Name: encapsulated cell technology for the delivery of biologics to the mouse eye
Uploaded: 2020-03-30T13:00:00
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この研究は、国立衛生研究所(R01EY019320)、退役軍人省(RX000444およびBX003050)、サウスカロライナ州スマートステート基金によってB.R.に授与された助成金によって部分的に支持されました。

すべての実験は、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に従って行われ、サウスカロライナ医科大学動物ケアおよび使用委員会によってプロトコルID00399の下で承認されました。
1. 細胞培養
<ol><li>ヒト網膜色素上皮細胞(ARPE-19)細胞株を生成し、公表されたプロトコル14,15,15に従って選択した遺伝子を安定的に...

<ol>
	<li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+systems:+entering+the+mainstream.">Drug delivery systems: entering the mainstream.</a> Science. 303 (5665), 1818-1822 (2004).</li><li>Tonnesen, H. H., Karlsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+in+drug+delivery+systems.">Alginate in drug delivery systems.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 28 (6), 621-630 (2002).</li><li>Vilos, C., Velasquez, L. 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Effects of formulations and process on morphology and particle size.</a> Journal of Microencapsulation. 23 (1), 69-78 (2006).</li><li>Gryshkov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+engineering+of+high+voltage+alginate+encapsulation+of+mesenchymal+stem+cells.">Process engineering of high voltage alginate encapsulation of mesenchymal stem cells.</a> Materials Science and Engineering: C. 36, 77-83 (2014).</li><li>Thanos, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+secretion+of+ciliary+neurotrophic+factor+to+the+vitreous,+using+the+encapsulated+cell+therapy-based+NT-501+intraocular+device.">Sustained secretion of ciliary neurotrophic factor to the vitreous, using the encapsulated cell therapy-based NT-501 intraocular device.</a> Tissue Engineering. 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この細胞カプセル化技術は比較的迅速かつ容易に実行できます。ただし、特定のポイントは、正確な下流の結果を得るために心に留める必要があります。細胞は、カプセル化する前にペトリ皿の培養中に維持され、適切な合流で保持されるべきである。カプセル化は、可能であれば、規制された空気の流れと適切な換気フードで行われるべきです。空気の流れが強すぎると、特に長期実験に?...

細胞ベースの治療法は、医学に広く適用されている革命的な生物学的技術を表しています。最近では、神経変性疾患、眼疾患、がんの治療に応用に成功しています。細胞療法は、細胞置換から薬物送達まで幅広い分野をカバーしており、このプロトコルは後者に焦点を当てています。生分解性アルギン酸マイクロカプセル(MC)は、送達系としての有効性を示しており、生物医学分野で広く使用されつつある。アルギン酸は、その単純なゲル化プロセス、生分解性、優れた生体適合性、および生体内,条件1、2、3、42の下での1安定性によるマイクロカプセル化に使用されてきた。3,4
エレクトロスプレー法は、マイクロカプセル化技術として、アルギン酸(塩基高分子)およびポリ-lオルニチン(二次被覆ポリマー)を用いてペプチドおよびタンパク質をカプセル化するために有効に利用されている。両方のポリマーは自然に発見され、その生体適合性55、6、76,のために使用されます。しかし、細胞ベースの治療法における主な課題は、免疫抑制薬によって引き起こされる副作用を避けるために宿主免疫系の抑制である。アルギン酸マイクロカプセルの透過性は、細胞カプセル化に適した性質と考えられており、宿主免疫応答88、9、109からそれらをマスキングしながら、細胞への栄養素、廃棄物、および治療因子の細胞への注入を10可能にする。
眼では、封入された細胞は、網膜色素変性症または加齢黄斑変性症の治療のために、生物学的製剤(すなわち、成長因子11、12および12成長因子アンタゴニスト13)の一定の送達のための臨床試験で使用されてきた。補体阻害剤14などの他の標的も現在、前臨床設定で検討されている。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G 1&#34; Blunt needle</td>
			<td>SAI Infusion technology</td>
			<td>B30-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginic acid sodium salt, from brown algae</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%)</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 17478-215-15</td>
			<td>for pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>DG518105 500029609 REF 309625</td>
			<td>to generate the guide hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, Anhydrous, granular</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal Tears</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td>to lubricate the eyes during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile)</td>
			<td>Altaire Pharmaceuticals Inc.</td>
			<td>NDC 59390-182-13</td>
			<td>to lubricate the eyes during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Needle/syringe Tip: 27 Gauge, Small Hub RN NDL, custum length (12mm), point style 3, 6/PK</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-01</td>
			<td>for intravitreal delivery of capsules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Syringe: 2.5 &#181;L, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7632-01</td>
			<td>for intravitreal delivery of capsules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer, 1M</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP299100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage generator</td>
			<td>ESD EMC Technology</td>
			<td>ES813-D20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ornithine hydrochloride, 99%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>NDC 61314-631-36</td>
			<td>antibiotic to prevent infection after intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%)</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 17478-201-15</td>
			<td>for pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters, 0.2 um</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28143-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>GRASEBY</td>
			<td>MS16A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

