Name: primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum
Uploaded: 2019-10-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum at JoVE.com

Disse undersøgelser blev støttet af tilskud fra naturvidenskab og ingeniør Forskningsråd (HM: NSERC Discovery Grant # RGPIN-2018-06040) og Children Hospital Research Institute of Manitoba (HM: Grant # 320035) og ALS Canada-Brain Canada Arthur J. Hudson translational team Grant (JK, HM).

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle regler og vejledning i pleje og anvendelse af forsøgsdyr fra det canadiske råd for dyrepleje og er blevet godkendt af lokale myndigheder ("The Bannatyne campus Animal Care Udvalg "). Alle bestræbelser blev gjort for at minimere antallet og lidelser af dyr, der anvendes. Tilstrækkelig dybde af anæstesi blev bekræftet ved at observere, at der ikke var nogen ændring i respiratorisk hastighed forbundet med manipulation og tå knivspids eller hornh...

<ol>
	<li>Giffard, R. G., Ouyang, Y. B., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+primary+neural+cells.">Cell culture: primary neural cells.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 633-637 (2009).</li><li>Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+Cross-Contamination+and+Misidentification+of+278+Widely+Used+Tumor+Cell+Lines.">Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines.</a> PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).</li><li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixing+problems+with+cell+lines.">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Capes-Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Check+your+cultures!+A+list+of+cross-contaminated+or+misidentified+cell+lines.">Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines.</a> International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).</li><li>Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+cycle:+the+neuron+itself+and+its+circumstances.">Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances.</a> Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).</li><li>Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+a+breakthrough+in+vivo.">Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+primary+neural+cells.">Cell culture: primary neural cells.</a> Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , (2017).</li><li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum.">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).</li><li>Sudarov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascl1+genetics+reveals+insights+into+cerebellum+local+circuit+assembly.">Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly.</a> Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).</li><li>Rahimi-Balaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrin+II+Is+Ectopically+Expressed+in+Microglia+in+the+Cerebellum+of+Neurogenin+2+Null+Mice.">Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice.</a> Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).</li><li>Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Migration+During+Development+of+the+Cerebellum.">Neuronal Migration During Development of the Cerebellum.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).</li><li>Buffo, A., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin,+lineage+and+function+of+cerebellar+glia.">Origin, lineage and function of cerebellar glia.</a> Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).</li><li>Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Precursor+Cells+from+the+Rhombic+Lip+Are+Specified+to+a+Cerebellar+Granule+Neuron+Identity.">Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity.</a> Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).</li><li>Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Indispensable+Roles+of+Microglia+and+Astrocytes+during+Brain+Development.">The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development.</a> Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).</li><li>Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+culturing+cerebellar+Purkinje+cells+with+differentiated+dendrites+under+a+mixed+monolayer+setting.+Brain+research.">An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research.</a> Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).</li><li>Tabata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+method+for+culture+of+dissociated+mouse+cerebellar+cells+enriched+for+Purkinje+neurons.">A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).</li><li>Marzban, H., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+promotes+the+development+of+deep+cerebellar+nuclear+neurons+in+dissociated+mouse+cerebellar+cultures.">Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures.</a> Brain Research. 1141, 25-36 (2007).</li><li>Schaller, K. L., Caldwell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+distribution+of+voltage-gated+sodium+channels+in+the+cerebellum.">Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum.</a> Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).</li><li>Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+precursor+cells+from+the+rhombic+lip+are+specified+to+a+cerebellar+granule+neuron+identity.">Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity.</a> Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).</li><li>van der Valk, J., Gstraunthaler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Bovine+Serum+(FBS)+-+A+pain+in+the+dish.">Fetal Bovine Serum (FBS) - A pain in the dish.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).</li><li>Froud, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+benefits+and+disadvantages+of+serum-free+media.">The development, benefits and disadvantages of serum-free media.</a> Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).</li><li>Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+passage+number+on+osteogenic+and+adipogenic+characteristics+of+D1+cells.">The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells.</a> Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).</li><li>Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A., Barh, D., Azevedo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+culture:+the+base+of+biotechnology.">Cell and tissue culture: the base of biotechnology.</a> Omics Technologies and Bio-Engineering. , 391-429 (2018).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).</li><li>Nelson, K. B., Bauman, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thimerosal+and+autism.">Thimerosal and autism.</a> Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).</li><li>Marzban, H., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+promotes+the+development+of+deep+cerebellar+nuclear+neurons+in+dissociated+mouse+cerebellar+cultures.">Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures.</a> Brain Research. 1141, 25-36 (2007).</li></ol>

