Name: an ectopic chemokine expression model for testing macrophage recruitment in vivo
Uploaded: 2019-09-25T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo at JoVE.com

Dr. Jingrong Peng'e Tg (fabp10a: DsRed) transgenik hattını paylaştığı için teşekkür ederiz; Dr Zilong Wen Tg (mpeg1: GFP) transgenik hatları paylaşmak için; Dr. Koichi Kawakami pTol2 vektörü sağladığı için. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31771594), Guangdong Bilim ve Teknoloji Planı projeleri (2019A030317001) ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (D2191450) tarafından desteklenmiştir.

NOT: Tüm örnekler pigmentini inhibe etmek için fenilthiourea (PTU) yumurta suyu ile tedavi edildi.
1. Tg Üretimi (fabp10a:il34) Transgenik Yapılar ve Balık Enjeksiyonu
<ol><li>Clone 2.8 kb fabp10a organizatörü8 ve IL-34 kodlama bölgeleri (ENSDART00000126460.3) pTol2 vektör içine fabp10a-il34 inşa oluşturmak için zebra balığı. Yapıları transposase mRNA ile birlikte tek hücreli evre Tg (mpeg1: ...

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-34+is+a+tissue-restricted+ligand+of+CSF1R+required+for+the+development+of+Langerhans+cells+and+microglia.">IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia.</a> Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).</li><li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+cytokine+and+its+receptor+by+functional+screening+of+the+extracellular+proteome.">Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome.</a> Science. 320 (5877), 807-811 (2008).</li><li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+overlap+but+differential+expression+of+CSF-1+and+IL-34+in+their+CSF-1+receptor-mediated+regulation+of+myeloid+cells.">Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells.</a> Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).</li><li>Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-34+Induces+the+Differentiation+of+Human+Monocytes+into+Immunosuppressive+Macrophages.+Antagonistic+Effects+of+GM-CSF+and+IFNc.">IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc.</a> PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).</li><li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan-1+regulates+the+biological+activities+of+interleukin-34.">Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).</li><li>Zhou, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-28-5p-IL-34-macrophage+feedback+loop+modulates+hepatocellular+carcinoma+metastasis.">miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis.</a> Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).</li><li>Gordon, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+expression+and+developmental+regulation+of+two+genes+coding+for+rat+fatty+acid+binding+proteins.">Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: a practical approach. , (2002).</li><li>Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopically+Expressed+IL-34+Can+Efficiently+Induce+Macrophage+Migration+to+the+Liver+in+Zebrafish.">Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).</li></ol>

Burada açıklanan protokol bize makrofajin vivo davranışı üzerinde bir kemokin işlevini araştırmak için izin verir ve prosedür bazı teknik uzmanlık gerektirir. Özetle, protokoldeki komplikasyonları önlemek için birkaç kritik adım vardır: 1) ilgi hücresini etiketlemek için spesifik ve güçlü transgenik sinyal gösteren uygun bir transgenik çizgi seçin; 2) görüntüleme ve transgenik gen aşırı ekspresyonu için erişilebilir uygun bir doku seçin; 3) hassas ve spesifik bir RNA probu yapmak; 4) ...

