Name: encapsulated cell technology for the delivery of biologics to the mouse eye
Uploaded: 2020-03-30T13:00:00
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L’étude a été appuyée en partie par des subventions accordées à B. R. par les National Institutes of Health (R01EY019320), le ministère des Anciens Combattants (RX0004444 et BX003050) et la South Carolina SmartState Endowment.

Toutes les expériences ont été effectuées conformément à l’Énoncé ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et de la recherche sur la vision et ont été approuvées par le Medical University of South Carolina Animal Care and Use Committee en vertu du protocole ID 00399.
1. Culture cellulaire
<ol><li>Générer des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes humaines (ARPE-19) lignée cellulaire exprimant de façon stable le gène de choix selon les p...

<ol>
	<li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+systems:+entering+the+mainstream.">Drug delivery systems: entering the mainstream.</a> Science. 303 (5665), 1818-1822 (2004).</li><li>Tonnesen, H. H., Karlsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+in+drug+delivery+systems.">Alginate in drug delivery systems.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 28 (6), 621-630 (2002).</li><li>Vilos, C., Velasquez, L. 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Uma nova estrat&#233;gia para produzir um dispositivo para entrega de f&#225;rmacos que ser&#225; usado na regenera&#231;&#227;o da pele. , (2012).</li><li>Huang, S., Fu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+derived+materials-based+cell+and+drug+delivery+systems+in+skin+regeneration.">Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration.</a> Journal of Controlled Release. 142 (2), 149-159 (2010).</li><li>Nograles, N., Abdullah, S., Shamsudin, M. N., Billa, N., Rosli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+characterization+of+pDNA-loaded+alginate+microspheres+for+oral+administration+in+mice.">Formation and characterization of pDNA-loaded alginate microspheres for oral administration in mice.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (2), 133-140 (2012).</li><li>Moore, K., Amos, J., Davis, J., Gourdie, R., Potts, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polymeric+microcapsules+containing+a+low+molecular+weight+peptide+for+controlled+release.">Characterization of polymeric microcapsules containing a low molecular weight peptide for controlled release.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (1), 213-226 (2013).</li><li>Xu, Y., Skotak, M., Hanna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+encapsulation+of+water-soluble+protein+with+polylactide.+I.+Effects+of+formulations+and+process+on+morphology+and+particle+size.">Electrospray encapsulation of water-soluble protein with polylactide. I. Effects of formulations and process on morphology and particle size.</a> Journal of Microencapsulation. 23 (1), 69-78 (2006).</li><li>Gryshkov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+engineering+of+high+voltage+alginate+encapsulation+of+mesenchymal+stem+cells.">Process engineering of high voltage alginate encapsulation of mesenchymal stem cells.</a> Materials Science and Engineering: C. 36, 77-83 (2014).</li><li>Thanos, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+secretion+of+ciliary+neurotrophic+factor+to+the+vitreous,+using+the+encapsulated+cell+therapy-based+NT-501+intraocular+device.">Sustained secretion of ciliary neurotrophic factor to the vitreous, using the encapsulated cell therapy-based NT-501 intraocular device.</a> Tissue Engineering. (11-12), 1617-1622 (2004).</li><li>Kauper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-year+intraocular+delivery+of+ciliary+neurotrophic+factor+by+encapsulated+cell+technology+implants+in+patients+with+chronic+retinal+degenerative+diseases.">Two-year intraocular delivery of ciliary neurotrophic factor by encapsulated cell technology implants in patients with chronic retinal degenerative diseases.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (12), 7484-7491 (2012).</li><li>Kauper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term,+sustained+intraocular+delivery+of+a+VEGF+antagonist+using+encapsulated+cell+technology+implant+for+the+treatment+of+choroidal+neovascular+diseases.">Long term, sustained intraocular delivery of a VEGF antagonist using encapsulated cell technology implant for the treatment of choroidal neovascular diseases.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53, 455 (2012).</li><li>Annamalai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulated+Cell+Technology-Based+Delivery+of+a+Complement+Inhibitor+Reduces+Choroidal+Neovascularization+in+a+Mouse+Model.">Encapsulated Cell Technology-Based Delivery of a Complement Inhibitor Reduces Choroidal Neovascularization in a Mouse Model.</a> Translational Visual Science Technology. 7 (2), 3 (2018).</li><li>Alge, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+Pigment+Epithelium+Is+Protected+Against+Apoptosis+by+&#945;B-Crystallin.">Retinal Pigment Epithelium Is Protected Against Apoptosis by &#945;B-Crystallin.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 43 (11), 3575-3582 (2002).</li><li>Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreous+injection+for+establishing+ocular+diseases+model.">Intravitreous injection for establishing ocular diseases model.</a> Journal of Visualized Experiments. 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M., Ramo, K., Kumar-Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Non+Membrane-Targeted+Human+Soluble+CD59+Attenuates+Choroidal+Neovascularization+in+a+Model+of+Age+Related+Macular+Degeneration.">A Non Membrane-Targeted Human Soluble CD59 Attenuates Choroidal Neovascularization in a Model of Age Related Macular Degeneration.</a> PLoS ONE. 6 (4), e19078 (2011).</li><li>Vincent, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+combination+PDGF+/+VEGF-antagonist+ECT+devices.">Generation of combination PDGF / VEGF-antagonist ECT devices.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54, 3290 (2013).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+delivered+by+encapsulated+cell+intraocular+implants+for+treatment+of+geographic+atrophy+in+age-related+macular+degeneration.">Ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for treatment of geographic atrophy in age-related macular degeneration.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (15), 6241-6245 (2011).</li><li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+for+macular+telangiectasia+type+2:+results+from+a+phase+1+safety+trial.">Ciliary neurotrophic factor for macular telangiectasia type 2: results from a phase 1 safety trial.</a> American Journal of Ophthalmology. 159 (4), 659-666 (2015).</li><li>Birch, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+trial+of+ciliary+neurotrophic+factor+delivered+by+encapsulated+cell+intraocular+implants+for+retinitis+pigmentosa.">Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa.</a> American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 283-292 (2013).</li></ol>

