Name: isolation of exosome-enriched extracellular vesicles carrying granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from embryonic stem cells
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells at JoVE.com

ونحن ممتنون للسيد Arkadiusz Slusarczyk وكنتاكي شبكة البنية التحتية للبحوث الطبية الحيوية (KBRIN، P20GM103436) للحصول على انتقال صور المجهر الإلكتروني. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال المنح المقدمة من NIH AA018016-01 (J.W.E.) والصندوق الاستئماني لتحدي أبحاث كومنولث كنتاكي (J.W.E.) وNIS CA106599 وCA175003 (C.L.) وNIS CA198249 (K.Y.) ومنحة أبحاث التنفس المجانية (K.Y.).

1. زراعة خلايا ES-D3
<ol><li>لتوليد مصل بقري جنيني خال من الاكسوسوم (FBS)، قم بتحميل FBS في جهاز طرد مركزي فائق والطرد المركزي عند 100,000 × غرام لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، وجمع المصل الفائق كما FBS خالية من الاكسوسوم لزراعة خط الخلية مورين ESC ES-D3 والحصول على المركبات الكهربائية...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Sakthiswary, R., Raymond, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+in+neurodegenerative+diseases:+From+principles+to+practice.">Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice.</a> Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).</li><li>Liu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+restore+function+in+infarcted+hearts+of+non-human+primates.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).</li><li>Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+for+type+1+diabetes+mellitus.">Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).</li><li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles.">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).</li><li>Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Presentation+by+Extracellular+Vesicles+from+Professional+Antigen-Presenting+Cells.">Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells.</a> Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).</li><li>Kunigelis, K. E., Graner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dichotomy+of+Tumor+Exosomes+(TEX)+in+Cancer+Immunity:+Is+It+All+in+the+ConTEXt?.">The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?.</a> Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).</li><li>Becher, B., Tugues, S., Greter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF:+From+Growth+Factor+to+Central+Mediator+of+Tissue+Inflammation.">GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation.</a> Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).</li><li>Conti, L., Gessani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+in+the+generation+of+dendritic+cells+from+human+blood+monocyte+precursors:+recent+advances.">GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances.</a> Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).</li><li>Higano, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+data+from+2+randomized,+double-blind,+placebo-controlled,+phase+3+trials+of+active+cellular+immunotherapy+with+sipuleucel-T+in+advanced+prostate+cancer.">Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer.</a> Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).</li><li>Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+GM-CSF-based+cancer+immunotherapy.">Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy.</a> Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).</li><li>Dranoff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+irradiated+tumor+cells+engineered+to+secrete+murine+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+potent,+specific,+and+long-lasting+anti-tumor+immunity.">Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).</li><li>Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1,+Unit+1C+4,+Culture+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).</li><li>Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+fluorescence+intensity+and+protein+expression+in+HeLa+cells+stably+transfected+with+hrGFP.">Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP.</a> Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+of+hrGFP+by+mouse+embryonic+stem+cells:+promoter+activity+in+the+undifferentiated+state+and+during+dopaminergic+neural+differentiation.">Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation.</a> Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).</li><li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+embryonic+stem+cells+protects+against+lung+cancer:+is+a+broad-spectrum+prophylactic+vaccine+against+cancer+possible?.">Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?.</a> PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).</li><li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent:+primary+neurons,+siRNA,+and+high-throughput+applications.">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Unit+3+22,+Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+for+Immunoregulation+and+Therapeutic+Intervention+in+Cancer.">Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer.</a> Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).</li><li>Bunggulawa, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+the+use+of+exosomes+as+drug+delivery+systems.">Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems.</a> Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).</li><li>Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proviral+silencing+in+embryonic+cells+is+regulated+by+Yin+Yang+1.">Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1.</a> Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).</li><li>Dranoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF-based+cancer+vaccines.">GM-CSF-based cancer vaccines.</a> Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Feeder+Cell+Types+on+Culture+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+In+Vitro.">Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro.</a> Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).</li><li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).</li><li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+GM-CSF+expressing+embryonic+stem+cells+are+an+effective+prophylactic+vaccine+for+cancer+prevention.">Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention.</a> OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).</li></ol>

تظهر هذه الدراسة طريقة فعالة للغاية لإنتاج مركبات EVs الغنية بالإكسوسوم تحمل البروتين المحفز للمناعة GM-CSF ، والتي يمكن استخدامها لدراسة الآثار التضمين المناعي للمركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم. تشير العديد من الدراسات إلى أن exosomes تظهر وظائف مناعية تنظيمية ومضادة للورم22.</sup...

