Name: isolation of exosome-enriched extracellular vesicles carrying granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from embryonic stem cells
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Vi er taknemmelige for Mr. Arkadiusz Slusarczyk og Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) for at erhverve transmission elektron mikroskop billeder. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 og CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) og Free to Breathe Research Grant (K.Y.).

1. Dyrkning af ES-D3-celler
<ol><li>For at generere eksosomfrit fosterkvægsserum (FBS) skal FBS ind i en ultracentrifuge og centrifuge ved 100.000 x g i 16 timer ved 4 °C. Efter centrifugering, indsamle serum supernatant som exosome-fri FBS for dyrkning af murin ESC celle linje ES-D3 og erhverve exosome-beriget elbiler.</li>
	<li>Før ES-D3-cellerne plates, skal du belægge 15 cm vævskulturretter ved hjælp af gelatine (0,1%) ved stuetemperatur i 30 min.</li>
	<li>Efter en tidligere beskrevet protokol<sup ...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Sakthiswary, R., Raymond, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+in+neurodegenerative+diseases:+From+principles+to+practice.">Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice.</a> Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).</li><li>Liu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+restore+function+in+infarcted+hearts+of+non-human+primates.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).</li><li>Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+for+type+1+diabetes+mellitus.">Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).</li><li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles.">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).</li><li>Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Presentation+by+Extracellular+Vesicles+from+Professional+Antigen-Presenting+Cells.">Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells.</a> Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).</li><li>Kunigelis, K. E., Graner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dichotomy+of+Tumor+Exosomes+(TEX)+in+Cancer+Immunity:+Is+It+All+in+the+ConTEXt?.">The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?.</a> Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).</li><li>Becher, B., Tugues, S., Greter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF:+From+Growth+Factor+to+Central+Mediator+of+Tissue+Inflammation.">GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation.</a> Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).</li><li>Conti, L., Gessani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+in+the+generation+of+dendritic+cells+from+human+blood+monocyte+precursors:+recent+advances.">GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances.</a> Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).</li><li>Higano, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+data+from+2+randomized,+double-blind,+placebo-controlled,+phase+3+trials+of+active+cellular+immunotherapy+with+sipuleucel-T+in+advanced+prostate+cancer.">Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer.</a> Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).</li><li>Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+GM-CSF-based+cancer+immunotherapy.">Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy.</a> Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).</li><li>Dranoff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+irradiated+tumor+cells+engineered+to+secrete+murine+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+potent,+specific,+and+long-lasting+anti-tumor+immunity.">Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).</li><li>Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1,+Unit+1C+4,+Culture+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).</li><li>Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+fluorescence+intensity+and+protein+expression+in+HeLa+cells+stably+transfected+with+hrGFP.">Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP.</a> Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+of+hrGFP+by+mouse+embryonic+stem+cells:+promoter+activity+in+the+undifferentiated+state+and+during+dopaminergic+neural+differentiation.">Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation.</a> Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).</li><li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+embryonic+stem+cells+protects+against+lung+cancer:+is+a+broad-spectrum+prophylactic+vaccine+against+cancer+possible?.">Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?.</a> PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).</li><li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent:+primary+neurons,+siRNA,+and+high-throughput+applications.">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Unit+3+22,+Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+for+Immunoregulation+and+Therapeutic+Intervention+in+Cancer.">Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer.</a> Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).</li><li>Bunggulawa, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+the+use+of+exosomes+as+drug+delivery+systems.">Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems.</a> Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).</li><li>Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proviral+silencing+in+embryonic+cells+is+regulated+by+Yin+Yang+1.">Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1.</a> Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).</li><li>Dranoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF-based+cancer+vaccines.">GM-CSF-based cancer vaccines.</a> Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Feeder+Cell+Types+on+Culture+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+In+Vitro.">Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro.</a> Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).</li><li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).</li><li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+GM-CSF+expressing+embryonic+stem+cells+are+an+effective+prophylactic+vaccine+for+cancer+prevention.">Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention.</a> OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).</li></ol>

Denne undersøgelse viser en meget effektiv metode til fremstilling af exosome-berigede elbiler, der bærer immunstimulerende protein GM-CSF, som kan anvendes til at studere immunmodulerende virkninger af exosome-berigede elbiler. Flere undersøgelser tyder på, at exosomer udviser immunregulerende og anti-tumor funktioner22. Eksosomer fra EFC'er, der udtrykker GM-CSF, kan således også have biologiske aktiviteter, der regulerer immunresponset. I denne protokol blev eksogen murin GM-CSF stukket o...