Zebra balığı Hindistan kökenli küçük bir tropikal sert kemikli tatlı su balığıdır. Gen koruma ile ilgili olarak, zebra balıkları insan1%87 benzerlik var. Zebra balıklarında gen regülasyonu, protein fonksiyonu ve hücre davranışı, et.al gibi hücre davranışlarını inceleyerek bize insanla ilgili konular hakkında bilgi verebilir. Zebrabalığı embriyosu pigmentini inhibe ettikten sonra farklı evrelerde erken embriyoların gelişimini gözlemlemek için kullanılabilir. Bu arada, zebra balıklarının cinsel olgunluğa dönüşmesi sadece üç ay sürer, o zaman zebra balığı her 4 günde bir yüzlerce yumurta üretebilir. Mini boyutlu, basit üreme, güçlü üreme kapasitesi, bu avantajlar zebra balığı kültürünü çok yer tasarrufu sağlar, büyük ölçekli kültüre elverişli dir. Geleneksel memeli model fare zebra balığıdaha yüksek bakım maliyetleri vardır, bu nedenle fare yetiştirme ölçeğini sınırlayan. Erken embriyo gelişimi açısından, fare embriyosu anne rahminde fare embriyo gelişiminin özellikleri nedeniyle canlı durumda gözlemlemek zordur. Aksine, zebra balığı embriyoları dışarıdan gelişir ve saydamdır, bu nedenle mikroskop altında gözlemlemek kolaydır. Ayrıca, zebra balığı ilgili gen fonksiyonu araştırma için transgenik çizgiler çeşitli inşa etmek çok kolaydır. Şu anda, çeşitli zebra balığı transgenik hatları hücrelerin farklı etiket mevcuttur. Kemokinleri belirli yerlerde aşırı eksprese etmek ve keokinlerin zebra balıklarındaki hücre davranışı üzerine çalışmasını incelemek için transgenik çizgiler oluşturmak artık çok uygundur.
Burada, il-34'ün in vivo2,3,4,5,6,7makrofaj davranışı üzerindeki işlevini araştırmak için zebra balığı transgenik hattını kullanmak için bir iş akışı sağladık. İlk olarak, il34 geninin karaciğere özgü aşırı ekspresyon plazmidini inşa ettik ve plazmidi tek hücreli evre Tg'ye (mpeg1: GFP) enjekte ettik ve bu da makrofajları özellikle floresan protein GFP ile etiketledi. Daha sonra, il34 ekspresyonunun desenini ve makrofajların sayısını veya yerini tespit etmek için yerinde hibridizasyon ve immünboyamada tüm montaj floresanını kullandık. Enjekte edilen WT embriyoları kararlı bir transgenik çizgi oluşturmak için yetiştirildi. Bu adımlarda sitokin üreten çizgiyi oluşturduk ve doğruladık ve makrofaj dağılımında görülebilecek etkileri görsel olarak değerlendirdik. Son olarak, sitokine yanıt olarak makrofaj davranışını araştırmak için, in vivo makrofaj göçünde il34'ün işlevini doğrulamak için makrofaj göçüne doğrudan gözlemlemek için konfokal canlı görüntüleme kullandık.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-Anti-Goat antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-HRP&#160;</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEF832001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat-Anti-GFP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183; 2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>21097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanine 3 Plus Amplification Reagent</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E2 solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mM&#160; NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 &#181;M&#160; KH2PO4 + 50 &#181;M&#160; Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum(FBS)</td>
			<td>Life</td>
			<td>10099-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Diamond</td>
			<td>A100314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V900860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin sodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridization buffer(HB)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50% formamide+ 5&#215;SSC+9 mM sodium citrate+50 &#956;g/ml heparin sodium+ 500 &#956;g/ml tRNA+ 0.1% Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low melting agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>GHTECH</td>
			<td>1.17112.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 &#176;C&#160; to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 &#176;C. Caution. Manipulate with mask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10&#215;PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea(PTU)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#215;Plus Amplification Diluent</td>
			<td>perkinelmer</td>
			<td>NEL745001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K&#160;</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>E00492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#215;Saline sodium citrate(SSC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tricaine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R6625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBLK-fabp10a-il34-sv40</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pBSK-il34</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For il34 probe preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (mpeg1: GFP)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Label macrophages with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fabp10a: DsRed)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Label liver cells with DsRed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg (fab10a:il34)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Over-expression IL-34 in liver cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ectopic chemokine expression model for testing macrophage recruitment in vivo

Zebra balıkları temel ve biyomedikal araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Birçok zebra balığı transgenik hatları şu anda hücrelerin çeşitli etiketlemek için kullanılabilir. Zebra balığının saydam embriyonik gövdesi sayesinde, bir kemokinin in vivo hücrelerinin belirli bir türünün davranışı üzerindeki etkisini incelemek bizim için uygundur. Burada in vivo makrofaj göçü üzerine bir kemokin işlevini araştırmak için bir iş akışı sağladı. IL-34'ü aşırı ekspresye etmek için dokuya özgü aşırı ekspresyon plazmidi yaptık ve plazmidi makrofajları özellikle floresan proteinle etiketlenmiş tek hücreli transgenik balık embriyolarına enjekte ettik. Daha sonra keokin ekspresyonu paterni ve makrofajların sayısını veya yerini saptamak için yerinde hibridizasyon ve immünboyama tüm montaj floresan kullanılır. Enjekte edilen WT embriyoları kararlı bir transgenik çizgi oluşturmak için yetiştirildi. Son olarak, in vivo makrofajlar üzerinde IL-34 işlevini incelemek için doğrudan kararlı transgenik balık makrofaj davranışı gözlemlemek için konfokal canlı görüntüleme kullanılır.

