Name: primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum
Uploaded: 2019-10-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum at JoVE.com

وكانت هذه الدراسات مدعومة بمنح من مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية (HM: NSERC ديسكفري غرانت # RGPIN-2018-06040) ، ومعهد بحوث مستشفي الأطفال في مانيتوبا (HM: غرانت # 320035) ، وال ALS كندا-الدماغ كندا أرثر J. هدسون منحه فريق الانتقالية (JK ، HM).

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للوائح المؤسسية ودليل رعاية واستخدام الكائنات التجريبية من المجلس الكندي لرعاية الماشية ووافقت عليها السلطات المحلية ("الرعاية الحيوانية في الحرم الجامعي Bannatyne لجنه "). وبذلت جميع الجهود للتقليل إلى ادني حد من عدد الماشية المستخدمة ومعاناتها. وأكد ا...

<ol>
	<li>Giffard, R. G., Ouyang, Y. B., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+primary+neural+cells.">Cell culture: primary neural cells.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 633-637 (2009).</li><li>Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+Cross-Contamination+and+Misidentification+of+278+Widely+Used+Tumor+Cell+Lines.">Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines.</a> PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).</li><li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixing+problems+with+cell+lines.">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Capes-Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Check+your+cultures!+A+list+of+cross-contaminated+or+misidentified+cell+lines.">Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines.</a> International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).</li><li>Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+cycle:+the+neuron+itself+and+its+circumstances.">Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances.</a> Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).</li><li>Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+a+breakthrough+in+vivo.">Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+primary+neural+cells.">Cell culture: primary neural cells.</a> Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , (2017).</li><li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum.">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).</li><li>Sudarov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascl1+genetics+reveals+insights+into+cerebellum+local+circuit+assembly.">Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly.</a> Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).</li><li>Rahimi-Balaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrin+II+Is+Ectopically+Expressed+in+Microglia+in+the+Cerebellum+of+Neurogenin+2+Null+Mice.">Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice.</a> Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).</li><li>Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Migration+During+Development+of+the+Cerebellum.">Neuronal Migration During Development of the Cerebellum.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).</li><li>Buffo, A., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin,+lineage+and+function+of+cerebellar+glia.">Origin, lineage and function of cerebellar glia.</a> Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).</li><li>Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Precursor+Cells+from+the+Rhombic+Lip+Are+Specified+to+a+Cerebellar+Granule+Neuron+Identity.">Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity.</a> Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).</li><li>Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Indispensable+Roles+of+Microglia+and+Astrocytes+during+Brain+Development.">The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development.</a> Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).</li><li>Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+culturing+cerebellar+Purkinje+cells+with+differentiated+dendrites+under+a+mixed+monolayer+setting.+Brain+research.">An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research.</a> Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).</li><li>Tabata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+method+for+culture+of+dissociated+mouse+cerebellar+cells+enriched+for+Purkinje+neurons.">A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).</li><li>Marzban, H., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+promotes+the+development+of+deep+cerebellar+nuclear+neurons+in+dissociated+mouse+cerebellar+cultures.">Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures.</a> Brain Research. 1141, 25-36 (2007).</li><li>Schaller, K. L., Caldwell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+distribution+of+voltage-gated+sodium+channels+in+the+cerebellum.">Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum.</a> Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).</li><li>Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+precursor+cells+from+the+rhombic+lip+are+specified+to+a+cerebellar+granule+neuron+identity.">Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity.</a> Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).</li><li>van der Valk, J., Gstraunthaler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Bovine+Serum+(FBS)+-+A+pain+in+the+dish.">Fetal Bovine Serum (FBS) - A pain in the dish.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).</li><li>Froud, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+benefits+and+disadvantages+of+serum-free+media.">The development, benefits and disadvantages of serum-free media.</a> Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).</li><li>Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+passage+number+on+osteogenic+and+adipogenic+characteristics+of+D1+cells.">The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells.</a> Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).</li><li>Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A., Barh, D., Azevedo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+culture:+the+base+of+biotechnology.">Cell and tissue culture: the base of biotechnology.</a> Omics Technologies and Bio-Engineering. , 391-429 (2018).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).</li><li>Nelson, K. B., Bauman, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thimerosal+and+autism.">Thimerosal and autism.</a> Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).</li><li>Marzban, H., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+promotes+the+development+of+deep+cerebellar+nuclear+neurons+in+dissociated+mouse+cerebellar+cultures.">Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures.</a> Brain Research. 1141, 25-36 (2007).</li></ol>