ESC'er er afledt af blastocyst fase af en præimplantation embryo1. Som pluripotente stamceller har ESC'er evnen til selv at forny og differentiere sig til enhver form for embryonale celler. På grund af deres bemærkelsesværdige udviklingspotentiale og langsigtede proliferative kapacitet er EFC'erne yderst værdifulde for biomedicinsk forskning1. Den nuværende forskningsindsats har i vid udstrækning fokuseret på EFC'ernes terapeutiske potentiale for en række større patologiske lidelser, herunder diabetes, hjertesygdomme og neurodegenerative sygdomme2,3,4.
Pattedyrsceller, herunder EPC'er, er kendt for at frigive vesikler med varierende størrelser til det ekstracellulære miljø, og disse elbiler besidder mange fysiologiske og patologiske funktioner på grund af deres rolle i intercellulær kommunikation5. Blandt forskellige undertyper af elbiler er exosomer små membran vesikler, der frigives fra forskellige celletyper i det ekstracellulære rum ved fusion af mellemliggende endoytiske rum, multivesicular organer (MVB'er), med plasmamembranen6. Exosomer er blevet rapporteret at mægle intercellulær kommunikation og er kritisk involveret i mange (pato)fysiologiske processer7,8. Exosomer arver nogle biologiske funktioner fra deres egne forældreceller, fordi exosomer indeholder biologiske materialer erhvervet fra cytosolen, herunder proteiner og nukleinsyrer. Således er de tilknyttede antigener eller faktorer, der stimulerer immunresponset, der er specifikt for en given sygdom, indkapslet i exosomer fra bestemte typer celler9. Dette banede vejen for kliniske forsøg udforske tumor-afledte exosomer som en anti-cancer vaccine10.
GM-CSF er en cytokin udskilles af forskellige typer af immunceller11. Nye beviser viser , at GM-CSF aktiverer og regulerer immunsystemet og spiller en væsentlig rolle i antigen-præsentationsprocessen12. For eksempel, en klinisk rapport tyder på, at GM-CSF stimulerer immunresponset på tumorer som en vaccine adjuvans13. Flere GM-CSF-baserede kræftimmunterapistrategier til udnyttelse af GM-CSF's potente immunstimulerende aktivitet er blevet undersøgt i kliniske forsøg14. Blandt disse, en kræftvaccine bestående af bestrålet GM-CSF-udskillende tumorceller har vist nogle løfte i avancerede melanom patienter ved at fremkalde cellulære og humoristiske antitumor svar og efterfølgende nekrose i metastaserede tumorer15.
Fordi exosomer stammer fra EFC'er besidder lignende biologiske aktiviteter som de oprindelige EFC'er, måske GM-CSF-regnskabsmæssige exosomer fra EFC'er kunne fungere som cellefri vesikler til at regulere immunresponset. I dette papir beskrives en detaljeret metode til fremstilling af exosomeberigede elbiler af høj kvalitet fra EFC'er, der udtrykker GM-CSF. Disse exosome-beriget elbiler har potentiale til at tjene som immunregulerende vesikler til at modulere immunresponset.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphate, Calf Intestinal</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>Dephosphorylating DNA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Annexin V mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone H-3, sc-74438</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_1118989</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD81 mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone B-11, sc-166029</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_2275892</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome c mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone A-8, sc-13156</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_627385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flotillin-1 mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone C-2; sc-74566</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_2106563</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH pAb</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>600-401-A33S</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_11182910</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31430</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_228307</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>clone 20E8C12 A21348</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_221509</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ADI-SPA-890</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_10616242</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31460</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_228341</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA (bicinchoninic acid) assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23223</td>
			<td>Determining protein concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M42015</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin, Disodium Salt</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10177012</td>
			<td>Selecting E. coli colonies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Avanti J-26 XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge rotor, JA-10</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>09U1597</td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottle, Nalgene PPCO</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3120-0500PK</td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu grids with carbon support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF200-Cu</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0101</td>
			<td>Digesting DNA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced chemiluminescence detection system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>32106</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACScalibur flow cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Examining GFP levels of ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRR-30-2020</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Filtering ES-D3 cells for FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (0.1%)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ES006B</td>
			<td>Culturing ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF ELISA kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88733422</td>
			<td>Determining GM-CSF concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10-829-018</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRL0131-0100</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfecting ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader, PowerWave XS</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Determining GM-CSF concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP high-speed cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Isolating single ES-D3 cell clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2988J</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10-131-035</td>
			<td>Selecting ES-D3 clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat dry milk</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9022655</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Transfecting ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>sc45000-652</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>37270</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membranes</td>
			<td>Millipore EMD</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligation Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HT7700</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-660</td>
			<td>Culturing ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor, 45Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>09U4454</td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge polycarbonate bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UranyLess staining solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22409</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of exosome-enriched extracellular vesicles carrying granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from embryonic stem cells

