Name: encapsulated cell technology for the delivery of biologics to the mouse eye
Uploaded: 2020-03-30T13:00:00
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Lo studio è stato sostenuto in parte da sovvenzioni assegnate a B. R. dai National Institutes of Health (R01EY019320), dal Department of Veterans Affairs (RX000444 e BX003050) e dal South Carolina SmartState Endowment.

Tutti gli esperimenti sono stati effettuati in conformità con la dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca ophtalmic e Vision e sono stati approvati dalla Medical University of South Carolina Animal Care and Use Committee sotto il protocollo ID 00399.
1. Cultura cellulare
<ol><li>Generare cellule epiteliali del pigmento reticolare umano (ARPE-19) linea cellulare esprimendo stabilmente il gene di scelta secondo i protocolli pubblicati14,<sup ...

<ol>
	<li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+systems:+entering+the+mainstream.">Drug delivery systems: entering the mainstream.</a> Science. 303 (5665), 1818-1822 (2004).</li><li>Tonnesen, H. H., Karlsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+in+drug+delivery+systems.">Alginate in drug delivery systems.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 28 (6), 621-630 (2002).</li><li>Vilos, C., Velasquez, L. 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Uma nova estrat&#233;gia para produzir um dispositivo para entrega de f&#225;rmacos que ser&#225; usado na regenera&#231;&#227;o da pele. , (2012).</li><li>Huang, S., Fu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+derived+materials-based+cell+and+drug+delivery+systems+in+skin+regeneration.">Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration.</a> Journal of Controlled Release. 142 (2), 149-159 (2010).</li><li>Nograles, N., Abdullah, S., Shamsudin, M. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polymeric+microcapsules+containing+a+low+molecular+weight+peptide+for+controlled+release.">Characterization of polymeric microcapsules containing a low molecular weight peptide for controlled release.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (1), 213-226 (2013).</li><li>Xu, Y., Skotak, M., Hanna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+encapsulation+of+water-soluble+protein+with+polylactide.+I.+Effects+of+formulations+and+process+on+morphology+and+particle+size.">Electrospray encapsulation of water-soluble protein with polylactide. I. Effects of formulations and process on morphology and particle size.</a> Journal of Microencapsulation. 23 (1), 69-78 (2006).</li><li>Gryshkov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+engineering+of+high+voltage+alginate+encapsulation+of+mesenchymal+stem+cells.">Process engineering of high voltage alginate encapsulation of mesenchymal stem cells.</a> Materials Science and Engineering: C. 36, 77-83 (2014).</li><li>Thanos, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+secretion+of+ciliary+neurotrophic+factor+to+the+vitreous,+using+the+encapsulated+cell+therapy-based+NT-501+intraocular+device.">Sustained secretion of ciliary neurotrophic factor to the vitreous, using the encapsulated cell therapy-based NT-501 intraocular device.</a> Tissue Engineering. (11-12), 1617-1622 (2004).</li><li>Kauper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-year+intraocular+delivery+of+ciliary+neurotrophic+factor+by+encapsulated+cell+technology+implants+in+patients+with+chronic+retinal+degenerative+diseases.">Two-year intraocular delivery of ciliary neurotrophic factor by encapsulated cell technology implants in patients with chronic retinal degenerative diseases.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (12), 7484-7491 (2012).</li><li>Kauper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term,+sustained+intraocular+delivery+of+a+VEGF+antagonist+using+encapsulated+cell+technology+implant+for+the+treatment+of+choroidal+neovascular+diseases.">Long term, sustained intraocular delivery of a VEGF antagonist using encapsulated cell technology implant for the treatment of choroidal neovascular diseases.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53, 455 (2012).</li><li>Annamalai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulated+Cell+Technology-Based+Delivery+of+a+Complement+Inhibitor+Reduces+Choroidal+Neovascularization+in+a+Mouse+Model.">Encapsulated Cell Technology-Based Delivery of a Complement Inhibitor Reduces Choroidal Neovascularization in a Mouse Model.</a> Translational Visual Science Technology. 7 (2), 3 (2018).</li><li>Alge, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+Pigment+Epithelium+Is+Protected+Against+Apoptosis+by+&#945;B-Crystallin.">Retinal Pigment Epithelium Is Protected Against Apoptosis by &#945;B-Crystallin.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 43 (11), 3575-3582 (2002).</li><li>Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreous+injection+for+establishing+ocular+diseases+model.">Intravitreous injection for establishing ocular diseases model.</a> Journal of Visualized Experiments. 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M., Ramo, K., Kumar-Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Non+Membrane-Targeted+Human+Soluble+CD59+Attenuates+Choroidal+Neovascularization+in+a+Model+of+Age+Related+Macular+Degeneration.">A Non Membrane-Targeted Human Soluble CD59 Attenuates Choroidal Neovascularization in a Model of Age Related Macular Degeneration.</a> PLoS ONE. 6 (4), e19078 (2011).</li><li>Vincent, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+combination+PDGF+/+VEGF-antagonist+ECT+devices.">Generation of combination PDGF / VEGF-antagonist ECT devices.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54, 3290 (2013).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+delivered+by+encapsulated+cell+intraocular+implants+for+treatment+of+geographic+atrophy+in+age-related+macular+degeneration.">Ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for treatment of geographic atrophy in age-related macular degeneration.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (15), 6241-6245 (2011).</li><li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+for+macular+telangiectasia+type+2:+results+from+a+phase+1+safety+trial.">Ciliary neurotrophic factor for macular telangiectasia type 2: results from a phase 1 safety trial.</a> American Journal of Ophthalmology. 159 (4), 659-666 (2015).</li><li>Birch, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+trial+of+ciliary+neurotrophic+factor+delivered+by+encapsulated+cell+intraocular+implants+for+retinitis+pigmentosa.">Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa.</a> American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 283-292 (2013).</li></ol>