ESCs مشتقة من مرحلة الكيسة الأريمية لجنين ما قبل الزرع1. كخلايا جذعية متعددة القدرات، تمتلك ESCs القدرة على التجديد الذاتي والتمييز في أي نوع من الخلايا الجنينية. نظرا لإمكاناتها التنموية الرائعة وقدرتها على الانتشار على المدى الطويل ، فإن ESCs ذات قيمة كبيرة للأبحاث الطبية الحيوية1. ركزت جهود البحث الحالية إلى حد كبير على الإمكانات العلاجية ل ESCs لمجموعة متنوعة من الاضطرابات المرضية الرئيسية ، بما في ذلك مرض السكري وأمراض القلب والأمراض العصبية2و3و4.
ومن المعروف أن خلايا الثدييات ، بما في ذلك ESCs ، تطلق الحويصلات ذات الأحجام المتغيرة للبيئة خارج الخلية ، وتمتلك هذه المركبات الكهربائية العديد من الوظائف الفسيولوجية والمرضية بسبب دورها في الاتصال بين الخلايا5. من بين أنواع فرعية مختلفة من المركبات الكهربائية، exosomes هي الحويصلات غشاء صغيرة أطلقت من أنواع مختلفة من الخلايا في الفضاء خارج الخلية عند الانصهار من مقصورات الغدد الصماء المتوسطة، والهيئات متعددة المركبات (MVBs)، مع غشاء البلازما6. وقد أفيد Exosomes للتوسط في الاتصالات بين الخلايا وتشارك بشكل حاسم في العديد من العمليات الفسيولوجية (باثو)7،8. ترث Exosomes بعض الوظائف البيولوجية من خلاياها الأبوية الخاصة ، لأن الإكسوسومات تحتوي على مواد بيولوجية تم الحصول عليها من السيتوسول ، بما في ذلك البروتينات والأحماض النووية. وهكذا، يتم تغليف المستضدات المرتبطة بها أو العوامل التي تحفز الاستجابة المناعية المحددة لمرض معين في exosomes من أنواع معينة من الخلايا9. مهد هذا الطريق للتجارب السريرية استكشاف exosomes المستمدة من الورم كلقاح مضاد للسرطان10.
GM-CSF هو السيتوكين الذي تفرزه أنواع مختلفة من الخلايا المناعية11. تظهر الأدلة الناشئة أن GM-CSF ينشط وينظم الجهاز المناعي ويلعب دورا أساسيا في عملية تقديم المستضد12. على سبيل المثال، يشير تقرير سريري إلى أن GM-CSF يحفز الاستجابة المناعية للأورام كلقاح المساعد13. وقد تم التحقيق في العديد من الاستراتيجيات العلاج المناعي السرطان المستندة إلى GM-CSF لاستغلال النشاط المحفز المناعي قوية من GM-CSF في التجارب السريرية14. من بين هذه, وقد أظهرت لقاح السرطان تتألف من الخلايا السرطانية المشععة GM-CSF إفراز بعض الوعد في مرضى سرطان الجلد المتقدمة عن طريق تحفيز الاستجابات المضادة للخلايا والفكاهية ونخر لاحقة في الأورامالمنتشرة 15.
ولأن الإكسوسومات المشتقة من مركبات الكربون الهيدروفلورية تمتلك أنشطة بيولوجية مماثلة لتلك التي تمتلكها البلدان النامية الأصلية، فربما يمكن أن تعمل الإكسوسومات الحاملة للآلية العالمية-CSF من مركبات الكربون الهيدروفلورية كحواف خالية من الخلايا لتنظيم الاستجابة المناعية. في هذه الورقة، يتم وصف طريقة مفصلة لإنتاج مركبات كهربائية عالية الجودة غنية بالإكسوسوم من ESCs تعبر عن GM-CSF. هذه المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم لديها القدرة على العمل ك الحويصلات التنظيمية المناعية لتعديل الاستجابة المناعية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphate, Calf Intestinal</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>Dephosphorylating DNA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Annexin V mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone H-3, sc-74438</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_1118989</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD81 mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone B-11, sc-166029</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_2275892</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome c mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone A-8, sc-13156</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_627385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flotillin-1 mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone C-2; sc-74566</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_2106563</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH pAb</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>600-401-A33S</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_11182910</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31430</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_228307</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>clone 20E8C12 A21348</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_221509</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ADI-SPA-890</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_10616242</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31460</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_228341</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA (bicinchoninic acid) assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23223</td>
			<td>Determining protein concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M42015</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin, Disodium Salt</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10177012</td>
			<td>Selecting E. coli colonies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Avanti J-26 XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge rotor, JA-10</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>09U1597</td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottle, Nalgene PPCO</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3120-0500PK</td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu grids with carbon support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF200-Cu</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0101</td>
			<td>Digesting DNA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced chemiluminescence detection system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>32106</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACScalibur flow cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Examining GFP levels of ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRR-30-2020</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Filtering ES-D3 cells for FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (0.1%)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ES006B</td>
			<td>Culturing ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF ELISA kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88733422</td>
			<td>Determining GM-CSF concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10-829-018</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRL0131-0100</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfecting ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader, PowerWave XS</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Determining GM-CSF concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP high-speed cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Isolating single ES-D3 cell clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2988J</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10-131-035</td>
			<td>Selecting ES-D3 clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat dry milk</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9022655</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Transfecting ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>sc45000-652</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>37270</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membranes</td>
			<td>Millipore EMD</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligation Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HT7700</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-660</td>
			<td>Culturing ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor, 45Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>09U4454</td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge polycarbonate bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UranyLess staining solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22409</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of exosome-enriched extracellular vesicles carrying granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from embryonic stem cells

الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) هي خلايا جذعية متعددة القدرات قادرة على التجديد الذاتي والتمايز في جميع أنواع الخلايا الجنينية. مثل العديد من أنواع الخلايا الأخرى، تطلق ESCs حويصلات غشاء صغيرة، مثل الإكسوسومات، إلى البيئة خارج الخلية. Exosomes بمثابة الوسطاء الأساسية للاتصال بين الخلايا وتلعب دورا أساسيا في العديد من العمليات الفسيولوجية (باثو). يعمل عامل تحفيز مستعمرة الحبيبية-الضامة (GM-CSF) كسيتوكين لتعديل الاستجابة المناعية. وجود جنرال موتورز CSF في exosomes لديه القدرة على تعزيز وظيفتها التنظيمية المناعية. هنا، تم التعبير عن GM-CSF بشكل مفرط بشكل ثابت في خط خلية مورين ESC ES-D3. تم تطوير بروتوكول لعزل الحويصلات خارج الخلية عالية الجودة المخصبة بالإكسوسوم (EVs) من خلايا ES-D3 التي تفرط في التعبير عن GM-CSF. وتميزت المركبات الكهربائية المعزولة المخصبة بالإكسوسوم بمجموعة متنوعة من النهج التجريبية. والأهم من ذلك، تبين أن كميات كبيرة من المركبات الكهربائية الغنية بالإكسوسوم موجودة في مركبات الكربون الكلورية المحورة. وعموما، قد تعمل المركبات الكهربائية المخصبة بالإكسوسوم الحاملة للآلية العالمية من مركبات الكربون الهيدروفلورية ك الحويصلات الخالية من الخلايا لممارسة أنشطتها التنظيمية المناعية.

