Name: primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum
Uploaded: 2019-10-26T14:00:00
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Estos estudios fueron apoyados por subvenciones del Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería (HM: NSERC Discovery Grant - RGPIN-2018-06040), y Children Hospital Research Institute of Manitoba (HM: Grant n.o 320035), y la ALS Canada-Brain Canada Arthur J. Hudson Translational Team Grant (JK, HM).

Todos los procedimientos de animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones institucionales y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales Experimentales del Consejo Canadiense para el Cuidado de Animales y ha sido aprobado por las autoridades locales ("el Bannatyne Campus Animal Care Comité"). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número y el sufrimiento de los animales utilizados. La profundidad adecuada de la anestesia se confirmó observando que no hubo ningún cambio en la frecuencia respiratoria ...

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	<li>Giffard, R. G., Ouyang, Y. B., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+primary+neural+cells.">Cell culture: primary neural cells.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 633-637 (2009).</li><li>Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+Cross-Contamination+and+Misidentification+of+278+Widely+Used+Tumor+Cell+Lines.">Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines.</a> PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).</li><li>Lorsch, J. R., Collins, F. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).</li><li>Nelson, K. B., Bauman, M. 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El uso de cultivos primarios es un método bien conocido aplicable a todos los tipos de neuronas17,18,19. En el protocolo presentado, explicamos cómo aislar las neuronas cerebelosas y mantener su viabilidad con una supervivencia óptima in vitro durante un máximo de 3 semanas. El cultivo primario de células cerebelosas, que fueron aisladas en E15-E18, confirma la recolección de tres clases de neuronas grandes: PCs, células ...

