Name: primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum
Uploaded: 2019-10-26T14:00:00
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Questi studi sono stati sostenuti da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council (HM: NSERC Discovery Grant - RGPIN-2018-06040), e del Children Hospital Research Institute di Manitoba (HM: Grant n. 320035), e della ALS Canada-Brain Canada Arthur J. Hudson Translational Team Grant (JK, HM).

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le normative istituzionali e la Guida alla cura e all'uso degli animali sperimentali del Canadian Council for Animal Care ed è stata approvata dalle autorità locali ("il Bannatyne Campus Animal Care Commissione"). Tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il numero e la sofferenza degli animali utilizzati. Un'adeguata profondità di anestesia è stata confermata osservando che non vi è stato alcun cambiamento nella frequenza respirat...

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L'uso delle culture primarie è un metodo ben noto applicabile a tutti i tipi di neuroni17,18,19. Nel protocollo presentato, spieghiamo come isolare i neuroni cerebellari e mantenere la loro vitalità con la sopravvivenza ottimale in vitro per un massimo di 3 settimane. La coltura primaria delle cellule cerebellari, che sono state isolate all'E15-E18, conferma la raccolta di tre classi di grandi neuroni: PC, cellule Golgi e CN. ...

Per diversi decenni, le linee cellulari sono state ampiamente utilizzate come strumento ad alto throughput negli studi preclinici e nella ricerca biologica. Convenienza, rapida crescita, e la riduzione dell'uso di animali vivi sono alcuni vantaggi dell'utilizzo di queste cellule. Tuttavia, alterazioni genetiche e cambiamenti fenotipici si accumulano dopo diversi passaggi in vitro1. L'errata identificazione delle linee cellulari e la dissimilità genetica dalle cellule primarie può portare a esperimenti irriproducibili e false conclusioni2,3,4,5. Pertanto, nonostante alcune somiglianze con cellule differenziate come i neuroni (ad esempio, neurotrasmettitori, canali ionici, recettori e altre proteine specifiche del neurone), le linee cellulari neuronali non possono replicare il fenotipo completo dei neuroni. Utilizzando neuroni maturi è un'altra opzione; tuttavia, queste cellule sono cellule postmitotiche non dividendo che sono difficili da propagare in coltura. Inoltre, il rientro nel ciclo cellulare può precipitare l'apoptosi6.
Sono state sviluppate colture cellulari tridimensionali (3D), colture di fette organotipiche e colture organoidi per fornire un ambiente in cui le cellule possono disporre in una forma 3D che imita l'ambiente in vivo. Così, la comunicazione cellula-cellula, la migrazione, l'invasione delle cellule tumorali nei tessuti circostanti e l'angiogenesi possono essere studiate7. Tuttavia, i costi aggiuntivi dell'utilizzo di proteine a matrice cellulare extra (ECM) o idrogel sintetici come biancheria da letto, difficoltà nell'imaging e compatibilità con strumenti di screening ad alta produttività sono notevoli inconvenienti della coltura cellulare 3D. Uno dei principali svantaggi della coltura della falce del tessuto organotipipico è l'uso di un gran numero di animali e gli effetti negativi dell'asotomia, che porta all'inaccessibilità degli obiettivi e ai fattori di crescita per gli assoni, e di conseguenza alla morte neuronale8.
Pertanto, un approccio alternativo, che evita i problemi con le linee cellulari, la difficoltà di far crescere le cellule mature e la complessità dei tessuti, è nella maturazione in vitro delle cellule primarie immature. Le cellule primarie sono derivate direttamente dal tessuto umano o animale e dissociate utilizzando metodi enzimatici e/o meccanici9. I principi principali di isolamento, seming, e la manutenzione in mezzo di coltura sono simili indipendentemente dalla fonte di tessuto. Tuttavia, i fattori trofici necessari per promuovere la proliferazione e la maturazione sono altamente specifici per le cellule6.
Conoscere la "data di nascita" di ogni tipo di cellula cerebellare è un prerequisito per la progettazione di un esperimento di coltura primaria. In generale, le cellule Purkinje (PC) e i neuroni dei nuclei cerebellari (CN), nascono prima delle cellule più piccole, compresi gli interneuroni (ad esempio, cesti, cellule stellate) e le cellule granule. Nei topi emergono PC tra il giorno embrionale (E)10–E13, mentre i neuroni CN a circa E9–E1210.