يتم التعبير عن GM-CSF بشكل مفرط في ESCs مورين. لتعبيرات جنرال موتورز-CSF بشكل مفرط في خلايا ES-D3، تم استنساخ مورين GM-CSF cDNA في ناقل العدوى لتوليد متجه التعبير pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP(الشكل 1A). تم التعبير عن GM-CSF بشكل مفرط في خلايا ES-D3 عن طريق العدوى ، وكان حو?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

تصف هذه الدراسة طريقة لعزل الحويصلات خارج الخلية المخصبة بالإكسوسوم التي تحمل عوامل تحفيز مستعمرة الحبيبية المحفزة للمناعة من الخلايا الجذعية الجنينية.

عزل الحويصلات خارج الخلية المخصبة Exosome تحمل عامل تحفيز مستعمرة الحبيبية-الضامة من الخلايا الجذعية الجنينية

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

يمكن استخدام بروتوكولنا لإنتاج الحويصلات خارج الخلية عالية الجودة المخصبة بالإكسوسوم من الخلايا الجذعية الجنينية التي تعبر عن عامل التحفيز المناعي ، GM-CSF. الحويصلات المخصبة خارج الخلية التي تحمل GM-CSF ، لديها القدرة على خدمة الحويصلات التنظيمية المناعية الخالية من الخلايا التي يمكن أن تعدل الاستجابة المناعية. الباحثون مع التدريب البيولوجيا الجزيئية والخلوية الأساسية، ينبغي أن تكون قادرة على بسهولة كما يمكن لهذا البروتوكول، ولكن أي شخص ينفذ هذا البروتوكول للمرة الأولى يجب أن تتبع التوجيهات عن كثب.نظرا لأن بروتوكولنا معقد ، فإن تصور التفاصيل المعقدة لكل خطوة سيساعد الباحثين الآخرين على توليد FBS مجانية إكسوسوم ، والطرد الفائق الحجم المطلوب من FBS وجمع supernatant الحرة exosome. قبل طلاء الخلايا الثلاث ESD، معطف 15 سم أطباق زراعة الأنسجة مع 0.1٪الجيلاتين في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. إزالة الجيلاتين عن طريق الطموح والثقافة ESD ثلاث خلايا دون خلايا طبقة التغذية في ESD ثلاث خلايا ثقافة المتوسطة في 37 درجة مئوية في 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون الرطوبة حتى تصل الخلايا 90٪ التقاء.غسل الثقافات التقاء تقريبا مع خمسة ملليلتر من 0.05٪ تريبسين لكل طبق تليها حضانة خمس دقائق في 37 درجة مئوية في تريبسين الطازجة. في نهاية الحضانة سحب الخلايا المنفصلة في أنبوب الطرد المركزي وتعطيل التريبسين مع خمسة ملليلتر من المتوسطة ثقافة جديدة. ترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق المنصات في وسط جديد لعد للتمرير، لوحة خمس مرات 10 إلى السادس من ESD ثلاث خلايا في 15 ملليلتر من الخلايا ثقافة المتوسطة على لوحات جديدة مغلفة الجيلاتين لمدة ثلاثة أيام من الثقافة قبل زراعة الخلايا الفرعية لجمع الخلايا الثقافة الفائقة لعزل لوحة الحويصلات خارج الخلية المخصب exosome مرة واحدة 10 إلى ESD السابعة ثلاث خلايا في 15 ملليلتر من خلية الثقافة المتوسطة لكل لوحة جديدة مغلفة الجيلاتين لمدة ثلاثة أيام قبل جمع الشعيرات ثقافة الخلية ل exosome المخصب عزل الحويذ الخلوية اضافية، أولا الرواسب شظايا الخلية الكبيرة داخل الشعيرات التي تم جمعها من 72 ساعة مثقف ESD ثلاث خلايا عن طريق الطرد المركزي.بعد جمع supernatant، Ultracentrifuge العينات والتخلص من المضادات الفائقة. شطف بلطف كل pallette مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل غسل لإزالة أي ثقافة المتبقية supernatant وتحديد محتوى بروتين الحويكل المخصب exosome مع مقايسة حمض بيسينونيتيك، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم إعادة تعليق الحويصلات المخصبة exosome خارج الخلية في برنامج تلفزيوني في ستة ميكروغرام لكل تركيز متر صغير للتخزين في ناقص 80 درجة مئوية.