Durante varias décadas, las líneas celulares se han utilizado ampliamente como una herramienta de alto rendimiento en estudios preclínicos e investigaciones biológicas. Coste-efectividad, crecimiento rápido, y la reducción del uso de animales vivos son algunos beneficios del uso de estas células. Sin embargo, las alteraciones genéticas y los cambios fenotípicos se acumulan después de varios pasajes in vitro1. La identificación errónea de las líneas celulares y la disparidad genética de las células primarias pueden dar lugar a experimentos irreproducibles y conclusiones falsas2,3,4,5. Por lo tanto, a pesar de algunas similitudes con las células diferenciadas como las neuronas (por ejemplo, neurotransmisores, canales iónicos, receptores y otras proteínas específicas de las neuronas), las líneas celulares neuronales no pueden replicar el fenotipo completo de las neuronas. El uso de neuronas maduras es otra opción; sin embargo, estas células son células postmitoticas no divisorias que son difíciles de propagar en el cultivo. Además, el reingreso en el ciclo celular puede precipitar la apoptosis6.
El cultivo celular tridimensional (3D), los cultivos de rebanadas organotípicas y los cultivos organoides se han desarrollado para proporcionar un entorno en el que las células pueden organizarse en una forma 3D que imita el entorno in vivo. Por lo tanto, la comunicación de célula a célula, la migración, la invasión de células tumorales en los tejidos circundantes, y la angiogénesis se pueden estudiar7. Sin embargo, los costos adicionales de usar proteínas de matriz celular adicional (ECM) o hidrogeles sintéticos como ropa de cama, dificultad en la toma de imágenes y compatibilidad con instrumentos de cribado de alto rendimiento son inconvenientes considerables del cultivo de células 3D. Una desventaja importante del cultivo de rebanadas de tejido organotípico es el uso de un gran número de animales y los efectos adversos de la axotomía, que conduce a la inaccesibilidad de las dianas y factores de crecimiento de los axones, y en consecuencia la muerte neuronal8.
Por lo tanto, un enfoque alternativo, que evita los problemas con las líneas celulares, la dificultad del crecimiento de las células maduras y la complejidad de los tejidos, es la maduración in vitro de células primarias inmaduras. Las células primarias se derivan directamente del tejido humano o animal y se disocian utilizando métodos enzimáticos y/o mecánicos9. Los principios principales de aislamiento, sembrado y mantenimiento en el medio de cultivo son similares independientemente de la fuente de tejido. Sin embargo, los factores tróficos necesarios para promover la proliferación y la maduración son altamente específicos de las células6.
Conocer la "fecha de nacimiento" de cada tipo de célula cerebelosa es un requisito previo para diseñar un experimento de cultivo primario. En general, las células purkinje (PC) y las neuronas de los núcleos cerebelosos (CN), nacen antes que las células más pequeñas, incluidas las interneuronas (por ejemplo, cesta, células estelares) y las células del gránulo. En ratones, los PC emergen entre el día embrionario (E)10–E13, mientras que las neuronas CN aproximadamente E9–E1210.
Otras neuronas cerebelosas nacen mucho más tarde. Por ejemplo, en ratones, la subpoblación Golgi de interneuronas se genera a partir de VZ a (E14-E18) y las interneuronas restantes (célulade cesta y células estelares) ubicadas en la capa molecular emergen de células progenitoras divisorias en la materia blanca entre los primeros postnatal (P)0–P711. Las células de gránulos se generan a partir de la zona germinal externa (EGZ), una zona germinal secundaria que se deriva del labio rombio rostral y pasa por la división terminal después del nacimiento. Pero antes de que sus precursores surjan del labio rombio de E13-E16, las células ya han migrado rostrally a lo largo de la superficie pia para hacer una capa delgada de células en la superficie dorsal del anlage de cerebelo. Las células macrogliales no neuronales como los astrocitos y los oligodendrocitos, que se originan en el neuroepitelio ventricular, nacen en E13.5-P0 y P0-P7 respectivamente11,12,13,14 ,15. Microglia se derivan de las células mieloides mieloides primitivas de yema-sac entre E8–E10 y después de la invasión en el sistema nervioso central se pueden detectar en el cerebro del ratón por E916.
El método presentado en este artículo se basa en el desarrollado originalmente por Furuya et al. y Tabata et al.17,18, que fue optimizado para el cultivo primario de células Purkinje derivadas de Wistar rat cerebella. Ahora hemos adaptado este método y lo hemos modificado cuidadosamente para estudiar el crecimiento de las neuronas cerebelosas de ratón19. A diferencia de nuestro nuevo protocolo, el medio de disección en frío es el principal tampón de lavado utilizado durante los pasos de disección y disociación antes de añadir el medio de sembrado en el protocolo17de Furuya. Este tampón carece de la nutrición, los factores de crecimiento y las hormonas (todo en el medio Eagle modificado de Dulbecco:mezcla de nutrientes F-12 [DMEM/F12]) que son necesarios para apoyar el crecimiento celular y la supervivencia durante los pasos antes mencionados. Además, sobre la base de nuestra amplia experiencia con cultivos cebelosos primarios murinos, hemos utilizado 500 s de medio de cultivo en cada pozo (en lugar de 1 mL) y aumentado la concentración de tri-yodotironina a 0,5 ng/ml, lo que mejora el crecimiento de las células neuronales, en particular aquellos con un fenotipo celular Purkinje, y promueve el crecimiento de las ramas dendríticas en el cultivo. El método principal que aparece en este artículo se puede aplicar ampliamente a otros pequeños roedores (por ejemplo, ardillas y hámsters) durante el desarrollo embrionario y puede utilizarse para estudiar la neurogénesis cerebelosa y la diferenciación en las diversas etapas embrionarias, que difieren entre especies.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS5 Version 12</td>
			<td>Adobe Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0438</td>
			<td>3 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALB1</td>
			<td>Swant Swiss Antibodies (Polyclonal)</td>
			<td>CB38</td>
			<td>1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALB1</td>
			<td>Swant Swiss Antibodies (Monoclonal)</td>
			<td>300</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>Delasco</td>
			<td>DF-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM-F12)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Circles</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>I5500, I6634, I1882, and I4011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Scissor</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>52134-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallized Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Bright-Line</td>
			<td>3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection Forceps</td>
			<td>Merlan</td>
			<td>624734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattern 5 Tweezer</td>
			<td>Dixon</td>
			<td>291-9454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron (P4)</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVALB</td>
			<td>Swant Swiss Antibodies</td>
			<td>235</td>
			<td>1/1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samll Scissor</td>
			<td>WPI Swiss Scissors, 9cm</td>
			<td>504519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-iodothyronine (T3)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Z2 Imager</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum

El uso de cultivos celulares primarios se ha convertido en una de las principales herramientas para estudiar el sistema nervioso in vitro. El objetivo final del uso de este sistema de modelos simplificado es proporcionar un microambiente controlado y mantener la alta tasa de supervivencia y las características naturales de las células neuronales y no neuronales disociadas tanto como sea posible en condiciones in vitro. En este artículo, demostramos un método de aislar las neuronas primarias del cerebelo del ratón en desarrollo, colocándolas en un entorno in vitro, estableciendo su crecimiento y monitoreando su viabilidad y diferenciación durante varias semanas. Este método es aplicable a las neuronas embrionarias disociadas del cerebelo entre los días embrionarios 12-18.

Basados en las diferentes fechas de nacimiento de los subtipos neuronales en el cerebelo, los cultivos de embriones de ratón E12-E18 produjeron diferentes tipos de células. Las neuronas de proyección grandes, como las neuronas CN (E9-E12) y los PC (E10-E13), surgieron temprano durante el desarrollo cerebeloso. En ratones, las células de gránulos y Golgi surgieron entre el E13-E18 y se sometieron a divisiones terminales hasta la semana postnatal 4.
La sustitución del medio viejo I por el ...

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Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

Realizar experimentos in vitro para reflejar las condiciones in vivo lo más adecuadamente posible no es una tarea fácil. El uso de cultivos celulares primarios es un paso importante hacia la comprensión de la biología celular en todo un organismo. El protocolo proporcionado describe cómo crecer y cultivar con éxito las neuronas cerebelosas de ratón embrionarios.