Altri neuroni cerebellari nascono molto più tardi. Ad esempio, nei topi, la sottopopolazione Golgi degli interneuroni è generata dal V, a (E14-E18) e gli interneuroni rimanenti (cellule del cestino e cellule stellate) situate nello strato molecolare emergono dalla divisione delle cellule progenitrici nella materia bianca tra le prime postnatale (P)0–P711. Le cellule di granulo sono generate dalla zona germinale esterna (EGz), una zona germinale secondaria che deriva dal labbro rombico rostrale e passa attraverso la divisione terminale dopo la nascita. Ma prima che i loro precursori sorgono dal labbro rombico dell'E13-E16, le cellule sono già migrati sontuosamente lungo la superficie del pia per creare un sottile strato di cellule sulla superficie dorsale dell'anlage del cervelletto. Le cellule macrogliali non neuronali come gli astrociti e gli oligodendrociti, che provengono dal neuroepitelio ventricolare, nascono rispettivamente a E13.5 e P0-P7rispettivamente 11,12,13,14 ,15. Le microglia sono derivate da cellule progenitrici mieloidi primitive di tuorlo-sac tra E8-E10 e dopo l'invasione nel sistema nervoso centrale possono essere rilevate nel cervello del topo da E916.
Il metodo presentato in questo articolo si basa su quello originariamente sviluppato da Furuya et al. e Tabata et al.17,18, che è stato ottimizzato per la coltura primaria delle cellule Purkinje derivate da Wistar rat cerebella. Ora abbiamo adattato questo metodo e attentamente modificato per studiare la crescita dei neuroni cerebellari del topo19. A differenza del nostro nuovo protocollo, il mezzo di dissezione a freddo è il buffer di lavaggio principale utilizzato durante le fasi di dissezione e dissociazione prima di aggiungere il mezzo di semina nel protocollo furuya17. Questo buffer manca la nutrizione, fattori di crescita, e ormoni (tutti nel mezzo Eagle modificato di Dulbecco:miscela nutriente F-12 [DMEM/F12]) che sono necessari per sostenere la crescita cellulare e la sopravvivenza durante i passaggi di cui sopra. Inoltre, sulla base della nostra vasta esperienza con le colture cerebellari primarie murine, abbiamo usato 500 l di mezzo di coltura in ogni pozzo (invece di 1 mL) e aumentato la concentrazione di tri-iodothyronine a 0,5 ng/mL, che migliora la crescita delle cellule neuronali, in particolari di quelli con un fenotipo della cellula Purkinje, e promuove la crescita dei rami dendritici nella cultura. Il metodo principale descritto in questo articolo può essere ampiamente applicato ad altri piccoli roditori (ad esempio, scoiattoli e criceti) durante lo sviluppo embrionale e può essere utilizzato per studiare la neurogenesi cerebellare e la differenziazione nei vari stadi embrionali, che differiscono tra le specie.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS5 Version 12</td>
			<td>Adobe Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0438</td>
			<td>3 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALB1</td>
			<td>Swant Swiss Antibodies (Polyclonal)</td>
			<td>CB38</td>
			<td>1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALB1</td>
			<td>Swant Swiss Antibodies (Monoclonal)</td>
			<td>300</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>Delasco</td>
			<td>DF-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM-F12)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Circles</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>I5500, I6634, I1882, and I4011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Scissor</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>52134-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallized Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Bright-Line</td>
			<td>3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection Forceps</td>
			<td>Merlan</td>
			<td>624734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattern 5 Tweezer</td>
			<td>Dixon</td>
			<td>291-9454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron (P4)</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVALB</td>
			<td>Swant Swiss Antibodies</td>
			<td>235</td>
			<td>1/1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samll Scissor</td>
			<td>WPI Swiss Scissors, 9cm</td>
			<td>504519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-iodothyronine (T3)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Z2 Imager</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum

L'uso delle colture cellulari primarie è diventato uno dei principali strumenti per studiare il sistema nervoso in vitro. L'obiettivo finale dell'utilizzo di questo sistema di modelli semplificato è quello di fornire un microambiente controllato e mantenere l'alto tasso di sopravvivenza e le caratteristiche naturali delle cellule neuronali e non neuronali dissociate il più possibile in condizioni in vitro. In questo articolo, dimostriamo un metodo per isolare i neuroni primari dal cervelletto del topo in via di sviluppo, collocandoli in un ambiente in vitro, stabilendo la loro crescita e monitorandone la fattibilità e la differenziazione per diverse settimane. Questo metodo è applicabile ai neuroni embrionali dissociati dal cervelletto tra i giorni embrionali 12-18.

Sulla base delle diverse date di nascita dei sottotipi neuronali nel cervelletto, le colture degli embrioni di topo E12-E18 hanno prodotto diversi tipi di cellule. I neuroni di grande proiezione, come i neuroni CN (E9-E12) e i PC (E10-E13), sono emersi all'inizio durante lo sviluppo del cerebellar. Nei topi, le cellule di granulosi e Golgi sorsero tra gli e13 e l'E18 e subirono divisioni terminali fino alla settimana postnatale 4.
Sostituire il vecchio mezzo I con il medio fresco II nei giorni...

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Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Condurre esperimenti in vitro per riflettere le condizioni in vivo nel modo più adeguato possibile non è un compito facile. L'uso delle colture cellulari primarie è un passo importante verso la comprensione della biologia cellulare in un intero organismo. Il protocollo fornito descrive come crescere e coltivare neuroni cerebellari embrionali del topo.

