Name: primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum
Uploaded: 2019-10-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum at JoVE.com

Bu çalışmalar, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (HM: NSERC Discovery Grant # RGPIN-2018-06040) ve Manitoba Çocuk Hastanesi Araştırma Enstitüsü (HM: Grant # 320035) ve ALS Canada-Brain Canada Arthur J.'den gelen hibelerle desteklenmiştir. Hudson Çeviri Takım Grant (JK, HM).

Tüm hayvan prosedürleri kurumsal düzenlemelere ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'nden Deneysel Hayvanların Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirildi ve yerel makamlar tarafından onaylandı ("Bannatyne Kampüsü Hayvan Bakımı Komite"). Kullanılan hayvanların sayısını ve acılarını en aza indirmek için tüm çabalar sarf edildi. Yeterli anestezi derinliği manipülasyon ve ayak ucutu veya kornea refleksi ile ilişkili solunum hızında bir değişiklik olmadığı gözlemlenerek do...

<ol>
	<li>Giffard, R. G., Ouyang, Y. B., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+primary+neural+cells.">Cell culture: primary neural cells.</a> Encyclopedia of Neuroscience. , 633-637 (2009).</li><li>Huang, Y., Liu, Y., Zheng, C., Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+Cross-Contamination+and+Misidentification+of+278+Widely+Used+Tumor+Cell+Lines.">Investigation of Cross-Contamination and Misidentification of 278 Widely Used Tumor Cell Lines.</a> PLoS One. 12 (1), 0170384 (2017).</li><li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixing+problems+with+cell+lines.">Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346 (6216), 1452-1453 (2014).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Capes-Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Check+your+cultures!+A+list+of+cross-contaminated+or+misidentified+cell+lines.">Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines.</a> International Journal of Cancer. 127 (1), 1-8 (2010).</li><li>Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell+cycle:+the+neuron+itself+and+its+circumstances.">Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances.</a> Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).</li><li>Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+a+breakthrough+in+vivo.">Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 5517-5527 (2015).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Voloboueva, L., Sun, X., Ouyang, Y. B., Giffard, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+primary+neural+cells.">Cell culture: primary neural cells.</a> Reference Module in Neuroscience and Biobehavioral Psychology. , (2017).</li><li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum.">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 450 (2014).</li><li>Sudarov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascl1+genetics+reveals+insights+into+cerebellum+local+circuit+assembly.">Ascl1 genetics reveals insights into cerebellum local circuit assembly.</a> Journal of Neuroscience. 31 (30), 11055-11069 (2011).</li><li>Rahimi-Balaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrin+II+Is+Ectopically+Expressed+in+Microglia+in+the+Cerebellum+of+Neurogenin+2+Null+Mice.">Zebrin II Is Ectopically Expressed in Microglia in the Cerebellum of Neurogenin 2 Null Mice.</a> Cerebellum. 18 (1), 56-66 (2019).</li><li>Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+Migration+During+Development+of+the+Cerebellum.">Neuronal Migration During Development of the Cerebellum.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 484 (2018).</li><li>Buffo, A., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin,+lineage+and+function+of+cerebellar+glia.">Origin, lineage and function of cerebellar glia.</a> Progress in Neurobiology. 109, 42-63 (2013).</li><li>Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Precursor+Cells+from+the+Rhombic+Lip+Are+Specified+to+a+Cerebellar+Granule+Neuron+Identity.">Embryonic Precursor Cells from the Rhombic Lip Are Specified to a Cerebellar Granule Neuron Identity.</a> Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).</li><li>Reemst, K., Noctor, S. C., Lucassen, P. J., Hol, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Indispensable+Roles+of+Microglia+and+Astrocytes+during+Brain+Development.">The Indispensable Roles of Microglia and Astrocytes during Brain Development.</a> Frontiers in Human Neuroscience. 10, 566 (2016).</li><li>Furuya, S., Makino, A., Hirabayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+culturing+cerebellar+Purkinje+cells+with+differentiated+dendrites+under+a+mixed+monolayer+setting.+Brain+research.">An improved method for culturing cerebellar Purkinje cells with differentiated dendrites under a mixed monolayer setting. Brain research.</a> Brain Research Protocols. 3 (2), 192-198 (1998).</li><li>Tabata, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+method+for+culture+of+dissociated+mouse+cerebellar+cells+enriched+for+Purkinje+neurons.">A reliable method for culture of dissociated mouse cerebellar cells enriched for Purkinje neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 104 (1), 45-53 (2000).</li><li>Marzban, H., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+promotes+the+development+of+deep+cerebellar+nuclear+neurons+in+dissociated+mouse+cerebellar+cultures.">Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures.</a> Brain Research. 1141, 25-36 (2007).</li><li>Schaller, K. L., Caldwell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+distribution+of+voltage-gated+sodium+channels+in+the+cerebellum.">Expression and distribution of voltage-gated sodium channels in the cerebellum.</a> Cerebellum. 2 (1), 2-9 (2003).</li><li>Alder, J., Cho, N. K., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+precursor+cells+from+the+rhombic+lip+are+specified+to+a+cerebellar+granule+neuron+identity.">Embryonic precursor cells from the rhombic lip are specified to a cerebellar granule neuron identity.</a> Neuron. 17 (3), 389-399 (1996).</li><li>van der Valk, J., Gstraunthaler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Bovine+Serum+(FBS)+-+A+pain+in+the+dish.">Fetal Bovine Serum (FBS) - A pain in the dish.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 45 (6), 329-332 (2017).</li><li>Froud, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development,+benefits+and+disadvantages+of+serum-free+media.">The development, benefits and disadvantages of serum-free media.</a> Developments in Biological Standardization. 99, 157-166 (1999).</li><li>Kwist, K., Bridges, W. C., Burg, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cell+passage+number+on+osteogenic+and+adipogenic+characteristics+of+D1+cells.">The effect of cell passage number on osteogenic and adipogenic characteristics of D1 cells.</a> Cytotechnology. 68 (4), 1661-1667 (2016).</li><li>Uysal, O., SevimLi, T., SevimLi, M., Gunes, S., Eker Sariboyaci, A., Barh, D., Azevedo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+tissue+culture:+the+base+of+biotechnology.">Cell and tissue culture: the base of biotechnology.</a> Omics Technologies and Bio-Engineering. , 391-429 (2018).</li><li>Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+hippocampal+neurons+from+prenatal+mice.">Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3634 (2012).</li><li>Nelson, K. B., Bauman, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thimerosal+and+autism.">Thimerosal and autism.</a> Pediatrics. 111 (3), 674-679 (2003).</li><li>Marzban, H., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+promotes+the+development+of+deep+cerebellar+nuclear+neurons+in+dissociated+mouse+cerebellar+cultures.">Fibroblast growth factor promotes the development of deep cerebellar nuclear neurons in dissociated mouse cerebellar cultures.</a> Brain Research. 1141, 25-36 (2007).</li></ol>