encapsulated cell technology for the delivery of biologics to the mouse eye

眼の後極の疾患の開発中の多くの現在の治療法は、生物学的製剤である。これらの薬物は頻繁に投与される必要があります, 典型的には、細胞内注射を介して.選択した生物学的製剤を発現するカプセル化細胞は、局所的なタンパク質産生および放出(例えば、長期薬物送達を介して)のためのツールになりつつある。また、カプセル化システムは、細胞への栄養素、廃棄物、および治療因子の拡散を可能にする透過性物質を利用します。これは、宿主免疫応答から細胞をマスキングする際に起こり、宿主免疫系の抑制の必要性を回避する。このプロトコルは、マイクロカプセル化法と結合したマイクロカプセル化におけるポリマーとしてのアルギン酸塩の使用をマイクロカプセル化技術として説明する。ARPE-19細胞は、ヒトRPE細胞株の自然発生により、その生涯機能により長期細胞療法実験に用いられており、ここではカプセルをカプセル化し、マウスの目に送達するために使用されています。この原稿は、細胞マイクロカプセル化、品質管理、および眼の送達のためのステップを要約する。

ARPE-19細胞は、眼にカプセルを移植した際のカプセル化および長期生存に適性であることが示されている、自然消滅ヒトRPE細胞株である。アルギン酸カプセル化のツールを図 1に示します。本研究では、アルギン酸塩に封入した際に、アルギン酸カプセル内の細胞を明視野イメージングにより確認したことが実証された(図2A)。カプセル内の細胞に対...

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Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

ここで提示されるは、齧歯類の目への生物学的製剤の長期配信のための不死化細胞のマイクロカプセル化におけるポリマーとしてのアルギン酸塩の使用のためのプロトコルである。