Cultivo primario de neuronas aisladas del cerebelo del ratón embrionario

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

El cultivo celular neuronal primario es un sistema modelo ideal para estudiar las neuronas disociadas en cultivo in vitro. La ventaja de usar este método es ser capaz de mantener las características celulares de las células disociadas, tales como mecanismos, funciones y condiciones in vitro de morfología durante unas semanas lo más cerca posible de la condición in vivo. Coloque los resbalones de la cubierta redonda en una placa de 24 pozos debajo del gabinete de bioseguridad.Agregue 90 microlitros de poli-L-ornitina en cada resbalón de cubierta. Cierre la tapa y coloque suavemente la placa en la incubadora de 37 grados durante dos días. Preparar el medio de cultivo y el medio de siembra y mantenerlos a cuatro grados centígrados.Prepare la solución de trippsina de trabajo en DMEM/F12 y manténgala en cuatro grados. Coloque el medio de cultivo y el medio de siembra en la incubadora a 37 grados. Saque la placa de 24 pozos de la incubadora.Lave los resbalones de la cubierta tres veces con agua doble destilada. Deje los resbalones de la cubierta durante al menos dos horas para secar por completo. Prepare tres platos Petri llenos de PBS frío, tres platos Petri llenos de HBSS frío y cinco platos Petri llenos de medio de disección fría sobre hielo.Exélute los cuernos uterinos y lávelos en PBS frío tres veces sobre hielo. A partir de aquí todos los pasos deben llevarse a cabo sobre hielo para minimizar el daño tisular. Después del último paso de lavado, separe a los cachorros del útero en HBSS y transfieralos al medio de disección en frío.En el medio de disección, decapitar a los cachorros con tijeras. Abra el calvario desde el foramen magnum hasta el borde inferior de la cavidad orbital. Usando un par de fórceps finos, retire la base del cráneo y pele el cráneo del cerebro.Retirar cuidadosamente las meninges del cerebelo a partir de la superficie lateral del pedúnculo y pons cerebeloso medio. Corta ambos pedúnculos cerebelosos y separa el cerebelo del resto del cerebro. Coloque inmediatamente la cerebella recogida en un tubo cónico estéril de 15 ml lleno de DMEM/F12 sobre hielo.Centrifugar el tubo a 1.000 g a cuatro grados durante un minuto en DMEM/F12. Repita esto tres veces, retirando cada vez suavemente el sobrenadante con una pipeta y re-suspendiendo el pellet en DMEM/F12 fresco. Agregue dos mililitros de trippsina precaleada y pipetee suavemente para mezclarlos.Coloque el tubo en un baño de agua de 37 grados durante 12 minutos. Después de la incubación, lleve el tubo al armario de seguridad y agregue 10 ml de DMEM/F12 para inactivar la tripina. Centrifugar la mezcla a 1.200 g durante cinco minutos.Desechar el sobrenadante y resuspend en medio fresco seguido de centrifugación tres veces. Pre-mojar una pipeta de plástico estéril con DMEM/F2. Añadir 3,5 mililitros de solución de trabajo DNAse al mismo tubo.Triturar el tejido con una pipeta varias veces hasta que el líquido alcance un color lechoso homogéneo. Añadir 10 ml de DMEM/F12 frío a la mezcla y proceder a la centrífuga. Centrifugar la muestra a 1.200 g a cuatro grados durante cinco minutos.Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet. Retire el medio de siembra de la incubadora. Agregue 500 microlitros de medio de siembra precalentado y mezcle bien con la pipeta.Cuente las células usando un hemocicómetro. Diluir la suspensión celular con un medio de siembra a una densidad de 500.000 células por mililitro. Añadir 90 microlitros de la mezcla a cada pozo en el centro del cubreobjetos.Coloque la placa en la incubadora a 37 grados durante tres a cuatro horas. Después de la incubación, añadir 500 microlitros de medio de cultivo precalentado en cada pocód en cada pocód en. Sustituya la placa en la incubadora a 37 grados.Después de siete días, sustituya el antiguo medio por medio de cultivo fresco II.Prepare una placa separada de 24 pozos con la organización numérica correspondiente y agregue 100 microlitros de PFA 4% a cada pozo. Después de los días deseados en el cultivo, retire suavemente los resbalones de la cubierta de los pozos de la placa de cultivo original y colóquelos en los pozos correspondientes de la placa PFA descrita en el paso anterior. Añadir PFA a los pozos para sumergir completamente los resbalones de la cubierta.Mantenga la placa PFA a cuatro grados durante 30 a 120 minutos. Después de la incubación, restaure la placa a temperatura ambiente. Lave suavemente los resbalones de la cubierta con PBS durante cinco minutos tres veces.La figura dos del texto muestra el cultivo de células cerebelosas a partir de E18. La inmunofluorescencia para la calbinadina muestra las neuronas de Purkinje con extensiones axonales por tres días in vitro. Por siete a 10 días in vitro, los procesos dendríticos son evidentes.A los 21 días, las ramas dendríticas complejas están presentes. La figura tres del texto muestra cultivos celulares cerebelosos a partir de varios días embrionarios. la detección de inmunofluorescencia de la calbinada muestra las neuronas purkinje con axones tempranos sólo después de 18 días in vitro.Los cultivos de neurona purkinje comenzaron en E14 y E15 desarrollarán dendritas, pero nunca tan complejas como las que se desarrollan cuando E18 es el punto de partida. La figura cuatro del texto muestra que diferentes tipos de células se desarrollan a partir de cultivos E18 después de 21 días in vitro. La inmunofluorescencia verde de Calbindin muestra las neuronas Purkinje.La inmunofluorescencia roja para la parvalbumina en B y C muestra interneurones inhibitorios. La inmunofluorescencia roja para el canal cerrado por voltaje de sodio en E y F muestra las neuronas de gránulos. El presente protocolo es rentable y fácil de llevar a cabo.Al final de este video, usted será capaz de recoger y cultivar neuronas cerebelosas y arreglarlos en los DIVs deseados.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

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