استخدام الثقافات الاوليه هو وسيله معروفه تنطبق علي جميع أنواع الخلايا العصبية17،18،19. في البروتوكول المعروض ، ونحن شرح كيفيه عزل الخلايا العصبية المخيخ والحفاظ علي صلاحيتها مع البقاء علي قيد الحياة الأمثل في المختبر لمده أقصاها 3 أسابيع. ?...

لعده عقود ، وقد استخدمت خطوط الخلايا علي نطاق واسع كاداه عاليه الانتاجيه في الدراسات الاكلينيكيه والبحوث البيولوجية. الفعالية من حيث التكلفة ، والنمو السريع ، والحد من استخدام الحيوانية الحية هي بعض الفوائد من استخدام هذه الخلايا. ومع ذلك ، تتراكم التغييرات الجينية والتغيرات الظاهرية بعد عده مقاطع في المختبر1. يمكن ان يؤدي التعريف الخاطئ لخطوط الخلايا والتشابه الوراثي من الخلايا الاوليه إلى تجارب غير قابله للتكرار واستنتاجات زائفه2و3و4و5. ولذلك ، علي الرغم من بعض أوجه التشابه للخلايا المتمايزة مثل الخلايا العصبية (علي سبيل المثال ، الناقلات العصبية ، قنوات أيون ، مستقبلات ، وغيرها من البروتينات العصبية الخاصة) ، لا يمكن تكرار خطوط الخلايا العصبية النمط الظاهري الكامل للخلايا العصبية. استخدام الخلايا العصبية ناضجه هو خيار آخر. ومع ذلك ، هذه الخلايا غير تقسيم الخلايا للتفتل التي يصعب نشرها في الثقافة. وعلاوة علي ذلك, أعاده الدخول في دوره الخلية قد يعجل المبرمج6.
وقد تم تطوير ثقافة الخلايا ثلاثية الابعاد (3D) ، وثقافات الشريحة المجسمة ، والثقافات العضوية لتوفير بيئة يمكن فيها للخلايا ان ترتب في شكل ثلاثي الابعاد يحاكي الاعداد المجري. التالي ، يمكن دراسة الاتصال من خليه إلى خليه ، والهجرة ، وغزو الخلايا السرطانية في الانسجه المحيطة بها ، وتولد الاوعيه7. ومع ذلك ، فان التكاليف الاضافيه لاستخدام المصفوفات الخلوية الاضافيه (ECM) البروتينات أو الهلام المائي الاصطناعية كفراش ، وصعوبة في التصوير ، والتوافق مع أدوات الفحص عاليه الانتاجيه هي عيوب كبيره من الخلايا 3D الخياطة. ومن المساوئ الرئيسية للثقافة النسيجية شريحة النسيج هو استخدام عدد كبير من الكائنات والآثار السلبية للاستئصال ، مما يؤدي إلى عدم الوصول إلى الأهداف وعوامل النمو لaxotomy ، التالي وفاه الخلايا العصبية8.
ولذلك ، فان النهج البديل ، الذي يتجنب المشاكل مع خطوط الخلايا ، وصعوبة نمو الخلايا الناضجة ، وتعقيد الانسجه ، هو في نضج المختبر من الخلايا الاساسيه غير ناضجه. وتستمد الخلايا الاوليه مباشره من الانسجه البشرية أو الحيوانية وتنفصل باستخدام الانزيمات و/أو الطرق الميكانيكية9. المبادئ الرئيسية للعزل ، البذر ، والصيانة في الثقافة المتوسطة متشابهة بغض السواء عن مصدر الانسجه. ومع ذلك ، فان العوامل الغذائية اللازمة لتعزيز الانتشار والنضج هي خلايا محدده جدا6.
ان معرفه "تاريخ الميلاد" لكل نوع من أنواع الخلايا المخيخه شرط أساسي لتصميم تجربه الثقافة الاساسيه. بشكل عام ، والخلايا purkinje (أجهزه الكمبيوتر) والعصبية من نوى المخيخ (CN) ، يولدون قبل الخلايا الصغيرة ، بما في ذلك الخلايا العصبية (علي سبيل المثال ، سله ، والخلايا النجميه) والكريات الحبيبية. في الفئران ، تظهر أجهزه الكمبيوتر بين اليوم الجنيني (E) 10 – E13 ، في حين ان الخلايا العصبية CN في حوالي E9-E1210.
تولد الخلايا العصبية المخيخ الأخرى في وقت لاحق بكثير. علي سبيل المثال ، في الفئران ، يتم توليد السكان الفرعيين golgi من الخلايا العصبية من VZ في (~ E14 − E18) والتداخلات المتبقية (خليه سله والزنزانات النجميه) الموجودة في الطبقة الجزيئية الخروج من تقسيم خلايا السلف في المسالة البيضاء بين أوائل بعد الولادة (P) 0 – P711. يتم إنشاء الخلايا الحبيبية من المنطقة الجرثومية الخارجية (EGZ) ، وهي منطقه الإنبات الثانوية التي تستمد من الشفة المعينة اللحمية وتمر عبر تقسيم المحطة بعد الولادة. ولكن قبل ان تنشا سلائفها من الشفة المعينة من E13 – E16 ، فقد هاجرت الخلايا بالفعل علي طول سطح بيا لجعل طبقه رقيقه من الخلايا علي السطح الظهري لل anlage المخيخ. ولدت خلايا ماكروجليال غير العصبية مثل استروسيتيس و oligodendrocytes ، والتي تنشا من ظهاره عصبيه البطين ، في e 13.5 − P0 و P0 − P7 علي التوالي11،12،13،14 ،15. وتستمد الخلايا الصغيرة من الخلية البدائية للخلايا النخاعية من الصفار بين الساعة8 – 10وبعد الغزو إلى الجهاز العصبي المركزي يمكن الكشف عنها في دماغ الفار بواسطة E9 16.