Birincil kültürlerin kullanımı nöronların her türlü için geçerli iyi bilinen bir yöntemdir17,18,19. Sunulan protokolde, serebellar nöronların nasıl izole edilebildiğini ve en fazla 3 hafta boyunca optimum in vitro sağkalımla canlılıklarını nasıl koruyacağımızı açıklıyoruz. E15−E18'de izole edilen serebellar hücrelerinin birincil kültürü, büyük nöronların üç sınıfının toplanmasını do...

Birkaç on yıl için, hücre hatları yaygın preklinik çalışmalar ve biyolojik araştırmalarda yüksek iş aracı olarak kullanılmaktadır. Maliyet etkinliği, hızlı büyüme ve canlı hayvan kullanımının azaltılması bu hücreleri kullanarak bazı faydaları vardır. Ancak, genetik değişiklikler ve fenotipik değişiklikler in vitro1birkaç pasajlar sonra birikir. Hücre hatlarının yanlış tanımlanması ve birincil hücrelerden genetik farklılık geri dönüşü olmayan deneylere ve yanlışsonuçlarayol açabilir 2,3,4,5. Bu nedenle, nöronlar gibi farklılaşmış hücrelere bazı benzerlikler rağmen (örneğin, nörotransmitter, iyon kanalları, reseptörler, ve diğer nöron özgü proteinler), nöronal hücre hatları nöronların tam fenotip çoğaltmak olamaz. Olgun nöronlar kullanarak başka bir seçenektir; ancak, bu hücreler kültürde yaymak zor olan bölünemeyen postmitotik hücrelerdir. Ayrıca hücre döngüsüne yeniden giriş apoptoz6'yaneden olabilir.
Üç boyutlu (3D) hücre kültürü, organotipik dilim kültürleri ve organoid kültürler, hücrelerin in vivo ayarı taklit eden bir 3D forma düzenleyebileceği bir ortam sağlamak için geliştirilmiştir. Böylece hücre-hücre iletişimi, göç, tümör hücrelerinin çevre dokulara invazyonu ve anjiyogenez7incelenebilir. Ancak, ekstra hücresel matriks (ECM) proteinleri veya sentetik hidrojelleri yatak olarak kullanmanın ek maliyetleri, görüntülemede zorluk ve yüksek iş yapma lı tarama aletleriyle uyumluluk 3D hücre culturing önemli dezavantajları vardır. Organotipik doku dilimi kültürünün önemli bir dezavantajı hayvanların çok sayıda kullanımı ve aksitomi yan etkileri, hangi hedeflerve aksonlar için büyüme faktörlerinin erişilemezliği yol açar, ve sonuç olarak nöronal ölüm8.
Bu nedenle, hücre hatları ile ilgili sorunları önler alternatif bir yaklaşım, olgun hücrelerin büyüyen zorluk, ve dokuların karmaşıklığı, olgunlaşmamış primer hücrelerin in vitro olgunlaşma olduğunu. Birincil hücreler doğrudan insan veya hayvan dokusundan türetilir ve enzimatik ve/veya mekanik yöntemlerle ayrıştırılır9. Kültür ortamında izolasyon, tohumlama ve bakım temel ilkeleri doku kaynağı ne olursa olsun benzerdir. Ancak, proliferasyon ve olgunlaşmayı teşvik etmek için gerekli trofik faktörler yüksek hücre spesifik6.
Her serebellar hücre tipinin 'doğum tarihini' bilmek bir birincil kültür deneyi tasarlamak için bir ön koşuldur. Genel olarak, Purkinje hücreleri (PCs) ve serebellar çekirdeklerin nöronlar (CN), internöronlar da dahil olmak üzere küçük hücreler, önce doğarlar (örneğin, sepet, stellat hücreleri) ve granül hücreler. Farelerde, bilgisayarlar embriyonik gün (E)10-E13 arasında ortaya çıkarken, CN nöronlar yaklaşık E9-E1210.
Diğer serebellar nöronlar çok daha sonra doğarlar. Örneğin, farelerde, internöronların Golgi alt popülasyonu VZ'den (~E14−E18) üretilir ve moleküler tabakada bulunan kalan internöronlar (sepet hücresi ve yıldız hücreleri) beyaz maddedeki progenitor hücrelerinin erken ile beyaz maddeye bölünmesinden ortaya çıkar. doğum sonrası (P)0–P711. Granül hücreler dış germinal zon (EGZ), rostral rhombic dudak türetilen ve doğumdan sonra terminal bölümü geçer ikincil bir germinal zon üretilir. Ancak öncülleri E13-E16'dan gelen eşkenar dörtgen dudaktan doğmadan önce, hücreler serebel ange'nin dorsal yüzeyinde ince bir hücre tabakası yapmak için pia yüzeyi boyunca rostrally göç etmişler. Ventriküler nöroepitelkökenli astrositler ve oligodendrositler gibi nöronal olmayan makroglial hücreler sırasıyla E13.5−P0 ve P0−P7'de doğarlar11,12,13,14 ,15. Mikroglia e8-E10 arasında yolk-kese ilkel miyeloid atahücreleri türetilmiştir ve merkezi sinir sistemine invazu sonrası E916ile fare beyninde tespit edilebilir .
