다. 원고 지침에 따라 배아를 올리고 수집합니다. 그런 다음, 4섭씨또는 실온에서 2시간 동안 하룻밤 사이에 4%의 파라포름알데히드로 수정합니다.고정 후, 세척 당 5 분 동안 PBST로 세 번 배아를 세척합니다. PBST에서 50%의 메탄올로 배아를 따로 탈수한 다음 100% 메탄올로 변경한 다음 신선한 100% 메탄올로 변경한 다음 최소 2시간 동안 음수 섭씨 20도에 저장합니다. 프로브 혼성화를 위해 준비되면 PBST에서 50 %의 메탄올에서 배아를 별도로 재수화하십시오.그런 다음, 세척 당 5 분 동안 PBST로 세 번 세척합니다. 실온에서 PBST에서 단백질제 K로 배아를 소화합니다. 그런 다음 소화 용액을 버리고 실온에서 20 분 동안 4 %의 파라 포름 알데히드로 고정을 반복하십시오.고정 후, 세척 당 10 분 동안 PBST로 배아를 두 번 씻으십하십시오. 가열 된 혼성화 버퍼로 적어도 한 시간 동안 섭씨 65도에서 사전 혼성화를 수행하십시오. 그런 다음 인터류신-34 프로브를 섭씨 65도로 예열하여 10분 동안 예열합니다.혼성화 버퍼를 원래 튜브로 재활용하고 예열된 프로브를 통해 밤새 섭씨 65도에서 혼성화를 수행합니다. 다음 날, 50%의 포르마이드와 2X SSCT로 배아를 씻고 2배 SSCT, 섭씨 65도에서 0.2X SSCT로 뒤를 잇는다. 세차당 20분씩 세 번 씻는 다.그런 다음, 세척 당 5 분 동안 PBST로 배아를 세 번 씻는다. 실온에서 1시간 동안 600밀리리터의 블로킹 버퍼로 샘플을 차단합니다. 그런 다음, 항 디곡시겐 HRP 항체 용액의 400 마이크로 리터를 추가하고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배아를 배양합니다.다음 날, 항체를 제거하고 세척 당 20 분 동안 PBST로 6 번 배아를 세척하십시오. 마지막 세척 후 각 샘플을 1X 30 마이크로리터와 5분간 증폭 희석제로 헹구는 다. 어둠 속에서 5~15분 동안 플루오로포레 티라민 작업 용액의 샘플을 배양합니다.신호가 약한 경우 인큐베이션 시간을 30분으로 연장합니다. 그런 다음, 세척 당 10 분 동안 PBST로 세 번 배아를 씻는다. 그리고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 1 차 항체로 배양하십시오.다음 날, PBST로 배아를 세척 당 30 분 동안 5 번 씻고 하룻밤 사이에 4도에서 이차 항체로 배양하십시오. 다음 날, PBST에서 세 번 배아를 세척 당 10 분 동안 씻고, 4 섭씨 또는 음의 20도에서 어둠 속에서 70 %의 글리세롤에 보관하십시오. 이미징에 앞서, 형광 현미경을 사용하여 DS 적색 및 GFP 이중 양성 배아를 선택합니다.물고기를 장착하려면 금속 목욕을 사용하여 1 % 낮은 녹는 아가로즈1 밀리리터를 섭씨 90도 이상으로 가열하십시오. 그런 다음 체온으로 식히고 0.2 % 트리카인의 50 마이크로 리터에 섞습니다. 마취된 배아를 바닥에 덮개 슬라이드가 장착된 작은 접시에 옮기.주변 물을 제거하고 천천히 배아에 낮은 녹는 아가로즈를 떨어 뜨립니다. 아가로즈가 고화되기 전에 물고기의 위치를 신중하게 설정하여 간 부위를 덮개 슬라이드에 가깝게 유지합니다. 아가로즈가 굳어지면, 그것을 강화하기 위해 아가로즈의 또 다른 층으로 조심스럽게 덮어주세요.공초점 현미경 캐리어 테이블에 접시를 놓고, 트리카인으로 E2 용액으로 물고기를 덮고, 이미징을 시작합니다. 공초점 현미경을 작동하려면 Zen Black 2.3 소프트웨어를 열고 위치를 클릭한 다음 인큐베이션을 클릭한 다음 온도를 섭씨 29도로 설정합니다. 획득 메뉴를 클릭하고 스마트 설정 메뉴에서 필요한 스캔 모드와 레이저를 선택합니다.그런 다음 Z 스택 및 위치를 선택합니다. 실험 디자이너 메뉴를 클릭하고 낮은 배율에서 샘플을 찾기 위해 첫 번째 블록에서 멀티 블록 실험을 활성화 선택합니다. 그런 다음, 높은 배율로 전환하고 시야의 중심에 관찰 된 영역을 보자.위치 및 Z 스택 정보를 설정합니다. 그런 다음 적절한 레이저 강도, 스캐닝 레이어 및 이미징 속도를 선택합니다. 모든 블록을 설정하면 적절한 루프 수를 설정하고 레코딩을 시작합니다.이 프로토콜은 간 특정 인터류킨-34 발현 플라스미드를 형질식 물고기 배아로 주입하는 데 사용되었으며, 대식세포는 GFP로 표시되었다. 시상 혼성화 및 면역염색내의 풀 마운트 형광은 인터류빈-34 및 GFP 표지 된 대식세포의 발현을 분석하기 위해 사용되었다. 대식세포 수는 주입되지 않은 배아의 간 및 꼬리 부위를 주입하여 정량적으로 분석되었다.라이브 이미징은 대식세포, 녹색으로 표시되어 대조어의 간을 통과하고 물고기를 표현하는 동안 인터류킨-34의 간으로 이동하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 관심있는 셀에 레이블을 지정하는 적합한 형질 전환선의 선택을 포함한다. 그리고 적절한 관측 시간 창뿐만 아니라 형질 전환 유전자의 발현을 이미징하기위한 적절한 조직.이 기술은 생체 내T 세포 및 호중구와 같은 다른 세포의 행동에 대한 다른 chemokines의 기능을 연구하기 위해 적용 될 수있다.

Research

JoVE Journal

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연구

발생학

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공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

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Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

조사 Trypanosoma cruzi 운동 비보 를 동물 모델로 서 애벌레 Zebrafish의 설립

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

C. 선 충 에서 신경 세포를 세균 세포를 재 설 정할 RNAi 및 열 충격 유도 하는 전사 인자 식의 적용

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

세 인간 Bruch 막의 Ex Vivo 모델에서 망막 안료 상피 세포의 배양

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

연구 조직 이식에 세균성 부착을 병렬 플레이트 관류 시스템의 생체 외에서 모델

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...