Name: encapsulated cell technology for the delivery of biologics to the mouse eye
Uploaded: 2020-03-30T13:00:00
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O estudo foi apoiado, em parte, por subvenções concedidas a B. R. pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01EY019320), pelo Departamento de Assuntos dos Veteranos (RX000444 e BX003050) e pelo South Carolina SmartState Endowment.

Todos os experimentos foram realizados de acordo com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e de Visão e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica da Carolina do Sul sob o protocolo ID 00399.
1. Cultura Celular
<ol><li>Gerar células epiteliais de pigmento da retina humana (ARPE-19) expressando o gene de escolha de acordo com os protocolos publicados14,15.</li>
	<...

<ol>
	<li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+systems:+entering+the+mainstream.">Drug delivery systems: entering the mainstream.</a> Science. 303 (5665), 1818-1822 (2004).</li><li>Tonnesen, H. H., Karlsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+in+drug+delivery+systems.">Alginate in drug delivery systems.</a> Drug Development and Industrial Pharmacy. 28 (6), 621-630 (2002).</li><li>Vilos, C., Velasquez, L. 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Uma nova estrat&#233;gia para produzir um dispositivo para entrega de f&#225;rmacos que ser&#225; usado na regenera&#231;&#227;o da pele. , (2012).</li><li>Huang, S., Fu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+derived+materials-based+cell+and+drug+delivery+systems+in+skin+regeneration.">Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration.</a> Journal of Controlled Release. 142 (2), 149-159 (2010).</li><li>Nograles, N., Abdullah, S., Shamsudin, M. N., Billa, N., Rosli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+characterization+of+pDNA-loaded+alginate+microspheres+for+oral+administration+in+mice.">Formation and characterization of pDNA-loaded alginate microspheres for oral administration in mice.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (2), 133-140 (2012).</li><li>Moore, K., Amos, J., Davis, J., Gourdie, R., Potts, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polymeric+microcapsules+containing+a+low+molecular+weight+peptide+for+controlled+release.">Characterization of polymeric microcapsules containing a low molecular weight peptide for controlled release.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (1), 213-226 (2013).</li><li>Xu, Y., Skotak, M., Hanna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrospray+encapsulation+of+water-soluble+protein+with+polylactide.+I.+Effects+of+formulations+and+process+on+morphology+and+particle+size.">Electrospray encapsulation of water-soluble protein with polylactide. I. Effects of formulations and process on morphology and particle size.</a> Journal of Microencapsulation. 23 (1), 69-78 (2006).</li><li>Gryshkov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+engineering+of+high+voltage+alginate+encapsulation+of+mesenchymal+stem+cells.">Process engineering of high voltage alginate encapsulation of mesenchymal stem cells.</a> Materials Science and Engineering: C. 36, 77-83 (2014).</li><li>Thanos, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+secretion+of+ciliary+neurotrophic+factor+to+the+vitreous,+using+the+encapsulated+cell+therapy-based+NT-501+intraocular+device.">Sustained secretion of ciliary neurotrophic factor to the vitreous, using the encapsulated cell therapy-based NT-501 intraocular device.</a> Tissue Engineering. (11-12), 1617-1622 (2004).</li><li>Kauper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-year+intraocular+delivery+of+ciliary+neurotrophic+factor+by+encapsulated+cell+technology+implants+in+patients+with+chronic+retinal+degenerative+diseases.">Two-year intraocular delivery of ciliary neurotrophic factor by encapsulated cell technology implants in patients with chronic retinal degenerative diseases.