Cultura primaria dei neuroni isolata dal cerbellello del topo embrionale

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

La coltura primaria delle cellule neuronali è un sistema modello ideale per studiare i neuroni dissociati nella coltura in vitro. Il vantaggio di utilizzare questo metodo è essere in grado di mantenere le caratteristiche cellulari delle cellule dissociate, come meccanismi, funzioni e morfologia in condizioni in vitro per alcune settimane il più vicino possibile alle condizioni in vivo. Mettere i coperchi rotondi in una piastra da 24 po 'sotto l'armadio della biosicurezza.Aggiungere 90 microlitri di poli-L-ornitina su ogni slittamento di copertura. Chiudere il cappuccio e posizionare delicatamente la piastra nell'incubatore di 37 gradi per due giorni. Preparare il terreno di coltura e il mezzo di semina e mantenerli a quattro gradi Celsius.Preparare la soluzione di tripina di lavoro in DMEM/F12 e mantenerla a quattro gradi. Posizionare il mezzo di coltura e il mezzo di semina nell'incubatore a 37 gradi. Togliere la piastra da 24 pozzi dall'incubatrice.Lavare il coperchio scivola tre volte con doppia acqua distillata. Lasciare asciugare completamente il coperchio per almeno due ore. Preparare tre piastre di Petri piene di PBS freddo, tre piastre di Petri piene di HBSS freddo e cinque piastre di Petri piene di mezzo di dissezione fredda sul ghiaccio.Asporta le corna uterine e lavatele in PBS freddo tre volte sul ghiaccio. Da qui tutti i passaggi dovrebbero essere eseguiti sul ghiaccio per ridurre al minimo i danni ai tessuti. Dopo l'ultima fase di lavaggio, separare i cuccioli dall'utero in HBSS e trasferirli nel mezzo di dissezione fredda.Nel mezzo di dissezione, decapitare i cuccioli con le forbici. Aprire il calvario dal foramen magnum al bordo inferiore della cavità orbitale. Usando un paio di forcep fini, rimuovere la base del cranio e rimuovere il cranio dal cervello.Rimuovere con cura le meningi del cervelletto partendo dalla superficie laterale del peduncolo cerebellare centrale e dei pons. Tagliare entrambi i peduncoli cerebellari e separare il cervelletto dal resto del cervello. Posizionare immediatamente la cerebella raccolta in un tubo conico sterile da 15 ml riempito con DMEM/F12 sul ghiaccio.Centrifugare il tubo a 1.000 g a quattro gradi per un minuto in DMEM/F12. Ripetere questa procedura tre volte, rimuovendo delicatamente il supernatante con una pipetta e sospendendo il pellet in DMEM/F12 fresco. Aggiungere due millilitri di tripina prerischiata e pipettare delicatamente per mescolarli insieme.Posizionare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi per 12 minuti. Dopo l'incubazione, portare il tubo nell'armadio di sicurezza e aggiungere 10 ml di DMEM/F12 per inattivare la tripina. Centrifugare la miscela a 1.200 g per cinque minuti.Scartare il supernatante e resuspend in mezzo fresco seguito da centrifugazione tre volte. Pre-bagnare una pipetta di plastica sterile con DMEM/F2. Aggiungere 3,5 millilitri di soluzione di lavoro DNAsi allo stesso tubo.Triturare il tessuto con una pipetta più volte fino a quando il fluido raggiunge un colore lattinoso omogeneo. Aggiungere 10 mL di DMEM/F12 freddo alla miscela e procedere alla centrifuga. Centrifugare il campione a 1.200 g a quattro gradi per cinque minuti.Rimuovere con cura il supernatante senza disturbare il pellet. Rimuovere il mezzo di semina dall'incubatore. Aggiungere 500 microlitri di mezzo di semina prebellico e mescolarlo bene utilizzando la pipetta.Contare le cellule usando un emocitometro. Diluire la sospensione cellulare con mezzo di semina a una densità di 500.000 cellule per millilitro. Aggiungere 90 microlitri della miscela ad ogni pozzo al centro del coperchio.Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi per tre o quattro ore. Dopo l'incubazione, aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura prebellico in ogni pozzo. Sostituire la piastra nell'incubatore a 37 gradi.Dopo sette giorni, sostituire il vecchio mezzo con un mezzo di coltura fresco II.Preparare una piastra separata da 24 porri con la corrispondente organizzazione numerica e aggiungere 100 microlitri di PFA 4% a ciascun pozzo. Dopo i giorni desiderati in coltura, rimuovere delicatamente i coperchi dai pozzi della piastra di coltura originale e posizionarli nei pozzi corrispondenti della piastra PFA descritti nel passaggio precedente. Aggiungere PFA ai pozzali per immergere completamente i coperchi.Mantenere la piastra PFA a quattro gradi per 30-120 minuti. Dopo l'incubazione, ripristinare la piastra a temperatura ambiente. Lavare il coperchio scivola delicatamente con PBS per cinque minuti tre volte.La figura due del testo mostra la coltura cellulare cerebellare a partire dall'E18. L'immunofluorescenza per la calbindina mostra i neuroni Purkinje con estensioni assonali di tre giorni in vitro. Da sette a 10 giorni in vitro, i processi dendritici sono evidenti.A 21 giorni sono presenti rami dendritici complessi. La figura tre del testo mostra le colture cellulari cerebellari a partire da vari giorni embrionali. il rilevamento dell'immunofluorescenza della calbindina mostra i neuroni Purkinje con assoni precoci solo dopo 18 giorni in vitro.Le culture neuronali purkinje iniziate da E14 ed E15 svilupperanno dendriti, ma mai così complesse come quelle che si sviluppano quando L'E18 è il punto di partenza. La figura quattro del testo mostra che diversi tipi di cellule si sviluppano dalle colture E18 dopo 21 giorni in vitro. L'immunofluorescenza verde calbindina mostra i neuroni purkinje.L'immunofluorescenza rossa per la parvalbumina in B e C mostra internanti inibitori. L'immunofluorescenza rossa per il canale di tensione del sodio in E e F mostra i neuroni granuli. Il presente protocollo è economico e facile da condurre.Alla fine di questo video, sarai in grado di raccogliere e coltura i neuroni cerebellari e risolverli ai DIV desiderati.

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