Questa tecnica di incapsulamento delle cellule è relativamente veloce e facile da eseguire; tuttavia, per ottenere risultati accurati a valle, è necessario tenere presenti alcuni punti. Le cellule devono essere mantenute in coltura in un piatto Petri prima dell'incapsulamento e tenute a giusta confluenza. L'incapsulamento deve essere eseguito in una corretta cappa di ventilazione con flusso d'aria regolato, se possibile. Troppo forte di una corrente d'aria può influenzare la formazione di capsule, soprattutto negli es...

Le terapie basate sulle cellule rappresentano tecniche biologiche rivoluzionarie che sono state ampiamente applicate in medicina. Recentemente, sono stati applicati con successo nel trattamento di malattie neurodegenerative, malattie degli occhi, e il cancro. Le terapie cellulari coprono un'ampia gamma di campi, dalla sostituzione cellulare alla somministrazione di farmaci, e questo protocollo si concentra su quest'ultimo. Le microcapsule alginate biodegradabili (MC) hanno dimostrato l'efficacia come sistema di somministrazione e stanno diventando ampiamente utilizzate in campo biomedico. Alginato è stato utilizzato in microincapsulazione grazie al suo semplice processo di gelling, biodegradabilità, eccellente biocompatibilità e stabilità in condizioni in vivo41,2,3.
Il metodo dell'elettrospray, come tecnica di microincapsulamento, è stato utilizzato con successo per incapsulare peptidi e proteine utilizzando algerino (polimero di base) e poli-l-ornitina (polimero di rivestimento secondario). Entrambi i polimeri sono naturalmente trovati e utilizzati per la loro biocompatibilità5,6,7. Tuttavia, la sfida principale nelle terapie basate sulle cellule è la soppressione del sistema immunitario dell'ospite per evitare effetti collaterali causati da farmaci immunosoppressori. La permeabilità delle microcapsule algonate è considerata una proprietà adatta per l'incapsulamento cellulare, che consente la diffusione di nutrienti, rifiuti e fattori terapeutici all'interno e all'esterno delle cellule mascherandoli dalla risposta immunitaria dell'ospite8,9,10.
Nell'occhio, le cellule incapsulate sono state utilizzate negli studi clinici per la consegna costante di biologici (cioè fattori di crescita11,12 e antagonisti fattore di crescita13) per il trattamento della retinite pigmentosa o degenerazione maculare legata all'età. Altri obiettivi come gli inibitori del complemento14 sono attualmente in fase di esplorazione in ambienti preclinici.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G 1&#34; Blunt needle</td>
			<td>SAI Infusion technology</td>
			<td>B30-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginic acid sodium salt, from brown algae</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%)</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 17478-215-15</td>
			<td>for pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>DG518105 500029609 REF 309625</td>
			<td>to generate the guide hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, Anhydrous, granular</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal Tears</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td>to lubricate the eyes during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile)</td>
			<td>Altaire Pharmaceuticals Inc.</td>
			<td>NDC 59390-182-13</td>
			<td>to lubricate the eyes during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Needle/syringe Tip: 27 Gauge, Small Hub RN NDL, custum length (12mm), point style 3, 6/PK</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-01</td>
			<td>for intravitreal delivery of capsules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Syringe: 2.5 &#181;L, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7632-01</td>
			<td>for intravitreal delivery of capsules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer, 1M</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP299100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage generator</td>
			<td>ESD EMC Technology</td>
			<td>ES813-D20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ornithine hydrochloride, 99%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>NDC 61314-631-36</td>
			<td>antibiotic to prevent infection after intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%)</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 17478-201-15</td>
			<td>for pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters, 0.2 um</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28143-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>GRASEBY</td>
			<td>MS16A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