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (12), 7484-7491 (2012).</li><li>Kauper, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term,+sustained+intraocular+delivery+of+a+VEGF+antagonist+using+encapsulated+cell+technology+implant+for+the+treatment+of+choroidal+neovascular+diseases.">Long term, sustained intraocular delivery of a VEGF antagonist using encapsulated cell technology implant for the treatment of choroidal neovascular diseases.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53, 455 (2012).</li><li>Annamalai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulated+Cell+Technology-Based+Delivery+of+a+Complement+Inhibitor+Reduces+Choroidal+Neovascularization+in+a+Mouse+Model.">Encapsulated Cell Technology-Based Delivery of a Complement Inhibitor Reduces Choroidal Neovascularization in a Mouse Model.</a> Translational Visual Science Technology. 7 (2), 3 (2018).</li><li>Alge, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+Pigment+Epithelium+Is+Protected+Against+Apoptosis+by+&#945;B-Crystallin.">Retinal Pigment Epithelium Is Protected Against Apoptosis by &#945;B-Crystallin.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 43 (11), 3575-3582 (2002).</li><li>Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreous+injection+for+establishing+ocular+diseases+model.">Intravitreous injection for establishing ocular diseases model.</a> Journal of Visualized Experiments. (8), 313 (2007).</li><li>Jove Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab+Animal+Research.+Anesthesia+Induction+and+Maintenance.">Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li><li>Holz, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+Safety+of+Lampalizumab+for+Geographic+Atrophy+Due+to+Age-Related+Macular+Degeneration:+Chroma+and+Spectri+Phase+3+Randomized+Clinical+Trials.">Efficacy and Safety of Lampalizumab for Geographic Atrophy Due to Age-Related Macular Degeneration: Chroma and Spectri Phase 3 Randomized Clinical Trials.</a> JAMA Ophthalmology. 136 (6), 666-677 (2018).</li><li>Kassa, E., Ciulla, T. A., Hussain, R. M., Dugel, P. 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M., Ramo, K., Kumar-Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Non+Membrane-Targeted+Human+Soluble+CD59+Attenuates+Choroidal+Neovascularization+in+a+Model+of+Age+Related+Macular+Degeneration.">A Non Membrane-Targeted Human Soluble CD59 Attenuates Choroidal Neovascularization in a Model of Age Related Macular Degeneration.</a> PLoS ONE. 6 (4), e19078 (2011).</li><li>Vincent, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+combination+PDGF+/+VEGF-antagonist+ECT+devices.">Generation of combination PDGF / VEGF-antagonist ECT devices.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54, 3290 (2013).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+delivered+by+encapsulated+cell+intraocular+implants+for+treatment+of+geographic+atrophy+in+age-related+macular+degeneration.">Ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for treatment of geographic atrophy in age-related macular degeneration.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (15), 6241-6245 (2011).</li><li>Chew, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+for+macular+telangiectasia+type+2:+results+from+a+phase+1+safety+trial.">Ciliary neurotrophic factor for macular telangiectasia type 2: results from a phase 1 safety trial.</a> American Journal of Ophthalmology. 159 (4), 659-666 (2015).</li><li>Birch, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+trial+of+ciliary+neurotrophic+factor+delivered+by+encapsulated+cell+intraocular+implants+for+retinitis+pigmentosa.">Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa.</a> American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 283-292 (2013).</li></ol>