وتستند الطريقة المعروضة في هذه المقالة علي واحد وضعت أصلا من قبل furuya et al. و tabata et al.17,18, الذي تم الأمثل للذبح الاوليه من الخلايا purkinje المستمدة من wistar الفئران المخيخ. لدينا الآن تكييف هذه الطريقة وتعديلها بعناية لدراسة نمو الخلايا العصبية الفئران المخيخ19. علي عكس في بروتوكولنا الجديد ، الباردة تشريح المتوسط هو المخزن المؤقت الغسيل الرئيسية المستخدمة خلال التشريح والتفكك الخطوات قبل أضافه البذر المتوسطة في البروتوكول Furuya في17. هذا العازل يفتقر إلى التغذية ، وعوامل النمو ، والهرمونات (كل ذلك في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة: خليط المغذيات F-12 [DMEM/F12]) التي هي ضرورية لدعم نمو الخلايا والبقاء علي قيد الحياة خلال الخطوات المذكورة أعلاه. الاضافه إلى ذلك ، استنادا إلى خبرتنا الواسعة مع الثقافات المخيخ الاوليه murine ، وقد استخدمنا 500 μL من الوسط الثقافي في كل بئر (بدلا من 1 مل) وزيادة تركيز ثلاثي ايودوثيرونين إلى 0.5 ng/mL ، مما يحسن نمو الخلايا العصبية ، في خاصه تلك التي لديها النمط الظاهري الخلية Purkinje ، ويعزز النمو من فروع شجيري في الثقافة. الطريقة الرئيسية التي ظهرت في هذه المقالة يمكن تطبيقها علي نطاق واسع علي القوارض الصغيرة الأخرى (علي سبيل المثال ، السناجب والهامستر) اثناء النمو الجنيني ويمكن استخدامها لدراسة نشاه الأعصاب المخيخ والتمايز في المراحل الجنينية المختلفة ، والتي تختلف بين الأنواع.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS5 Version 12</td>
			<td>Adobe Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0438</td>
			<td>3 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALB1</td>
			<td>Swant Swiss Antibodies (Polyclonal)</td>
			<td>CB38</td>
			<td>1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALB1</td>
			<td>Swant Swiss Antibodies (Monoclonal)</td>
			<td>300</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>Delasco</td>
			<td>DF-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM-F12)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Circles</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>I5500, I6634, I1882, and I4011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Scissor</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>52134-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallized Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Bright-Line</td>
			<td>3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection Forceps</td>
			<td>Merlan</td>
			<td>624734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattern 5 Tweezer</td>
			<td>Dixon</td>
			<td>291-9454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron (P4)</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVALB</td>
			<td>Swant Swiss Antibodies</td>
			<td>235</td>
			<td>1/1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samll Scissor</td>
			<td>WPI Swiss Scissors, 9cm</td>
			<td>504519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-iodothyronine (T3)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Z2 Imager</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum

أصبح استخدام ثقافات الخلايا الاوليه واحده من الاداات الرئيسية لدراسة الجهاز العصبي في المختبر. الهدف النهائي من استخدام هذا النظام نموذج مبسط هو توفير البيئة الدقيقة التي تسيطر عليها والحفاظ علي معدل البقاء علي قيد الحياة عاليه والسمات الطبيعية للخلايا العصبية وغير العصبية فصل قدر الإمكان تحت الظروف في المختبر. في هذه المقالة ، ونحن نظهر طريقه لعزل الخلايا العصبية الاساسيه من المخيخ الماوس النامية ، ووضعها في بيئة في المختبر ، وإنشاء نموها ، ورصد صلاحيتها والتمايز لعده أسابيع. ينطبق هذا الأسلوب علي الخلايا العصبية الجنينية التي تنفصل عن المخيخ بين الأيام الجنينية 12 – 18.

استنادا إلى تواريخ ميلاد مختلفه من الأنواع الفرعية العصبية في المخيخ ، والثقافات من الاجنه الماوس E12 − E18 أسفرت عن أنواع مختلفه من الخلايا. برزت الخلايا العصبية الإسقاط الكبيرة ، مثل الخلايا العصبية CN (E9) وأجهزه الكمبيوتر (E13) ، في وقت مبكر خلال التنمية المخيخ. في الفئران والحبيبية وخلايا Golg...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum at JoVE.com

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

اجراء التجارب في المختبر للتفكير في الظروف المجرية باقصي قدر ممكن ليست مهمة سهله. استخدام ثقافات الخلايا الاوليه هو خطوه هامه نحو فهم بيولوجيا الخلية في كائن حي بأكمله. البروتوكول المنصوص عليه الخطوط العريضة كيفيه النمو بنجاح وثقافة الخلايا العصبية المخيخ الفئران الجنينية.