encapsulated cell technology for the delivery of biologics to the mouse eye

Molte terapie attuali in fase di sviluppo per le malattie del polo posteriore dell'occhio sono biologiche. Questi farmaci devono essere somministrati frequentemente, in genere tramite iniezioni intravitrali. Le cellule incapsulate che esprimono il biologico di scelta stanno diventando uno strumento per la produzione e il rilascio di proteine locali (ad esempio, tramite la somministrazione di farmaci a lungo termine). Inoltre, i sistemi di incapsulamento utilizzano materiali permeabili che consentono la diffusione di nutrienti, rifiuti e fattori terapeutici all'interno e all'esterno delle cellule. Ciò si verifica mentre si mascherano le cellule dalla risposta immunitaria dell'ospite, evitando la necessità di soppressione del sistema immunitario dell'ospite. Questo protocollo descrive l'uso dell'algerino come polimero nel microincapsulamento accoppiato con il metodo elettrospray come tecnica di microincapsulazione. Le cellule ARPE-19, una linea cellulare RPE umana che nasce spontaneamente, è stata utilizzata in esperimenti di terapia cellulare a lungo termine a causa della sua funzionalità di durata, ed è usato qui per incapsulare e consegnare le capsule agli occhi del topo. Il manoscritto riassume i passaggi per la microincapsulazione cellulare, il controllo qualità e la consegna oculare.

Le cellule ARPE-19 sono una linea cellulare UMANA RPE immortalata spontaneamente che ha dimostrato di essere suscettibile di incapsulamento e sopravvivenza a lungo termine dopo l'impianto di capsule nell'occhio. Gli strumenti per l'incapsulamento algerato sono illustrati nella Figura 1. In questo studio, è stato dimostrato che dopo l'incapsulamento in algerino, le cellule in capsule altnate sono state confermate da immagini a campo luminoso (Figura 2A). I saggi...

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Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Presentato qui è un protocollo per l'uso dell'alginato come polimero nel microincapsulamento di cellule immortalate per la consegna a lungo termine di biologici agli occhi dei roditori.

Tecnologia a cellule incapsulate per la consegna dei biologici all'occhio del mouse