Esta técnica de encapsulamento celular é relativamente rápida e fácil de executar; no entanto, alguns pontos devem ser mantidos em mente para obter resultados precisos a jusante. As células devem ser mantidas na cultura em uma placa de Petri antes do encapsulamento e mantidas em confluência adequada. O encapsulamento deve ser realizado em uma capa de ventilação adequada com fluxo de ar regulado, se possível. Uma corrente de ar muito forte pode afetar a formação de cápsulas, especialmente em experimentos de lo...

As terapias baseadas em células representam técnicas biológicas revolucionárias que têm sido amplamente aplicadas na medicina. Recentemente, eles têm sido aplicados com sucesso no tratamento de doenças neurodegenerativas, doenças oculares e câncer. As terapias celulares abrangem uma ampla gama de campos, desde a substituição celular até a entrega de medicamentos, e este protocolo se concentra neste último. Microcápsulas de alginato biodegradável (MC) têm mostrado eficácia como um sistema de parto, e estão se tornando amplamente utilizadas no campo biomédico. O alginato tem sido utilizado na microencapsulação devido ao seu processo simples de gelagem, biodegradabilidade, excelente biocompatibilidade e estabilidade em condições in vivo1,2,3,4.
O método de eletrospray, como técnica de microencapsulamento, tem sido utilizado com sucesso para encapsular peptídeos e proteínas usando alginato (polímero base) e poli-l-ornithine (polímero de revestimento secundário). Ambos os polímeros são naturalmente encontrados e utilizados para sua biocompatibilidade5,6,7. No entanto, o principal desafio nas terapias de base celular é a supressão do sistema imunológico hospedeiro para evitar efeitos colaterais causados por drogas imunossupressoras. A permeabilidade das microcápsulas de alginato é considerada uma propriedade adequada para o encapsulamento celular, que permite a difusão de nutrientes, resíduos e fatores terapêuticos dentro e fora das células enquanto as mascara da resposta imune hospedeira8,,9,10.
No olho, as células encapsuladas têm sido utilizadas em ensaios clínicos para a entrega constante de biológicos (ou seja, fatores de crescimento11,12 e antagonistas do fator de crescimento13) para o tratamento da retinite pigmentosa ou degeneração macular relacionada à idade. Outros alvos, como inibidores complementares14, também estão sendo explorados em ambientes pré-clínicos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G 1&#34; Blunt needle</td>
			<td>SAI Infusion technology</td>
			<td>B30-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alginic acid sodium salt, from brown algae</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A0682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%)</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 17478-215-15</td>
			<td>for pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>DG518105 500029609 REF 309625</td>
			<td>to generate the guide hole</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, Anhydrous, granular</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenTeal Tears</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>NDC 0078-0429-47</td>
			<td>to lubricate the eyes during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile)</td>
			<td>Altaire Pharmaceuticals Inc.</td>
			<td>NDC 59390-182-13</td>
			<td>to lubricate the eyes during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Needle/syringe Tip: 27 Gauge, Small Hub RN NDL, custum length (12mm), point style 3, 6/PK</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-01</td>
			<td>for intravitreal delivery of capsules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Syringe: 2.5 &#181;L, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7632-01</td>
			<td>for intravitreal delivery of capsules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer, 1M</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP299100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High voltage generator</td>
			<td>ESD EMC Technology</td>
			<td>ES813-D20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ornithine hydrochloride, 99%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment</td>
			<td>SANDOZ</td>
			<td>NDC 61314-631-36</td>
			<td>antibiotic to prevent infection after intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%)</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 17478-201-15</td>
			<td>for pupil dilation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters, 0.2 um</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28143-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>GRASEBY</td>
			<td>MS16A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

encapsulated cell technology for the delivery of biologics to the mouse eye

Muitas terapêuticas atuais em desenvolvimento para doenças do pólo posterior do olho são biológicas. Estes medicamentos precisam ser administrados com freqüência, tipicamente através de injeções intravitreais. As células encapsuladas que expressam o biológico de escolha estão se tornando uma ferramenta para a produção e liberação de proteínas locais (por exemplo, via entrega de medicamentos a longo prazo). Além disso, os sistemas de encapsulamento utilizam materiais permeáveis que permitem a difusão de nutrientes, resíduos e fatores terapêuticos dentro e fora das células. Isso ocorre enquanto mascara as células da resposta imune do hospedeiro, evitando a necessidade de supressão do sistema imunológico hospedeiro. Este protocolo descreve o uso de alginato como um polímero em microencapsulamento juntamente com o método de eletrospray como uma técnica de microencapsulamento. As células ARPE-19, uma linha de células RPE humanas espontaneamente surgidas, tem sido usada em experimentos de terapia celular de longo prazo devido à sua funcionalidade de vida, e é usada aqui para encapsulamento e entrega das cápsulas aos olhos do rato. O manuscrito resume os passos para microencapsulamento celular, controle de qualidade e entrega ocular.

As células ARPE-19 são uma linha celular rpe humana espontaneamente imortalizada que tem se mostrado passível de encapsulamento e sobrevivência a longo prazo após a implantação de cápsulas no olho. As ferramentas para encapsulamento de alginato são mostradas na Figura 1. Neste estudo, foi demonstrado que após o encapsulamento em alginato, as células em cápsulas de alginato foram confirmadas por imagem de campo brilhante(Figura 2A). Ensaios de mortos ...

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Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye

Apresentado aqui é um protocolo para o uso de alginato como polímero na microencapsulação de células imortalizadas para entrega a longo prazo de biológicos aos olhos de roedores.

Tecnologia celular encapsulada para a entrega de biológicos ao olho do rato

Many current therapeutics under development for diseases of the posterior pole of the eye are biologics. These drugs need to be administered frequently, ...