الثقافة الاساسيه للخلايا العصبية معزولة عن المخيخ الفئران الجنينية

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

ثقافة الخلايا العصبية الأساسية هو نظام نموذج مثالي لدراسة الخلايا العصبية المنفصلة في الثقافة المختبرية. وميزة استخدام هذا الأسلوب هو أن تكون قادرة على الحفاظ على السمات الخلوية للخلايا المنفصلة، مثل الآليات، وظائف، ومورفولوجيا في ظروف المختبر لبضعة أسابيع في أقرب وقت ممكن إلى في حالة الجسم الحي. وضع غطاء الجولة زلات في لوحة 24 جيدا تحت مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.إضافة 90 ميكروليتر من بولي-L-ornithine على كل زلة الغطاء. أغلق الغطاء ووضع الطبق برفق في حاضنة 37 درجة لمدة يومين. إعداد الثقافة المتوسطة و البذر المتوسطة والاحتفاظ بها في أربع درجات مئوية.إعداد حل التربسين العمل في DMEM/F12 والاحتفاظ بها عند أربع درجات. وضع الثقافة المتوسطة والمتوسطة البذر في الحاضنة في 37 درجة. أخرجي طبق الـ24 بئراً من الحاضنةغسل الغطاء زلات ثلاث مرات مع الماء المقطر مزدوجة. اترك قسائم الغطاء لمدة ساعتين على الأقل لتجف تمامًا. إعداد ثلاثة أطباق بيتري مليئة PBS الباردة، وثلاثة أطباق بيتري مليئة HBSS الباردة، وخمسة أطباق بيتري مليئة بوسيطة تشريح الباردة على الجليد.اُجَزّر قرون الرحم واغسلها في برنامج تلفزيوني بارد ثلاث مرات على الجليد. من هنا يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات على الجليد لتقليل تلف الأنسجة. بعد آخر خطوة غسل، فصل الجراء من الرحم في HBSS ونقلها إلى وسيط تشريح الباردة.في تشريح المتوسطة، وقطع رأس الجراء مع مقص. فتح العجلية من ماغنوم التجويف إلى الحدود السفلية للتجويف المداري. باستخدام زوج من ملقط غرامة، وإزالة قاعدة الجمجمة وقشر الجمجمة بعيدا عن الدماغ.إزالة بعناية السحايا من المخيخ بدءا من السطح الجانبي للرمس المخيخ الوسطى والرواد. قطع كل من الشقوق الدماغية وفصل المخيخ عن بقية الدماغ. ضع على الفور cerebella التي تم جمعها في أنبوب مخروطي معقم 15 مل مملوءة DMEM/F12 على الجليد.جهاز طرد مركزي الأنبوب في 1،000 غرام في أربع درجات لمدة دقيقة واحدة في DMEM/F12. كرر هذا ثلاث مرات، في كل مرة إزالة بلطف مافر مع ماصة وإعادة تعليق بيليه في DMEM الطازجة/F12. أضف ميليلترين من التربسين المدفأ مسبقًا وماصة بلطف لمزجها معًا.ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة لمدة 12 دقيقة. بعد الحضانة، وجلب أنبوب إلى مجلس الوزراء سلامة وإضافة 10 mLs من DMEM/F12 إلى تعطيل التربسين. جهاز طرد مركزي الخليط في 1، 200 غرام لمدة خمس دقائق.تجاهل السوبر و resuspend في المتوسطة الطازجة تليها الطرد المركزي ثلاث مرات. قبل الرطب ماصة بلاستيكية معقمة مع DMEM /F2. إضافة 3.5 ملليلتر من حل العمل DNAse إلى نفس الأنبوب.اثقب الأنسجة مع ماصة عدة مرات حتى يصل السائل إلى لون حليبي متجانس. يضاف 10 مل من DMEM/F12 الباردة إلى الخليط ثم انتقل إلى جهاز الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي العينة في 1، 200 غرام في أربع درجات لمدة خمس دقائق.إزالة بعناية فائقة دون إزعاج بيليه. إزالة وسيطة البذر من الحاضنة. إضافة 500 ميكرولترات من البذور قبل الدفء المتوسطة ومزجها بشكل جيد باستخدام ماصة.عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت. تخفيف تعليق الخلية مع متوسطة البذر إلى كثافة 500،000 خلية لكل ملليلتر. إضافة 90 ميكرولترات من الخليط إلى كل بئر في وسط الغطاء.ضع اللوحة في الحاضنة على درجة 37 لمدة ثلاث إلى أربع ساعات. بعد الحضانة، إضافة 500 ميكرولترات من ثقافة مسبقة السخاء المتوسطة في كل بئر. استبدال لوحة في الحاضنة في 37 درجة.بعد سبعة أيام، استبدال المتوسطة القديمة مع الثقافة الطازجة متوسطة II.Prepare لوحة منفصلة 24-well مع تنظيم رقمية المقابلة وإضافة 100 ميكروليتر من PFA 4٪ إلى كل بئر. بعد الأيام المطلوبة في الثقافة، وإزالة بلطف زلات الغطاء من آبار لوحة الثقافة الأصلية ووضعها في الآبار المقابلة من لوحة PFA الموصوفة في الخطوة السابقة. أضف PFA إلى الآبار لتغمر زلات الغطاء تمامًا.حافظ على لوحة PFA عند أربع درجات لمدة 30 إلى 120 دقيقة. بعد الحضانة، واستعادة لوحة إلى درجة حرارة الغرفة. غسل الغطاء زلات بلطف مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق ثلاث مرات.يظهر الشكل الثاني في النص ثقافة الخلية cerebellar ابتداء من E18. Immunofluorescence لcalbindin يظهر الخلايا العصبية Purkinje مع ملحقات محور عصبي من قبل ثلاثة أيام في المختبر. من سبعة إلى 10 أيام في المختبر، والعمليات التشعب واضحة.في 21 يوما، فروع التشعب المعقدة موجودة. ويبين الشكل الثالث في النص ثقافات الخلايا المخية التي تبدأ في أيام جنينية مختلفة. الكشف المناعي من كالبيندين يظهر الخلايا العصبية Purkinje مع المحاور في وقت مبكر فقط بعد 18 يوما في المختبر.بدأت ثقافات الخلايا العصبية بوركينجي في E14 وE15 تطوير التشعبات، ولكن أبدا معقدة مثل تلك التي تتطور عندما E18 هو نقطة البداية. ويبين الشكل الرابع في النص أن أنواع الخلايا المختلفة تتطور من الثقافات E18 بعد 21 يوما في المختبر. كالبيندين خضراء immunofluorescence يظهر الخلايا العصبية Purkinje.المناعة الحمراء لparvalbumin في B و C تظهر interneurons المثبطة. يظهر المناعة الحمراء لـ قناة جهد الصوديوم المسور في E و F الخلايا العصبية الحبيبية. وهذا البروتوكول فعال من حيث التكلفة ويسهل سلوكه.في نهاية هذا الفيديو، سوف تكون قادرة على جمع والخلايا العصبية cerebellar الثقافة وإصلاحها في DIVs المطلوب.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