Zebra balığı protokolünde yer alan adımlar Şekil 2'degösterilmiştir. İlk olarak, il34'ün fabp10a organizatörü tarafından yönlendirildiği pBLK-fabp10a-il34-sv40 yapısını oluşturduk (Şekil 2). Yapı, transgenik kararlı hat oluşturmak için yetişkinlere yetiştirilen GFP ve WT embriyoları ile makrofajları etiketleyebilen tek hücreli evre Tg (mpeg1: GFP)zebra balığı emb...

Watch this Scientific Journal Video about An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo at JoVE.com

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Bir kemokinin in vivo makrofaj alımı üzerindeki etkisini test etmek için, yerinde hibridizasyondaki tüm montaj, kemokinin ektopik ekspresyonunu saptamak için kullanıldı ve makrofajları etiketlemek için immünboyama kullanıldı. Makrofaj göçünün gerçek zamanlı gözlemi için canlı görüntüleme kullanıldı.

Vivo Makrofaj İşe Test için Bir Ektopik Kemokin İfade Modeli

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

Burada açıklanan protokol, bir kemokinin işlevini ve in vivo makrofaj davranışını araştırmamıza olanak sağlar. Hücre kemotaksismevcut deneysel modellerin çoğu in vitro hücre deneyleri dayanmaktadır. Ama in vitro deneyler bazen in vivo karmaşık ortamı modellemek için çok basittir.Ayrıca, in vivo kemoattraction yeteneğini temsil olmayabilir. Bu yöntemler, fareler için zor olan doğrudan hücre davranışı gözlemi için zebra balığının özel avantajını kullanır. TGFABP-10A interlökin-34 transgenik yapılar üreterek başlayın.FABP-10A interlökin-34'ü transposaz MRNA ile birlikte bir hücre evresine enjekte edin Tg (mpeg1:GFP)transgenik ve yabani tip balık embriyoları halinde bir hücre evresine dönüştürün. El yazması talimatlara göre embriyoları toplayın ve kaldırın. Daha sonra, 4 santigrat derece veya oda sıcaklığında iki saat boyunca gecede% 4 paraformaldehit ile düzeltin.Fiksasyondan sonra embriyoları pbst ile üç kez yıkayın ve beş dakika yıkayın. PBST%50 metanol ile ayrı ayrı embriyoları kurutun, ardından %100 metanol, sonra taze %100 metanol değiştirin ve en az 2 saat negatif 20 santigrat derecede saklayın. Sonda hibridizasyonu için hazır olduğunuzda, PBST%50 metanol ile embriyoları ayrı ayrı yeniden sulendirin.Daha sonra, yıkama başına beş dakika pbst ile üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında PBST proteinaz K ile embriyosi sindirin. Daha sonra, sindirim çözeltisi atın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile fiksasyon tekrarlayın.Fiksasyondan sonra embriyoları pbst ile iki kez yıkama başına 10 dakika yıkayın. En az bir saat boyunca 65 santigrat derecede ısıtmalı hibridizasyon tamponu ile prehibridizasyon gerçekleştirin. Daha sonra interlökin-34 sondasını 10 dakika boyunca 65 dereceye ısıtın.Hibridizasyon tamponunu orijinal tüpe geri dönüştürün ve bir gecede önceden ısıtılmış sondayla 65 santigrat derecede hibridizasyon gerçekleştirin. Ertesi gün, embriyoları %50 formamid ve 2X SSCT ile yıkayın ve ardından 2X SSCT ve ardından 65 santigrat derecede 0.2X SSCT. Her yıkama başına 20 dakika ile üç kez tekrarlayın.Daha sonra embriyoları PBST ile üç kez yıkayın ve her yıkama başına beş dakika yıkayın. 600 mililitre bloke tamponu ile numuneleri oda sıcaklığında bir saat boyunca engelleyin. Sonra, anti-digoksigenin HRP antikor çözeltisi 400 mikrolitre ekleyin ve bir gecede dört derece santigrat embriyolar inkübün.Ertesi gün, antikor kaldırmak ve yıkama başına 20 dakika PBST ile altı kez embriyoları yıkayın. Son yıkamadan sonra, her numuneyi 30 mikrolitre 1X artı amplasyon dilüentile beş dakika durulayın. Florofor tiramin çalışma çözeltisi içinde örnekleri karanlıkta 5 ila 15 dakika kuluçkaya yatırın.Sinyaller zayıfsa kuluçka süresini 30 dakikaya uzatın. Daha sonra embriyoları PBST ile üç kez yıkayın ve 10 dakika yıkayın. Ve onları bir gecede dört santigrat derecede birincil antikorla kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, embriyoları pbst ile beş kez yıkama başına 