Brugen af primære kulturer er en velkendt metode, der gælder for alle typer af neuroner17,18,19. I den præsenterede protokol forklarer vi, hvordan man isolerer cerebellare neuroner og bevarer deres levedygtighed med optimal overlevelse in vitro i højst 3 uger. Primær kultur af cerebellare celler, som blev isoleret ved E15 − E18, bekræfter indsamlingen af tre klasser af store neuroner: pc'er, Golgi celler, og CNs. Celle k...

I flere årtier, cellelinjer har været meget anvendt som en høj gennemløb værktøj i prækliniske undersøgelser og biologisk forskning. Omkostningseffektivitet, hurtig vækst, og reduktion af levende dyr brug er nogle fordele ved at bruge disse celler. Imidlertid akkumuleres genetiske forandringer og fænotypiske ændringer efter flere passager in vitro1. Fejlidentifikation af cellelinjer og genetisk dissimilaritet fra primære celler kan føre til irreproducerbare eksperimenter og falske konklusioner2,3,4,5. Derfor, på trods af nogle ligheder med differentierede celler såsom neuroner (f. eks neurotransmittere, Ion kanaler, receptorer, og andre neuron-specifikke proteiner), neuronal cellelinjer kan ikke replikere den fulde fænotype af neuroner. Ved hjælp af modne neuroner er en anden mulighed; men disse celler er ikke-dividere postmitotiske celler, der er vanskelige at udbrede i kulturen. Desuden kan genindførsel i cellecyklussen udløse apoptose6.
Tredimensionelle (3D) cellekultur, organotypiske skive kulturer, og organoid kulturer er blevet udviklet til at give et miljø, hvor cellerne kan arrangere i en 3D-form, der efterligner in vivo-indstillingen. Således celle-til-celle kommunikation, migration, invasion af tumorceller i omgivende væv, og angiogenese kan undersøgt7. Men, ekstra omkostninger ved at bruge ekstracellulære matrix (ECM) proteiner eller syntetiske silicagelrogeler som en strøelse, problemer med billeddannelse, og kompatibilitet med High-gennemløb screening instrumenter er betydelige ulemper ved 3D-celledyrkning. En væsentlig ulempe ved organotypic vævs skive kultur er brugen af et stort antal dyr og de negative virkninger af axotomi, hvilket fører til manglende adgang til mål og vækstfaktorer for axons, og dermed neuronal død8.
Derfor er en alternativ tilgang, som undgår problemer med cellelinjer, vanskeligheden ved at dyrke modne celler, og kompleksiteten af væv, er in vitro modning af umodne primære celler. Primær cellerne udledes direkte fra humane eller animalske væv og adskilles ved hjælp af enzymatiske og/eller mekaniske metoder9. De vigtigste principper for isolation, såning, og vedligeholdelse i kulturmedium er ens uanset vævs kilden. Men de trofiske faktorer, der er nødvendige for at fremme spredning og modning er meget celle specifikke6.
At kende "fødselsdato" for hver cerebellare celletype er en forudsætning for at designe et primært kultur eksperiment. I almindelighed, Purkinje celler (PCs) og neuroner i cerebellare kerner (CN), er født før de mindre celler, herunder interneuroner (f. eks, kurv, stellate celler) og granulet celler. Hos mus dukker der pc'er op mellem embryon dag (E) 10 – E13, mens CN neuroner ved ca. E9 – E1210.
Andre cerebellar neuroner er født meget senere. For eksempel, i mus, den Golgi delpopulation af interneuroner er genereret fra VZ ved (~ E14 − E18) og den resterende interneuroner (kurve celle og stellate celler) placeret i det molekylære lag opstår fra at dividere stamceller i den hvide substans mellem tidligt postnatale (P) 0 – P711. Granule celler genereres fra den eksterne avlsmateriale zone (egz), en sekundær germinale zone, der er afledt af rostral Columns rhombisk LIP og går gennem Terminal division efter fødslen. Men før deres prækursorer opstår fra rhombisk LIP fra E13-E16, har cellerne allerede migreret rostrally langs Pia overfladen for at lave et tyndt lag af celler på rygoverfladen af cerebellum Anlage. Nonneuronal makrogliale celler såsom astrocytter og oligodendrocytter, som stammer fra ventrikulær neuroepitel, er født på e 13.5 − p0 og p0 − P7 henholdsvis11,12,13,14 ,15. Microglia er afledt af blomme-SAC primitive myeloide stamceller mellem E8-E10 og efter invasion i centralnervesystemet kan påvises i muse hjernen af E916.