Bu makalede sunulan yöntem aslında Furuya ve ark. ve Tabata ve ark.17,18tarafından geliştirilen bir dayanmaktadır , Wistar sıçan cerebella türetilen Purkinje hücrelerinin birincil culturing için optimize edildi. Şimdi bu yöntemi adapte ve dikkatle fare serebellar nöronların büyümesini incelemek için modifiye19. Yeni protokolümüzden farklı olarak, soğuk diseksiyon ortamı Furuya protokolü17'yetohumlama ortamı eklemeden önce diseksiyon ve dissosilasyon basamaklarında kullanılan ana yıkama tamponudur. Bu tampon beslenme yoksun, büyüme faktörleri, ve hormonlar (Dulbecco değiştirilmiş Eagle orta tüm: besin karışımı F-12 [DMEM/F12]) bu yukarıda belirtilen adımlar sırasında hücre büyümesini ve sağkalım desteklemek için gerekli olan. Buna ek olarak, murine primer serebellar kültürleri ile ilgili geniş deneyimimize dayanarak, her kuyuda (1 mL yerine) 500 μL kültür ortamı kullandık ve nöronal hücrelerin büyümesini iyileştiren tri-iyototironin konsantrasyonunu 0,5 ng/mL'ye çıkardık. özellikle purkinje hücre fenotip olanlar, ve kültürde dendritik dalların büyümesini teşvik. Bu makalede yer alan temel yöntem, embriyonik gelişim sırasında diğer küçük kemirgenlere (örneğin, sincaplar ve hamsterlar) yaygın olarak uygulanabilir ve çeşitli embriyonik evrelerde serebellar nörogenezve farklılaşmayı incelemek için kullanılabilir, türler arasında farklılık gösterir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop CS5 Version 12</td>
			<td>Adobe Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel (SCN)PN4 (Nav1.6)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0438</td>
			<td>3 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A3608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALB1</td>
			<td>Swant Swiss Antibodies (Polyclonal)</td>
			<td>CB38</td>
			<td>1/5000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CALB1</td>
			<td>Swant Swiss Antibodies (Monoclonal)</td>
			<td>300</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside or Cytosine Arabinoside (Ara-C)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>Delasco</td>
			<td>DF-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM-F12)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Circles</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>12-545-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>I5500, I6634, I1882, and I4011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Scissor</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>52134-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallized Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Bright-Line</td>
			<td>3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissection Forceps</td>
			<td>Merlan</td>
			<td>624734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pattern 5 Tweezer</td>
			<td>Dixon</td>
			<td>291-9454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron (P4)</td>
			<td>Millipore sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVALB</td>
			<td>Swant Swiss Antibodies</td>
			<td>235</td>
			<td>1/1500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samll Scissor</td>
			<td>WPI Swiss Scissors, 9cm</td>
			<td>504519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-iodothyronine (T3)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Z2 Imager</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum

Birincil hücre kültürlerinin kullanımı in vitro sinir sistemini incelemek için önemli araçlardan biri haline gelmiştir. Bu basitleştirilmiş model sistemini kullanmanın nihai amacı kontrollü bir mikroçevre sağlamak ve yüksek sağkalım oranını ve ayrıştırılmış nöronal ve nöronal olmayan hücrelerin doğal özelliklerini in vitro koşullarda mümkün olduğunca korumaktır. Bu makalede, gelişmekte olan fare beyincik birincil nöronlar izole bir yöntem göstermek, bir in vitro ortamda yerleştirerek, onların büyüme kurulması, ve birkaç hafta için canlılık ve farklılaşma izleme. Bu yöntem 12-18 yılları arasında serebellumdan ayrıştırılan embriyonik nöronlar için geçerlidir.

Beyincikteki nöronal alt tiplerin farklı doğum tarihlerine göre, E12−E18 fare embriyolarının kültürleri farklı hücre tipleri ortaya çıkarmıştır. CN nöronlar (E9−E12) ve PCs (E10−E13) gibi büyük projeksiyon nöronlar serebeller gelişim sırasında erken ortaya çıkmıştır. Farelerde granül ve Golgi hücreleri ~E13-E18 arasında ortaya çıktı ve doğum sonrası 4.
Eski orta I'yi taze kültür ortamı II ile değiştirmek, in vitro (DIV) 7 günlerinde glial hücre ?...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum at JoVE.com

Primary Culture of Neurons Isolated from Embryonic Mouse Cerebellum

In vitro deneylerin vivo koşullarını mümkün olduğunca yeterli şekilde yansıtmak için yapılması kolay bir iş değildir. Birincil hücre kültürlerinin kullanımı bütün bir organizmada hücre biyolojisini anlamaya yönelik önemli bir adımdır. Sağlanan protokol nasıl başarılı bir şekilde büyümek ve kültür embriyonik fare serebellar nöronlar özetliyor.

Embriyonik Fare Beyincisinden İzole Edilen Nöronların Birincil Kültürü

The use of primary cell cultures has become one of the major tools to study the nervous system in vitro. The ultimate goal of using this simplified model ...