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

Questa tecnica è un modo affidabile per fornire qualsiasi contenuto come farmaci, proteine o cellule in luoghi specifici in tessuti o animali. È possibile tenere traccia della consegna e ottimizzare il rilascio del contenuto in base all'esperimento che si desidera. Può essere usato per trattare numerose malattie dalla guarigione delle ferite alle malattie oculari e cardiache.Il principale vantaggio di questo metodo è la capacità di fornire cellule terapeutiche utilizzando microcapsule alginate ai siti bersaglio senza causare reazioni immunitarie e mantenere un parto prolungato di terapie appena secrete per un periodo di tempo più lungo. Inizia coltivando cellule epiteliali retiniche secondo le indicazioni manoscritte. Passare le cellule quando raggiungono il 70-80% di confluenza utilizzando procedure standard di coltura tissutale.Per incapsulare le cellule, mescolare l'alginato di sodio con acqua deionizzata per una concentrazione finale del 2% di peso in volume e purificare la miscela tramite filtrazione con un filtro siringa sterile da 0,2 micrometri. Tripinare, centrifugare e lavare le cellule con soluzione salina tamponata HEPES da 10 millimolare. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule e regolare la concentrazione cellulare finale a un milione per un millilitro di soluzione di alginato.Caricare 300 aliquote microlitri dell'alginato e le cellule si mescolano in una siringa da tre millilitri e attaccarla a una pompa per siringhe. Preparare un bagno gelificante secondo le indicazioni manoscritte e posizionare in un becher sterile da 50 millilitri sotto la punta della siringa con un ago di sette millimetri per bagnare la distanza di spruzzatura. Regolare la tensione a otto kilovolt e la portata a 30 millimetri all'ora per produrre microcapsule di dimensioni di circa 150 micrometri.Collegare la clip di terra nera al filo di rame che è a metà del bagno di gelata e collegare la clip del filo anodo rosso all'ago. Ci vogliono circa 30 minuti per preparare le cellule incapsulate da ogni lotto di millilitro dell'alginato e della miscela cellulare. Una volta formate, lavare due volte le microcapsule con soluzione di lavaggio e incubarle con mezzi DMEM integrati al 10%FBS in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5%CO2.Dopo un'incubazione 24 ore su 24, preparare un campione di microcapsule da 500 microliter per la colorazione lavandoli due volte in soluzione di lavaggio. Utilizzare un kit di saggi LIVE/DEAD per macchiarli per la vitalità. Per assicurarsi che le microcapsule siano dimensionate in modo appropriato, diluirle in mezzi senza siero.Aspirateli con cura con una siringa Hamilton da 2,5 microliter. Espellere lentamente un microlitro cadere su uno scivolo del microscopio e determinare l'integrità delle microcapsule utilizzando un microscopio Brightfield verticale. In un topo opportunamente anestetizzato, applicare il lubrificante oculare per mantenere l'umidità degli occhi e utilizzare un ago per siringhe smussato da 26 gauge da 3/8 pollici per stabilire una puntura oculare iniziale appena sotto il limbo.Assicurarsi di avvicinarsi all'occhio da una direzione nasale con un angolo di 45 gradi mantenendo la punta smussata verso l'alto per evitare la perforazione dell'obiettivo. Successivamente, assicurarsi che l'intera punta dell'ago sia inserita nell'occhio per la generazione del foro guida, ma fare attenzione a non andare troppo lontano e forare la retina temporale. Una volta completato questo, ritrarre lentamente l'ago.All'interno del micromanipolatore, posizionare una siringa Hamilton a punta smussata calibro 27 da 27 calibri riempita con soluzione di capsula e allineare l'ago con il foro guida iniziale. Tenere la testa dell'animale in una posizione stabile e manovrare deliberatamente l'ago verso l'occhio. Per garantire una corretta posizione dell'ago all'interno del vitreo, inserire la siringa fino a quando la punta dell'ago non può essere visualizzato dietro l'obiettivo.Quindi iniettare lentamente la soluzione della capsula nel corso di 25-30 secondi. E una volta completata, ritrarre gradualmente la siringa con punta smussata per ridurre al minimo le lesioni all'occhio. Se necessario, regolare la dimensione della capsula regolando la tensione e la portata in base alle direzioni del manoscritto.L'incapsulamento delle cellule nell'alginato è stato confermato con l'imaging Brightfield e un test LIVE/DEAD ha dimostrato che il 90% delle cellule erano post-incapsulamento praticabili. La vitalità a lungo termine delle cellule è stata assicurata sciogliendo le capsule in citrato di sodio e ripiazzando. L'iniezione intravitreale è stata eseguita sotto ispezione visiva che ha permesso la visualizzazione delle capsule nel vitreo.Quando si tenta questa procedura, non utilizzare PBS per alcuna procedura di lavaggio perché PBS dissolve le microcapsule alginate formate. Dopo il suo sviluppo, il nostro laboratorio viene utilizzato come sistema di consegna per trattare forme di insufficienza cardiaca e ipertensione. Questa tecnica è considerata uno strumento promettente per il futuro trattamento di diverse malattie cardiovascolari e neurologiche.

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