Metoden i denne artikel er baseret på den, der oprindeligt blev udviklet af Furuya et al. og Tabata et al.17,18, som blev optimeret til primær dyrkning af Purkinje celler afledt af Wistar rotte cerebella. Vi har nu tilpasset denne metode og omhyggeligt modificeret den til at studere væksten af mus cerebellar neuroner19. I modsætning til i vores nye protokol, kold dissektion medium er den vigtigste vaskebuffer anvendes under dissektion og dissociation trin før tilsætning af såning medium i Furuya protokol17. Denne buffer mangler ernæring, vækstfaktorer og hormoner (alle i Dulbecco's modificerede Eagle medium: næringsstof blanding F-12 [DMEM/F12]), der er nødvendige for at understøtte cellevækst og overlevelse under de førnævnte trin. Ud fra vores omfattende erfaring med murine primære cerebellare kulturer har vi desuden brugt 500 μL kulturmedium i hver brønd (i stedet for 1 mL) og øget Tri-iodothyroninkoncentrationen til 0,5 ng/mL, hvilket forbedrer væksten af neuronal celler, i især dem med en Purkinje celle fænotype, og fremmer den udvækst af dendritiske grene i kulturen. Den vigtigste metode i denne artikel kan anvendes bredt på andre små gnavere (f. eks. egern og hamstere) under fosterudviklingen og kan anvendes til at studere cerebellare neurogenese og differentiering i de forskellige embryonale stadier, som forskellige arter.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS5 Version 12</td>
			<td>Adobe Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0438</td>
			<td>3 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALB1</td>
			<td>Swant Swiss Antibodies (Polyclonal)</td>
			<td>CB38</td>
			<td>1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALB1</td>
			<td>Swant Swiss Antibodies (Monoclonal)</td>
			<td>300</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>Delasco</td>
			<td>DF-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM-F12)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Circles</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>I5500, I6634, I1882, and I4011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Scissor</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>52134-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallized Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Bright-Line</td>
			<td>3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection Forceps</td>
			<td>Merlan</td>
			<td>624734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattern 5 Tweezer</td>
			<td>Dixon</td>
			<td>291-9454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron (P4)</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVALB</td>
			<td>Swant Swiss Antibodies</td>
			<td>235</td>
			<td>1/1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samll Scissor</td>
			<td>WPI Swiss Scissors, 9cm</td>
			<td>504519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-iodothyronine (T3)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Z2 Imager</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum

Brugen af primære cellekulturer er blevet et af de vigtigste værktøjer til at studere nervesystemet in vitro. Det ultimative mål med dette forenklede model system er at give et kontrolleret mikromiljø og opretholde den høje overlevelsesrate og de naturlige træk ved dissocierede neuronal og nonneuronal celler så meget som muligt under in vitro-betingelser. I denne artikel, vi demonstrere en metode til at isolere primære neuroner fra at udvikle musen cerebellum, placere dem i et in vitro-miljø, etablering af deres vækst, og overvågning af deres levedygtighed og differentiering i flere uger. Denne metode gælder for embryonale neuroner dissocieret fra cerebellum mellem embryonale dage 12 – 18.