Anatomy of the Central and Peripheral Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

تشريح والثقافة من الخلايا العصبية من النخاع الشوكي صواري الجنينية

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection والثقافة الأولية من الخلايا العصبية الجنينية الماوس الحصين والقشرية

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Lectin القائم على عزل وثقافة حركية مماثلة الجنينية الماوس

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

ثنائي الصفائح المشارك ثقافة الجرذ الخلايا العصبية الابتدائية القشرية والدبقية

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

على<em&gt; في المختبر</em&gt; إعداد الخلايا العصبية المعوية المعزولة والدبقية من الضفيرة العضلية المعوية من الماوس الكبار

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

الثقافة الابتدائية من الخلايا العصبية الدوبامين ماوس

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

العزلة والثقافة وطويل الأجل صيانة الابتدائية الدماغ المتوسط ​​الدوبامين العصبية من المخ الجنينية القوارض

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر من الخلايا العصبية المهاجرة في شريحة عضوي نمط ثقافة الفأر الجنينية باستخدام الدماغ<em&gt; في أوتيرو</em&gt; إليكتروبوراتيون

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

جيل من المجالات العصبية من الخلايا العصبية خلية فرس النهر الأولية المختلطة والقشرية معزولة عن E14-E16 سبراغ دولي الفئران الجنين

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...