Birincil nöronal hücre kültürü, in vitro kültürde ayrıştırılmış nöronları incelemek için ideal bir model sistemdir. Bu yöntemi kullanmanın avantajı, devre dışı kalan hücrelerin mekanizmalar, fonksiyonlar ve morfoloji in vitro koşullarda hücresel özelliklerini in vivo duruma mümkün olduğunca yakın birkaç hafta süreyle koruyabilmektir. Yuvarlak kapak fişlerini biyogüvenlik dolabının altına 24 kuyuluk bir plakaya koyun.Her kapak fişinin üzerine 90 mikrolitre poli-L-ornit ekleyin. Kapağı kapatın ve plakayı yavaşça 37 derecelik kuvöze iki gün yerleştirin. Kültür orta ve tohumlama orta hazırlayın ve dört santigrat derece onları tutmak.Çalışma trippsin çözeltisini DMEM/F12'de hazırlayın ve dört derecede tutun. 37 derece kuvözde kültür orta ve tohumlama ortamı yerleştirin. 24 kuyulu tabağı kuvözden çıkar.Kapak fişlerini üç kez çift distile su ile yıkayın. Tamamen kuruması için kapak fişleri en az iki saat bekletin. Soğuk PBS ile dolu üç Petri yemeği, soğuk HBSS ile dolu üç Petri yemeği ve buz üzerinde soğuk diseksiyon ortamıyla dolu beş Petri yemeği hazırlayın.Rahim boynuzları excise ve soğuk PBS üç kez buz üzerinde yıkayın. Buradan doku hasarını en aza indirmek için buz üzerinde tüm adımlar yapılmalıdır. Son yıkama adımından sonra, yavruları HBSS'de rahimden ayırın ve soğuk diseksiyon ortamına aktarın.Diseksiyon ortamda, makas ile yavru lar decapitate. Foramen magnumdan orbital boşluğun alt sınırına kadar kalvarium açın. İnce bir çift forceps kullanarak, kafatası tabanını çıkarın ve beyinden kafatası soyma.Dikkatle orta serebellar peduncle ve pons lateral yüzeyinden başlayarak beyincik menenjleri çıkarın. Hem serebellar peduncles kes ve beynin geri kalanından beyincik ayırın. Toplanan seremoniyi hemen dMEM/F12 ile dolu steril 15 mL konik bir tüpe buz üzerine yerleştirin.Tüpü DMEM/F12'de bir dakika boyunca dört derecede 1,000 g'da santrifüj edin. Bunu üç kez tekrarlayın, her seferinde bir pipetle süpernatantı hafifçe çıkararak ve taze DMEM/F12 peletini yeniden askıya alarak. Önceden ısıtılmış tripsin iki mililitre ekleyin ve yavaşça onları karıştırmak için pipet.12 dakika boyunca 37 derece su banyosu tüp yerleştirin. Kuluçkadan sonra tüpü emniyet kabine getirin ve trypsin inaktive edilmesi için 10 mL DMEM/F12 ekleyin. Karışımı 1, 200 gr'da beş dakika santrifüj edin.Supernatant atın ve taze ortamda resuspend üç kez santrifüj ardından. DMEM/F2'li steril plastik pipet önceden ıslandı. Aynı tüpe 3,5 mililitre NAAse çalışma çözeltisi ekleyin.Sıvı homojen sütlü bir renge erişene kadar dokuyu bir pipetle birkaç kez triturate. Karışıma 10 mL soğuk DMEM/F12 ekleyin ve santrifüje doğru ilerleyin. Numuneyi 1, 200 g'da dört derecede beş dakika santrifüj edin.Peleti bozmadan supernatant'ı dikkatlice çıkarın. Tohumlama ortamını kuluçka makinesinden çıkarın. Önceden ısıtılmış tohumlama ortamı nın 500 mikrolitresini ekleyin ve pipetkullanarak iyice karıştırın.Hemositometre kullanarak hücreleri say. Mililitre