Cette technique d’encapsulation cellulaire est relativement rapide et facile à exécuter; toutefois, il faut garder certains points à l’esprit pour obtenir des résultats précis en aval. Les cellules doivent être maintenues en culture dans un plat Petri avant l’encapsulation et maintenues à la confluence appropriée. L’encapsulation doit être effectuée dans un capot de ventilation approprié avec le flux d’air réglementé, si possible. Un courant d’air trop fort peut affecter la formation de capsules,...

Les thérapies à base de cellules représentent des techniques biologiques révolutionnaires qui ont été largement appliquées en médecine. Récemment, ils ont été appliqués avec succès dans le traitement des maladies neurodégénératives, des maladies oculaires et du cancer. Les thérapies cellulaires couvrent un large éventail de domaines allant du remplacement cellulaire à l’administration de médicaments, et ce protocole se concentre sur ce dernier. Les microcapsules alginate biodégradables (MC) ont montré leur efficacité en tant que système d’administration, et elles sont de plus en plus largement utilisées dans le domaine biomédical. L’alginate a été utilisé en microencapsulation en raison de son processus de gélification simple, biodégradabilité, excellente biocompatibilité, et la stabilité dans des conditions in vivo1,2,3,4.
La méthode de l’électrospray, en tant que technique de microencapsulation, a été utilisée avec succès pour encapsuler les peptides et les protéines à l’aide d’alginate (polymère de base) et de poly-l-ornithine (polymère de revêtement secondaire). Les deux polymères sont naturellement trouvés et utilisés pour leur biocompatibilité5,6,7. Cependant, le principal défi dans les thérapies à base de cellules est la suppression du système immunitaire hôte pour éviter les effets secondaires causés par les médicaments immunosuppresseurs. La perméabilité des microcapsules alginées est considérée comme une propriété appropriée pour l’encapsulation cellulaire, qui permet la diffusion de nutriments, de déchets et de facteurs thérapeutiques dans et hors des cellules tout en les masquant de la réponse immunitaire hôte8,9,10.
Dans l’œil, des cellules encapsulées ont été utilisées dans des essais cliniques pour l’administration constante de produits biologiques (c.-à-d. les facteurs de croissance11,12 et les antagonistes du facteur de croissance13) pour le traitement de la rétinite pigmentaire ou de la dégénérescence maculaire liée à l’âge. D’autres cibles telles que les inhibiteurs de complément14 sont également actuellement explorées dans des contextes précliniques.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G 1&#34; Blunt needle</td>
			<td>SAI Infusion technology</td>
			<td>B30-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginic acid sodium salt, from brown algae</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%)</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 17478-215-15</td>
			<td>for pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>DG518105 500029609 REF 309625</td>
			<td>to generate the guide hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, Anhydrous, granular</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal Tears</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td>to lubricate the eyes during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile)</td>
			<td>Altaire Pharmaceuticals Inc.</td>
			<td>NDC 59390-182-13</td>
			<td>to lubricate the eyes during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Needle/syringe Tip: 27 Gauge, Small Hub RN NDL, custum length (12mm), point style 3, 6/PK</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-01</td>
			<td>for intravitreal delivery of capsules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Syringe: 2.5 &#181;L, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7632-01</td>
			<td>for intravitreal delivery of capsules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer, 1M</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP299100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage generator</td>
			<td>ESD EMC Technology</td>
			<td>ES813-D20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ornithine hydrochloride, 99%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>NDC 61314-631-36</td>
			<td>antibiotic to prevent infection after intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%)</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 17478-201-15</td>
			<td>for pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters, 0.2 um</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28143-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>GRASEBY</td>
			<td>MS16A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