30 dakika yıkayın ve bir gecede dört santigrat derecede ikincil antikorlarla kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, yıkama başına 10 dakika PBST üç kez embriyoyıkamak ve daha uzun süre dört derece santigrat veya negatif 20 derece santigrat karanlıkta% 70 gliserol onları saklayın. Görüntülemeden önce, DS kırmızı ve GFP çift pozitif embriyoları seçmek için floresan mikroskobu kullanın.Balık monte etmek için, 90 santigrat derece üzerinde% 1 düşük erime agarose bir mililitre ısıtmak için bir metal banyo kullanın. Sonra, vücut ısısına soğutun ve% 0.2 tricaine 50 mikrolitre karıştırın. Anestezili embriyoları alt tabakada bir kapak slaytı ile monte edilmiş küçük bir tabağa aktarın.Çevreleyen su çıkarın ve yavaş yavaş embriyolar üzerinde düşük erime agarose bırakın. Dikkatle agarose katılaşmış önce balık konumunu ayarlayın, kapak slayt yakın karaciğer alanı tutarak. Bir kez agarose katılaşmış, dikkatle agarose başka bir tabaka ile kapsayacak şekilde güçlendirmek için.Kabı konfokal mikroskop taşıyıcı masasına yerleştirin, balığı ntrikal ile E2 çözeltisi ile kaplayın ve görüntülemeye başlayın. Konfokal mikroskobu çalıştırmak için Zen Black 2.3 yazılımını açın ve bul'u, sonra kuluçkayı tıklatın ve sıcaklığı 29 dereceye ayarlayın. Edinme menüsüne tıklayın ve akıllı kurulum menüsünde gerekli tetkik modunu ve lazerleri seçin.Sonra Z-yığını nı ve konumunu seçin. Deneysel tasarımcı menüsüne tıklayın ve düşük büyütme altında örnek bulmak için ilk blokta çoklu blok deney etkinleştir'i seçin. Daha sonra, yüksek büyütme geçmek ve görme alanının merkezinde gözlenen alan sağlar.Konumu ve Z-yığın bilgilerini ayarlayın. Ardından, uygun lazer yoğunluğunu, tarama katmanlarını ve görüntüleme hızını seçin. Tüm bloklar ayarlandıktan sonra, uygun döngü sayısını ayarlayın ve kaydetmeye başlayın.Bu protokol, makrofajları GFP ile etiketlenen transgenik balık embriyolarına ekspresyon plazmidi üzerine karaciğere özgü interlökin-34 enjekte etmek için kullanıldı. Interlökin-34 ve GFP etiketli makrofajların ekspresyonunu analiz etmek için yerinde tam montaj floresanve immünboyama kullanıldı. Makrofaj hücre sayıları enjekte edilmemiş embriyoların karaciğer ve kuyruk bölgesinde nicel olarak analiz edildi ve yapılandı.Canlı görüntüleme, kontrol eden bir balığın karaciğerinden geçen ve balıkları ifade eden bir interlökin-34'ün karaciğerine göç eden, yeşil etiketli makrofajları doğrudan gözlemlemek için kullanıldı. Bu protokolün önemli adımları ilgi hücre etiketlemek için uygun bir transgenik hat seçimi içerir. Transgenik gen ekspresyonunuzun görüntülenmesi için uygun doku ve uygun bir gözlem süresi penceresi.Bu teknik, diğer kemokinlerin işlevini t-hücreleri ve nötrofiller in vivo gibi diğer hücrelerin davranışı üzerine incelemek için uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Larva Zebra balığı Skin bir İndüklenebilir Gal4 / UAS İfade Sisteminin Kullanılması doğuştan gelen bağışıklık ve preneoplastik Hücre Etkileşimleri Canlı Görüntüleme

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Zebra balığı bir Etanol kaynaklı Fibrotik Karaciğer Modelinin Geliştirilmesi progenitör hücre-aracılı Hepatosit Rejenerasyon Eğitim

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

İlaç Tedavi ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Medaka Balık Osteoporoz Modelinde Osteoblast-Osteoklast Etkileşimler Görüntüleme

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

bir<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Yöntem kültürlü Rat Mezenterik Mikrovasküler Ağları Time-Lapse Görüntüleme için

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Bir Ex Vivo modeli yaşlı insan Bruch'ın membran bir retina Pigment epitel hücrelerinin kültürü

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Vitro modeli doku grefti bakteriyel bağlılık çalışmaya paralel-plaka perfüzyon sistemi

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...