لتصور الحويصلات خارج الخلية المخصبة عن طريق إرسال المجهر الإلكتروني إصلاح ثلاثة إلى خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من الحويصلات خارج الخلية مع التركيز النهائي من 2٪ المجهر الإلكتروني شبكة paraformaldehyde في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة، قم بتحميل 10 ميكرولترات من العينات الثابتة على شبكات النحاس مع فيلم دعم الكربون لمدة دقيقة واحدة قبل استنزاف الشبكات بورق التصفية، والبقاء في الشبكات مع محلول تلطيخ مناسب، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة واستخدام الملاقط لنقل الشبكات إلى قطعة من ورق التصفية، ثم استخدم المجهر الإلكتروني الإرسال مع التكبير 50،000 مرة للحصول على صور المجهر الإلكتروني، وفقا للبروتوكولات القياسية. لإعداد مستخلصات الخلية الكاملة، وجمع ESD ثلاث خلايا من الثقافة كما هو موضح، وإعادة تعليق الخلايا المحصودة في برنامج تلفزيوني للعد.بعد الطرد المركزي الثاني، إعادة تعليق الخلايا من أصل خمس مرات 10 إلى الخلايا الثالثة لكل ميكرولتر من المخزن المؤقت تحميل صفحة SDS التي تحتوي على تركيز 0.5٪ SDS وسونيكاتي العينات لمدة 10 ثوان على Sonicator مع سعة 10٪. ثم سخني العينات عند 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. لإعداد الليسات للحوافات المخصبة خارج الخلية ، أعد تعليق الحويصلات المخصبة خارج الخلية في مخزن تحميل صفحة SDS الذي يحتوي على 0.5٪ SDS بمعدل 1.2 ميكروغرام لكل تركيز ميكروليتر و Sonicate العينات لمدة 10 ثوان كما هو موضح ثم سخني العينات عند 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.لتحليل بلوت الغربية، تحميل 10 ميكرولتر استخراج الجملة وإكسوسوم المخصب عينات lysicle خارج الخلية في الآبار الفردية من هلام صفحة الإجهاد أفضل. في نهاية الشوط ، نقل البروتينات على أغشية PVDF واحتضان الأغشية مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية المناسبة ذات الاهتمام ، ثم الكشف عن التعبير البروتين باستخدام عدة الكشف عن chemiluminescence المحسنة ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لتقييم كمية من GM-CSF داخل الحويصلات المخصب exosome خارج الخلية، استخدام مجموعة مورين GM-CSF لمعطف لوحة ELISA مع المضادة GM-CSF التقاط الأجسام المضادة المقبل, علاج 0.6 ميكروغرام من عينات الحويصلات المخصب exosome خارج الخلية مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وحده, أو PBS زائد 0.05٪ توين 20 في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.في نهاية الحضانة، إضافة عينات المعالجة إلى الآبار الفردية من لوحة ELISA المعدة لمدة ساعة واحدة الحضانة في درجة حرارة الغرفة تليها غسل الآبار المقابلة المناسبة مع برنامج تلفزيوني وحده، أو برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 0.05٪ توين 20. بعد الغسيل ، أضف الجسم المضاد للكشف إلى العينات لمدة ساعة حضانة في درجة حرارة الغرفة تليها غسل مع PBS وحده أو PBS بالإضافة إلى 0.05٪ توين 20 كما هو موضح ، ثم أضف Avidin Horseradish Peroxidase إلى العينات لاحتضان 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، يليه غسل وقياس الامتصاص في كل بئر على قارئ ميكروبليت في 450 نانومتر. كثافة الفلورية GFP من GM-CSF التعبير عن ESD خط الخلية ثلاثة أو خط الخلية ESD ثلاثة التعبير عن ناقل فارغ هو أعلى بكثير من نظرائهم الوالدين.ELISA يكشف أن ESD ثلاث خلايا تعبر عن GM-CSF تنتج مستويات أعلى بشكل ملحوظ من GMCSF في ثقافة الخلية supernatant من القيام خلايا مكافحة ناقلات فارغة. وعلاوة على ذلك، فإن كمية الخلايا الليفية المعدلة وراثيا-CSF التي تولدها GM-CSF التي تعبر عن ثلاث خلايا ESD مماثلة لتلك التي تنتجها الخلايا الليفية STO التي تعبر عن GM-CSF. يكشف المجهر الإلكتروني الإرسالي لل الحويصلات خارج الخلية المعزولة عن ناقلات الخلايا المنقولة وثقافات الخلايا المنقولة GM-CSF عن الحويصلات ذات الأحجام المختلفة التي تقع ضمن نطاق قطر 30 إلى 100 نانومتر المتوقع.