encapsulated cell technology for the delivery of biologics to the mouse eye

Beaucoup de thérapies actuelles en cours de développement pour les maladies du pôle postérieur de l’œil sont des produits biologiques. Ces médicaments doivent être administrés fréquemment, généralement par injections intravitréennes. Les cellules encapsulées exprimant le produit biologique de choix deviennent un outil de production et de libération de protéines locales (p. ex., par l’entremise de l’administration de médicaments à long terme). En outre, les systèmes d’encapsulation utilisent des matériaux perméables qui permettent la diffusion de nutriments, de déchets et de facteurs thérapeutiques dans et hors des cellules. Cela se produit tout en masquant les cellules de la réponse immunitaire de l’hôte, en évitant la nécessité de la suppression du système immunitaire hôte. Ce protocole décrit l’utilisation de l’alginate comme polymère dans la microencapsulation couplée à la méthode d’électrospray comme technique de microencapsulation. Les cellules ARPE-19, une lignée de cellules humaines de RPE qui se produisent spontanément, ont été utilisées dans des expériences de thérapie cellulaire à long terme en raison de sa fonctionnalité de vie, et il est utilisé ici pour l’encapsulation et la livraison des capsules aux yeux de souris. Le manuscrit résume les étapes de la microencapsulation cellulaire, du contrôle de la qualité et de la livraison oculaire.

Les cellules ARPE-19 sont une lignée cellulaire humaine de RPE spontanément immortalisée qui s’est avérée favorable à l’encapsulation et à la survie à long terme lors de l’implantation de capsules dans l’œil. Les outils d’encapsulation alginate sont indiqués à la figure 1. Dans cette étude, il a été démontré qu’encapsulation dans l’alginate, les cellules des capsules d’alginate ont été confirmées par l’imagerie à champ lumineux(figur...

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Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Présenté ici est un protocole pour l’utilisation de l’alginate comme un polymère dans la microencapsulation des cellules immortalisées pour la livraison à long terme des produits biologiques aux yeux de rongeur.

Technologie cellulaire encapsulée pour la livraison de produits biologiques à l’œil de souris