Baseret på de forskellige fødselsdatoer af neuronal undertyper i cerebellum, kulturer fra E12-E18 muse embryoner gav forskellige celletyper. Store projektion neuroner, såsom CN neuroner (E9 − E12) og pc'er (E10 − E13), opstod tidligt under cerebellare udvikling. I mus opstod granulet og Golgi celler mellem ~ E13 – E18 og gennemgik Terminal divisioner op til postnatal uge 4.
Udskiftning af gamle medium i med frisk kulturmedium II på dage in vitro (DIV) 7 vil I sidste ende forhindre gl...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum at JoVE.com

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Gennemførelse in vitro forsøg til at afspejle in vivo betingelser så tilfredsstillende som muligt er ikke en let opgave. Brugen af primær cellekulturer er et vigtigt skridt i retning af at forstå cellebiologi i en hel organisme. Den medfølgende protokol skitserer, hvordan man med held vokse og kultur embryonale mus cerebellar neuroner.

Primær kultur af neuroner isoleret fra embryonale mus cerebellum

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Primær neuronal cellekultur er et ideelt modelsystem til at studere dissocierede neuroner in vitro-kultur. Fordelen ved at bruge denne metode er at være i stand til at opretholde de cellulære funktioner i dissocierede celler, såsom mekanismer, funktioner, og morfologi in vitro betingelser for et par uger så tæt som muligt på in vivo tilstand. Sæt det runde dækselssedler i en 24-brøndplade under biosikkerhedsskabet.Tilføj 90 mikroliter af poly-L-ornithin på hver dæksel slip. Luk hætten og læg forsigtigt pladen i 37 graders inkubator i to dage. Forbered kulturmediet og såningsmediet, og hold dem på fire grader Celsius.Forbered arbejdsløsningen trypsin i DMEM/F12, og hold den på fire grader. Anbring kulturmediet og såningsmediet i inkubatoren ved 37 grader. Tag den 24-brønds plade ud af inkubatoren.Dækslet vaskes tre gange med dobbelt destilleret vand. Lad dækslet glide i mindst to timer for at være helt tør. Forbered tre petriskåle fyldt med kold PBS, tre petriskåle fyldt med kolde HBSS og fem petriskåle fyldt med koldt dissektionsmedium på is.Punktafgifter livmoderen horn og vask dem i koldt PBS tre gange på is. Herfra skal alle trin udføres på is for at minimere vævsskader. Efter det sidste vasketrin adskilles ungerne fra livmoderen i HBSS, og de overføres til det kolde dissektionsmedium.I dissektion medium, halshugge hvalpene med en saks. Åbn golgata fra foramen magnum til den ringere grænse af orbital hulrum. Ved hjælp af et par fine saftæt, fjerne kraniet base og skræl kraniet væk fra hjernen.Fjern forsigtigt meninges af lillehjernen startende fra den laterale overflade af den midterste cerebellar stilk og pons. Skær både cerebellar stilke og adskille lillehjernen fra resten af hjernen. Den opsamlede cerebella anbringes straks i et sterilt konisk rør på 15 ml, fyldt med DMEM/F12 på is.Centrifuge røret ved 1,000 g ved fire grader i et minut i DMEM/F12. Gentag dette tre gange, hver gang forsigtigt fjerne supernatant med en pipette og re-suspension af pellet i frisk DMEM/F12. Tilføj to milliliter forvarmte trypsin og forsigtigt pipette til at blande dem sammen.Placer røret i en 37 graders vandbad i 12 minutter. Efter inkubation skal røret bringes til sikkerhedsskabet og tilsættes 10 mL DMEM/F12 for at inaktivere trypsinen. Centrifuge blandingen ved 1, 200 g's i fem minutter.Supernatanten kasseres og resuspendres i frisk medium efterfulgt af centrifugering tre gange. Fortætte en steril plastpipette med DMEM/F2. Der tilsættes 3,5 milliliter DNAse-arbejdsopløsning til samme rør.Triturate vævet med en pipette flere gange, indtil væsken opnår en homogen mælkeagtig farve. Tilsæt 10 ml koldt DMEM/F12 til blandingen og fortsæt til centrifugen. Centrifuge prøven ved 1, 200 g ved fire grader i fem minutter.Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre pellet. Fjern såningsmediet fra rugemaskinen. Tilføj 500 mikroliter af forvarmet såning medium og bland det godt ved hjælp af pipetten.Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer. Cellesuspensionen fortyndes med såningsmedium til en massetæthed på 500.000 celler pr. milliliter. Tilføj 90 mikroliter af blandingen til hver brønd i midten af coverslip.Anbring pladen i inkubatoren ved 37 grader i tre til fire timer. Efter inkubation, tilsæt 500 mikroliter af prewarmed kultur medium i hver brønd. Sæt pladen i inkubatoren ved 37 grader.Efter syv dage, erstatte det gamle medie med frisk kultur medium II.Forbered en separat 24-brønd plade med tilsvarende numerisk organisation og tilsæt 100 mikroliter af PFA 4% til hver brønd. Efter de ønskede kulturdage fjernes dækslet forsigtigt fra brøndene på den oprindelige kulturplade og lægges dem i de tilsvarende brønde på PFA-pladen, der er beskrevet i det foregående trin. Tilføj PFA til brøndene for helt at nedsænke dækslerne.Hold PFA-pladen på fire grader i 30 til 120 minutter. Efter inkubation, gendanne pladen til stuetemperatur. Dækslet vaskes forsigtigt med PBS i fem minutter tre gange.Figur to i teksten viser cerebellar cellekultur starter ved E18. Immunofluorescens for calbindin viser Purkinje neuroner med axonale extensions med tre dage in vitro. Med syv til 10 dage in vitro, dendritiske processer er indlysende.På 21 dage, komplekse dendritiske grene er til stede. Figur tre i teksten viser cerebellar cellekulturer starter ved forskellige embryonale dage. immunfluorescensdetektion af calbindin viser Purkinje neuroner med tidlige axoner først efter 18 dage in vitro.Purkinje neuron kulturer startede på E14 og E15 vil udvikle dendritter, men aldrig så komplekse som dem, der udvikler sig, når E18 er udgangspunktet. Figur fire i teksten viser, at forskellige celletyper udvikler sig fra E18 kulturer efter 21 dage in vitro. Calbindin grøn immunfluorescens viser Purkinje neuroner.Rød immunfluorescens for parvalbumin i B og C viser hæmmende interneuroner. Rød immunfluorescens for natriumspænding-gated kanal i E og F viser granulat neuroner. Denne protokol er omkostningseffektiv og nem at gennemføre.I slutningen af denne video, vil du være i stand til at indsamle og kultur cerebellar neuroner og løse dem på ønskede DIVs.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

Anatomy of the Central and Peripheral Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-kultur Primary Rat Kortikal neuroner og glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

En<em&gt; In vitro</em&gt; Udarbejdelse af Isolerede Enteriske neuroner og glia fra plexus myentericus af Voksen Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primær Kultur Mouse dopaminerge neuroner

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolation, Kultur og opretholdelse på lang sigt af Primary mesencephaliske dopaminerge neuroner af embryonale Gnavere Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse konfokal billeddannelse af migrerende neuroner i organotypisk skive kultur af embryonale mus hjernen ved hjælp af<em&gt; I Utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Isolation og kultur af embryonale mus neurale stamceller

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Generation af Neuro kugler fra blandede primære hippocampus og kortikale neuroner isoleret fra E14-E16 Sprague Dawley rotte embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...