Esta técnica é uma maneira confiável de fornecer qualquer conteúdo, como drogas, proteínas ou células para locais específicos em tecidos ou animais. Você pode acompanhar a entrega e ajustar a liberação do conteúdo para se adequar ao experimento desejado. Pode ser usado para tratar inúmeras doenças, desde a cicatrização de feridas até doenças oculares e cardíacas.A principal vantagem deste método é a capacidade de fornecer células terapêuticas usando microcápsulas alginatos para os locais alvo sem causar reações imunológicas e manter uma entrega sustentada de terapêuticas secretas frescas por um período maior de tempo. Comece por culminar células epiteliais da retina de acordo com as instruções do manuscrito. Passagem das células quando atingem 70 a 80% de confluência usando procedimentos padrão de cultura tecidual.Para encapsular as células, misture alginato de sódio com água deionizada para uma concentração final de 2% de peso ao volume e purifique a mistura via filtração com um filtro de seringa estéril de 0,2 micrômetro. Trypsinize, centrífuga e lave as células com solução salina tamponada HEPES de 10 mililitros. Use um hemótmetro para contar as células e ajustar a concentração celular final para um milhão por mililitro de solução de alginato.Carregue 300 alíquotas de microliter da mistura de alginato e células em uma seringa de três mililitros e anexe-a a uma bomba de seringa. Prepare um banho de gelagem de acordo com as instruções do manuscrito e coloque-o em um béquer estéril de 50 mililitros abaixo da ponta da seringa em uma agulha de sete milímetros para a distância de pulverização do banho. Ajuste a tensão para oito quilovolts e a vazão para 30 milímetros por hora para produzir microcápsulas de cerca de 150 micrômetros de tamanho.Conecte o clipe de terra preto ao fio de cobre que está meio submerso no banho de gelagem e conecte o clipe do fio ânodo vermelho à agulha. Leva aproximadamente 30 minutos para preparar células encapsuladas de cada um lote mililitro da mistura de alginato e celular. Quando formado, lave as microcápsulas com solução de lavagem duas vezes e incuba-as com mídia DMEM suplementada de 10%FBS em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5%DE CO2.Após uma incubação de 24 horas, prepare uma amostra de 500 microliter de microcápsulas para coloração, lavando-as duas vezes em solução de lavagem. Use um kit de ensaio LIVE/DEAD para manchá-los para viabilidade. Para garantir que as microcápsulas sejam adequadamente dimensionadas, dilui-as em mídia livre de soro.Aspire-os cuidadosamente com uma seringa Hamilton de 2,5 microliter. Ejete lentamente um microliter em um slide de microscópio e determine a integridade das microcápsulas usando um microscópio Brightfield vertical. Em um rato apropriadamente anestesiado, aplique lubrificante ocular para manter a umidade dos olhos e use uma agulha de seringa chanfrada de 3/8 polegadas de calibre 26 para estabelecer uma punção inicial do olho logo abaixo do limbus.Certifique-se de se aproximar do olho a partir de uma direção nasal em um ângulo de 45 graus mantendo a ponta chanfrada para cima para evitar perfuração da lente. Em seguida, certifique-se de que toda a ponta da agulha está inserida no olho para a geração de orifícios guia, mas tome cuidado para não viajar muito longe e perfurar a retina temporal. Uma vez que isso esteja completo, retraia lentamente a agulha.Dentro do micromanipulador, coloque uma seringa Hamilton de calibre 27 de bitola 2,5 microliter que foi preenchida com solução de cápsula e forra a agulha com o orifício guia inicial. Segure a cabeça do animal em uma posição estável e deliberadamente manobrem a agulha em direção ao olho. Para garantir uma posição correta da agulha dentro do vítreo, insira a seringa até que a ponta da agulha possa ser visualizada atrás da lente.Em seguida, injete a solução da cápsula lentamente ao longo de 25 a 30 segundos. E uma vez concluída, retraia gradualmente a seringa de ponta cega, a fim de minimizar a lesão no olho. Se necessário, ajuste o tamanho da cápsula ajustando a tensão e a taxa de fluxo de acordo com as instruções do manuscrito.O encapsulamento das células em alginato foi confirmado com imagens brightfield e um ensaio LIVE/DEAD demonstrou que 90% das células eram viáveis pós-encapsulamento. A viabilidade a longo prazo das células foi garantida pela dissolução das cápsulas em citrato de sódio e replação. A injeção intravitreal foi realizada sob inspeção visual que permitiu a visualização de cápsulas no vítreo.Ao tentar este procedimento, não use PBS para quaisquer etapas de lavagem porque o PBS dissolve microcápsulas alginato formadas. Após seu desenvolvimento, nosso laboratório é usado como um sistema de parto para tratar formas de insuficiência cardíaca e hipertensão. Esta técnica é considerada uma ferramenta promissora para o tratamento futuro de diferentes doenças cardiovasculares e neurológicas.

Research

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