Embryonale stamceller (EPC'er) er pluripotente stamceller, der er i stand til selvfornyelse og differentiering i alle typer embryonale celler. Ligesom mange andre celletyper frigiver EFC'er små membran vesikler, såsom exosomer, til det ekstracellulære miljø. Exosomer tjener som væsentlige mæglere af intercellulær kommunikation og spiller en grundlæggende rolle i mange (pato)fysiologiske processer. Granulocyte-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF) fungerer som en cytokin for at modulere immunresponset. Tilstedeværelsen af GM-CSF i exosomer har potentiale til at øge deres immunregulerende funktion. Her blev GM-CSF stukket overekspresset i murine ESC cellelinjen ES-D3. En protokol blev udviklet for at isolere exosomberigede ekstracellulære vesikler (EVs) af høj kvalitet fra ES-D3-celler, der overekspresserer GM-CSF. Isolerede exosome-berigede elbiler var karakteriseret ved en række eksperimentelle tilgange. Det er vigtigt, at betydelige mængder GM-CSF blev anset for at være til stede i exosome-berigede elbiler. Samlet set kan GM-CSF-bærende exosome-berigede elbiler fra EFC'er fungere som cellefrie vesikler til at udøve deres immunregulerende aktiviteter.

GM-CSF er overekspresseret i murine ESCs. For at overekspressere GM-CSF i ES-D3-celler blev murine GM-CSF cDNA klonet til en transfectionvektor for at generere udtrykket vektor pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (Figur 1A). GM-CSF blev overekspresseret i ES-D3-celler ved transfektion, og omkring 20 % af de forbigående overførte ES-D3-celler var GFP-positive. Celle kloner stably overekspressere GM-CSF eller den tomme vektor kontro...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Denne undersøgelse beskriver en metode til at isolere exosome-beriget ekstracellulære vesikler transporterer immun-stimulerende granulocyt makrofag koloni-stimulerende faktorer fra embryonale stamceller.

Isolering af exosome-beriget ekstracellulære vesikler Transporterer Granulocyte-Makrofag Colony-stimulerende faktor fra embryonale stamceller