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

Cette technique est un moyen fiable de fournir tout contenu tel que des médicaments, des protéines ou des cellules à des endroits spécifiques dans les tissus ou les animaux. Vous pouvez suivre la livraison et régler la version du contenu pour s’adapter à l’expérience que vous désirez. Il peut être utilisé pour traiter de nombreuses maladies de la cicatrisation des plaies aux maladies oculaires et cardiaques.Le principal avantage de cette méthode est la capacité d’offrir des cellules thérapeutiques utilisant des microcapsules alginate aux sites cibles sans provoquer de réactions immunitaires et de maintenir une livraison soutenue de thérapeutiques fraîches sécrétées pendant une plus longue période de temps. Commencez par la culture des cellules épithéliales rétiniennes selon les instructions manuscrites. Passer les cellules quand ils atteignent 70 à 80% confluent en utilisant des procédures standard de culture tissulaire.Pour encapsuler les cellules, mélanger l’alginate de sodium avec l’eau déionisée pour une concentration finale de 2% de poids au volume et purifier le mélange par filtration avec un filtre stérile de seringue de 0,2 micromètre. Essayez de trypsiniser, centrifugeuse, et laver les cellules avec 10 millimolar HEPES tamponné solution saline. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules et ajuster la concentration finale des cellules à un million par millilitre de solution alginate.Chargez 300 aliquots microlitres de l’alginate et du mélange de cellules dans une seringue de trois millilitres et attachez-la à une pompe à seringues. Préparez un bain gélissant selon les instructions manuscrites et placez-le dans un bécher stérile de 50 millilitres sous la pointe de la seringue à une aiguille de sept millimètres jusqu’à la distance de pulvérisation du bain. Réglez la tension à huit kilovolts et le débit à 30 millimètres par heure pour produire des microcapsules d’une taille d’environ 150 micromètres.Connectez le clip au sol noir au fil de cuivre qui est à mi-chemin immergé dans le bain de hongre et connectez le clip du fil d’anode rouge à l’aiguille. Il faut environ 30 minutes pour préparer les cellules encapsulées de chaque lot d’un millilitre de l’alginate et du mélange cellulaire. Une fois formés, lavez les microcapsules avec la solution de lavage deux fois et incubez-les avec 10%FBS complété dmem media dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5%CO2.Après une incubation de 24 heures, préparer un échantillon de 500 microlitres de microcapsules pour les colorer en les lavant deux fois dans la solution de lavage. Utilisez un kit d’analyse LIVE/DEAD pour les tacher pour leur viabilité. Pour s’assurer que les microcapsules sont de taille appropriée, diluez-les dans des supports sans sérum.Aspirez-les soigneusement avec une seringue Hamilton de 2,5 microlitres. Éjectez lentement un microlitre tombe sur une lame de microscope et déterminez l’intégrité des microcapsules à l’aide d’un microscope Brightfield droit. Dans une souris bien anesthésiée, appliquer un lubrifiant oculaire pour maintenir l’humidité des yeux et utiliser une aiguille de seringue biseauté de calibre 3/8 pouces pour établir une ponction initiale des yeux juste en dessous du limbe.Assurez-vous d’approcher l’œil d’une direction nasale à un angle de 45 degrés en gardant la pointe biseauté vers le haut pour éviter la perforation de la lentille. Ensuite, assurez-vous que la pointe entière de l’aiguille est insérée dans l’œil pour la génération de trous de guidage, mais veillez à ne pas aller trop loin et percer la rétine temporelle. Une fois cela terminé, rétractez lentement l’aiguille.Dans le micromanipulateur, placez une pointe émoussée de calibre 2,5 microlitres hamilton qui a été remplie de solution capsule et alignez l’aiguille avec le trou de guidage initial. Tenez la tête de l’animal dans une position stable et manœuvrez délibérément l’aiguille vers l’œil. Pour assurer une position correcte de l’aiguille dans le vitré, insérez la seringue jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille puisse être visualisée derrière la lentille.Injectez ensuite la solution capsule lentement pendant 25 à 30 secondes. Et une fois terminée, rétractez graduellement la seringue à pointe émoussée afin de minimiser les blessures à l’œil. Si nécessaire, ajustez la taille de la capsule en ajustant la tension et le débit en fonction des directions manuscrites.L’encapsulation des cellules dans l’alginate a été confirmée avec la formation image de Brightfield et un essai de LIVE/DEAD a démontré que 90% des cellules étaient viables après encapsulation. La viabilité à long terme des cellules a été assurée en dissolvant les capsules dans le citrate de sodium et le replacage. L’injection intravitreal a été exécutée sous l’inspection visuelle qui a permis la visualisation des capsules dans le vitreux.Lorsque vous essayez cette procédure, n’utilisez pas PBS pour les étapes de lavage parce que PBS dissout les microcapsules alginate formés. Après son développement, notre laboratoire est utilisé comme un système d’accouchement pour traiter les formes d’insuffisance cardiaque et d’hypertension. Cette technique est considérée comme un outil prometteur pour le traitement futur de différentes maladies cardiovasculaires et neurologiques.

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