マウスアイへの生物学的製剤の送達のためのカプセル化された細胞技術

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

この技術は、薬物、タンパク質、細胞などのコンテンツを組織や動物の特定の場所に配信する信頼できる方法です。配信を追跡し、目的の実験に合わせてコンテンツのリリースを調整できます。創傷治癒から眼疾患および心疾患まで多くの疾患を治療するために使用することができる。この方法の主な利点は、免疫反応を引き起こすことなく、標的部位にアルギン酸マイクロカプセルを使用して治療細胞を送達し、より長い期間、新しい分泌された治療薬の持続的な送達を維持する能力である。原稿の指示に従って、レチナル上皮細胞を培養することから始めます。それらは標準的な組織培養手順を使用して70〜80%の合流に達したときに細胞を通過させる。細胞をカプセル化するには、アルギン酸ナトリウムと脱イオン水を混合して2%重量の最終濃度で体積を計り、0.2マイクロメートルの滅菌シリンジフィルターで濾過して混合物を精製します。トリプシン化、遠心分離、10ミリモルHEPES緩衝生理液で細胞を洗浄する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、最終的な細胞濃度をアルギン酸溶液1ミリリットル当たり100万に調整します。アルギン酸と細胞混合物の300マイクロリットルのアリコートを3ミリリットルシリンジにロードし、シリンジポンプに取り付けます。原稿の指示に従ってゲル化浴を準備し、7ミリメートルの針で注射器の先端の下の無菌50ミリリットルビーカーに入れ、噴霧距離を浴びる。電圧を8キロボルト、流量を1時間あたり30ミリメートルに調整し、約150マイクロメートルのマイクロカプセルを製造します。黒いグラウンド クリップを、ゲル化槽に中途半端に沈んだ銅線に接続し、赤いアノード ワイヤのクリップを針に接続します。アルギン酸と細胞混合物の各1ミリリットルバッチからカプセル化された細胞を調製するのに約30分かかります。形成されたら、マイクロカプセルを洗浄液で2回洗浄し、摂氏37度と5%CO2の加湿インキュベーターで10%FBS補充DMEM培地でインキュベートします。24時間インキュベーションした後、マイクロカプセルの500マイクロリットルサンプルを洗浄液で2回洗浄して染色します。生存率のためにそれらを染色するためにLIVE / DEADアッセイキットを使用してください。マイクロカプセルのサイズを適切に調整するには、無血清培地で希釈します。慎重に2.5マイクロリットルハミルトン注射器でそれらを吸引します。ゆっくりと顕微鏡スライドに1マイクロリットルの滴を排出し、直立したブライトフィールド顕微鏡を使用してマイクロカプセルの完全性を決定します。適切に麻酔をかけられるマウスでは、眼の潤滑剤を塗布して眼の水分を維持し、26ゲージ3/8インチのベベリングシリンジ針を使用して、手足のすぐ下に最初の目の穿刺を確立します。レンズの穿光を避けるために、斜めの先端を上に保つ45度の角度で鼻方向から目に近づくことを確認してください。次に、針先全体がガイド穴の生成のために目に挿入されていることを確認しますが、遠くに移動しすぎないように注意し、経時的な経時的な残量を穿刺してください。これが完了したら、ゆっくりと針を引っ込みます。マイクロマニピュレーター内に、カプセル溶液で満たされた27ゲージの鈍い先端2.5マイクロリットルハミルトン注射器を置き、最初のガイドホールで針を並べます。動物の頭を安定した位置に保持し、意図的に針を目に向かって操縦します。正しい針の位置を確認するために、針先がレンズの後ろに視覚化されるまで注射器を挿入します。その後、カプセル溶液を25~30秒間ゆっくりと注入します。そして、完成したら、目の損傷を最小限に抑えるために、鈍い先端の注射器を徐々に引き込む。必要に応じて、原稿の方向に応じて電圧と流量を調整してカプセルサイズを調整します。アルギン酸中の細胞のカプセル化はブライトフィールドイメージングで確認され、LIVE/DEADアッセイは細胞の90%が封入後に生存していることを示した。細胞の長期生存率は、カプセルをクエン酸ナトリウムに溶解し、再めっきすることによって保証された。ビトリア内注射は、膜内のカプセルの可視化を可能にする目視検査の下で行われた。この手順を試みる場合、PBSが形成したアルギン酸マイクロカプセルを溶解するので、いかなる洗浄工程にもPBSを使用しないでください。その開発後、私たちの研究室は心不全や高血圧の形態を治療するためのデリバリーシステムとして使用されます。この技術は、異なる心血管疾患および神経疾患の将来の治療のための有望なツールと考えられています。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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幹細胞にロードされたキトサンミクロスフェアの配信のためにコラーゲンハイドロゲルの構築

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

マイクロスケール渦アシストシーケンシャル分子送達用エレクトロポ

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

Culturing Mouse Cardiac Valves in the Miniature Tissue Culture System

ミニチュア組織培養系でマウス心臓弁の培養

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

液晶ナノ粒子キャリアにおける疎水性貨物カプセル化の標的細胞膜配達

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

ウサギの乳腺への管内配達

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

組織特異的細胞培養および配信プラットフォームとして、細胞外マトリックス由来のフォームおよびマイクロキャリアの作製

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メカノ生物学的研究のための軌道シェーカー上の6ウェルプレートにおける内皮細胞の成長のセグメント化

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