başına 500, 000 hücre yoğunluğuna tohumlama orta ile hücre süspansiyon seyreltin. Coverslip merkezinde her kuyuya karışımın 90 mikrolitre ekleyin.Tabağı 37 derecede 3-4 saat kuvöze yerleştirin. Kuluçkadan sonra, her kuyuya 500 mikrolitre önceden ısınmış kültür ortamı ekleyin. Plakayı 37 derecede kuvöze yerleştirin.Yedi gün sonra, taze kültür orta II.Prepare ilgili sayısal organizasyon ile ayrı bir 24-well plaka ile eski orta değiştirin ve PFA% 4 her kuyuya 100 mikrolitre ekleyin. Kültürde istenilen günlerden sonra, kapak fişlerini orijinal kültür plakasının kuyularından hafifçe çıkarın ve bir önceki adımda açıklanan PfA plakasının ilgili kuyularına yerleştirin. Kapak fişlerini tamamen batırmak için kuyulara PFA ekleyin.PfA plakasını 30 ila 120 dakika boyunca dört derecede tutun. Kuluçkadan sonra, oda sıcaklığına plaka geri. Kapağı pbs ile hafifçe beş dakika üç kez yıkayın.Metindeki ikinci şekil E18'den başlayan serebellar hücre kültürünü göstermektedir. Calbindin için immünofloresans üç gün in vitro aksonal uzantıları ile Purkinje nöronlar gösterir. Yedi ila 10 gün in vitro olarak, dendritik süreçler belirgindir.21 günde kompleks dendritik dallar mevcuttur. Metindeki şekil 3 çeşitli embriyonik günlerde başlayan serebellar hücre kültürlerini göstermektedir. calbindin immünofloresan saptama sadece 18 gün in vitro sonra erken aksonları ile Purkinje nöronlar gösterir.Purkinje nöron kültürleri E14 başladı ve E15 dendritler gelişecektir, ama E18 başlangıç noktası olduğunda geliştirmek gibi karmaşık asla. Metindeki şekil 4, 21 gün in vitro sonra E18 kültürlerden farklı hücre tiplerinin geliştiğini göstermektedir. Calbindin yeşil immünofluorescence Purkinje nöronlar gösterir.B ve C parvalbumin için kırmızı immünofloresans inhibitör internöronlar göstermektedir. E ve F'de sodyum voltaj lı kanal için kırmızı immünoresans granül nöronları gösterir. Mevcut protokol uygun maliyetli dir ve yürütülmesi kolaydır.Bu videonun sonunda, serebellar nöronlar toplamak ve kültür ve istenilen DIVs onları düzeltmek mümkün olacak.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Neuroscience

Unit 1

Anatomy of the Central and Peripheral Nervous System

SCIENTISTS IN ACTION

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Fare Embriyonik motor nöronlar lektin tabanlı İzolasyon ve Kültür

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

İlköğretim Rat Kortikal Nöronlar ve Glia bilaminar Co-kültür

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Bir<em&gt; In-vitro</emYetişkin Mouse myenterik Pleksus izole edilen enterik Nöronlar ve Glia bir&gt; hazırlanması

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Fare dopaminerjik nöronlar İlköğretim Kültür

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

E14-E16 Sprague Dawley Sıçan Embriyosu İzole Karışık Primer Hipokampal ve Kortikal Nöronlardan Nörosfer Lerin Üretimi

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...