يتم تعزيز التعبير عن علامات اكسوسومال، بما في ذلك CD81، Annexin الخامس وflotillin-1 بشكل ملحوظ في الحويصلات خارج الخلية، معزولة عن ESD ثلاث خلايا مقارنة مع مقتطفات الجملة المقابلة من قبل تحليل لطخة الغربية. الأهم من ذلك، لم يتم الكشف عن وجود علامات المقصورة الفرعية الخلوية الأخرى في ESD ثلاثة الحويصلات خارج الخلية المشتقة بما في ذلك علامة الشبكية الانبوبلازمية، البروتين ديسولفيد إيزوميراز، وعلامات الميتوكوندريا، سيتوكروم C وأوكسيفوس المعقدة IV-subunit IV وعلامة السيتوسوليك GAPDH. بعد الغسيل مع 0.05٪ توين 20، تم تخفيض مستويات GM-CSF الخلفية التي تم الكشف عنها في الحويصلات خارج الخلية التحكم بشكل كبير.وعلى النقيض من ذلك، زادت مستويات GM-CSF في الحويصلات خارج الخلية من الخلايا المعبرة عن GM-CSF بشكل كبير بمقدار توين 20. الحصول على نوعية عالية exosome المخصب الحويصلات خارج الخلية تحمل GMCSF هو الخطوة الأكثر أهمية لنجاح هذا البروتوكول. يمكن للباحثين إجراء تجارب إضافية، مثل الدراسات في خطوط الخلايا التابعة GM-CSF والحيوانات لتحديد ما إذا كان الحويصلات المخصبة خارج الخلية التي تهتم ب GM-CSF يمكن أن تعمل ك الحويصلات التنظيمية المناعية الخالية من الخلايا.يمكن بعد ذلك استخدام هذه الحويصلات المخصبة خارج الخلية لاستكشاف كيفية تأثير تعديل الاستجابة المناعية على حالات مرضية مختلفة.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

السلوك الغازية من خلايا سرطان الثدي البشرية في الجنينية الزرد

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

تسخير الحمض النووي صبغ أثار الجانب السكان النمط الظاهري للكشف عن وتنقية الخلايا الجذعية للسرطان من العينات البيولوجية

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

نموذج ماوس الإكلينيكية من أوستيوساركوما لتعريف الاتصال خارج الخلية حويصلة بوساطة بين الورم والخلايا الجذعية الوسيطة

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

عزل وتوصيف الخلايا التي تبدأ الورم من الساركوما المستمدة من المرضى Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

عزل الخلايا البطانية البشرية من القولون العادي وسرطان القولون والمستقيم-وضع بروتوكول تحسين

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة اللب والثقافة المشتركة مع الخلايا السرطانية لدراسة التفاعلات الخاصة بها

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

استخراج الحويصلات خارج الخلية من الأنسجة كاملة

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

التحكم المكاني والزماني للبدء من الميلانوما من الخلايا الجذعية المتحولة للخلايا الصباغية

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

عزل خلايا شبيهه بالجذعية من ثقافات كروي ثلاثية الابعاد

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

العزل والتقييم الوظيفي للخلايا الجذعية لسرطان الثدي البشري من عينات الخلايا والأنسجة

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...