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Vores protokol kan bruges til at producere exosomberigede ekstracellulære vesikler af høj kvalitet fra embryonale stamceller, der udtrykker immunstimulerende faktor, GM-CSF. Exosome beriget ekstracellulære vesikler transporterer GM-CSF, har potentiale til at tjene en celle-fri immun regulatoriske vesikler, der kan modulere immunresponset. Forskere med den grundlæggende molekylær og cellulære biologi uddannelse, Bør være i stand til nemt som kunne denne protokol, men enhver, der udfører denne protokol for første gang bør følge anvisningerne nøje.Da vores protokol er kompliceret, visualisere de indviklede detaljer i hvert trin vil hjælpe andre forskere til at generere exosome gratis FBS, ultracentrifuge den ønskede mængde FBS og indsamle exosome gratis supernatant. Før plating ESD tre celler, pels 15 centimeter væv kultur retter med 0,1% Gelatine ved stuetemperatur i 30 minutter. Fjern gelatine ved aspiration og kultur ESD tre celler uden feeder lagceller i ESD tre celle kultur medium ved 37 grader Celsius i 5% Kuldioxid befugtet inkubator, indtil cellerne når 90% sammenløb.Vask de næsten sammenflyttede kulturer med fem milliliter på 0,05% trypsin pr. skål efterfulgt af en fem minutters inkubation ved 37 grader Celsius i frisk trypsin. I slutningen af inkubationen trække de løsrevne celler i et centrifugerør og inaktivere trypsin med fem milliliter frisk kultur medium. Sediment cellerne ved centrifugering og re-suspendere paller i frisk medium til tælling Til passaging, plade fem gange 10 til den sjette af ESD tre celler i 15 milliliter cellekultur medium på nye gelatine belagt plader i tre dages kultur, før undertultning cellerne At indsamle cellekultur supernatant til isolering af exosome beriget ekstracellulære vesikler plade en gange 10 til den syvende ESD tre celler i 15 milliliter af cellekultur medium pr nye gelatine belagt plade i tre dage før indsamling af cellekultur supernatants For exosome beriget ekstra cellulære vesikel isolation, Første sediment de store cellefragmenter i supernatanterne indsamlet fra 72 timers kultiveret ESD tre celler ved centrifugering.Efter indsamling af supernatanten ultracentrifugere prøverne og kassere supernatants. Skyl forsigtigt hver pallette to gange med en milliliter PBS pr. vask for at fjerne eventuelle resterende kultur supernatant og kvantificere det exosome berigede ekstracellulære vesikelproteinindhold med en bicinchoninsyreanalyse, ifølge producentens instruktion. Derefter suspendere exosome beriget ekstracellulære vesikler i PBS på en seks mikrogram per mikrometer koncentration til opbevaring på minus 80 grader Celsius.For at visualisere exosome beriget ekstracellulære vesikler ved transmission elektronmikroskopi fastsætte tre til fem mikrogram per milliliter af de ekstracellulære vesikler med den endelige koncentration af 2% elektron mikroskop gitter paraformaldehyd ved stuetemperatur i to timer. Ved inkubationens afslutning skal du indlæse 10 mikroliter af de faste prøver på kobbergitre med kulstofstøttefilm i et minut, før du dræner gitrene med filterpapir, forbliver i gitrene med en passende farvningsopløsning i henhold til producentens protokol og bruger pincet til at overføre gitrene til et stykke filterpapir, derefter bruge transmission elektron mikroskop med en 50.000 gange forstørrelse til at erhverve elektronmikroskopi billeder, i henhold til standard protokoller. For at forberede hele celleekstrakter skal du indsamle ESD tre celler fra kulturen som demonstreret og suspendere de høstede celler i PBS til tælling.Efter en anden centrifugering skal cellerne suspenderes ud af fem gange 10 til de tredje celler pr. mikroliter af SDS-sidebelastningsbuffer, der indeholder 0,5% SDS-koncentration og sonikere prøverne i 10 sekunder på en Sonicator med en 10%amplitude. Derefter opvarmes prøverne ved 100 grader Celsius i fem minutter. For at forberede lysater til exosomet beriget ekstracellulære vesikler, Suspendere exosome beriget ekstracellulære vesikler i SDS side lastning buffer indeholder 0,5% SDS på en 1,2 mikrogram per mikroliter koncentration og Soniker prøverne i 10 sekunder som påvist derefter varme prøverne ved 100 grader Celsius i fem minutter.For Western Blot Analyse, indlæse 10 mikroliter engros ekstrakt og exosome beriget ekstracellulære vesikel lysat prøver i individuelle Brønde af en bedste stress side gel. I slutningen af kørslen overføres proteinerne til PVDF-membraner og inkuberer membranerne med de relevante primære og sekundære antistoffer af interesse, og detekterer derefter proteinudtrykket ved hjælp af et forbedret chemiluminescensdetekteringssæt, Ifølge producentens instruktioner. For at vurdere mængden af GM-CSF i exosome beriget ekstracellulære vesikler, skal du bruge et kit Murine GM-CSF til pels en ELISA Plate med anti GM-CSF fange antistof næste, behandle 0,6 mikrogram exosome beriget ekstracellulære vesikler prøver med 100 mikroliters af PBS alene, eller PBS plus 0,05% tween 20 ved stuetemperatur i 30 minutter.Ved inkubationens afslutning tilsættes de behandlede prøver til individuelle Brønde af den forberedte ELISA Plate til en times inkubation ved stuetemperatur efterfulgt af vask af de relevante tilsvarende brønde med PBS alene eller PBS plus 0,05% mellem 20. Efter vask, tilføje detektion antistof til prøverne for en times inkubation ved stuetemperatur efterfulgt af en vask med PBS alene eller PBS plus 0,05% mellem 20 som påvist, Derefter tilføje Avidin peberrod Peroxidase til prøverne for en 30 minutters inkubation ved stuetemperatur, efterfulgt af en vask og måling af absorbansen i hver brønd på en Microplate Reader på 450 nanometer. GFP fluorescens intensiteten af en GM-CSF udtrykker ESD tre celle linje eller en ESD tre celle linje udtrykker en tom vektor er meget højere end deres forældre kolleger.ELISA afslører, at ESD tre celler, der udtrykker GM-CSF producere markant højere niveauer af GMCSF i deres celle kultur supernatant end tomme vektor kontrol celler. Desuden svarer mængden af GM-CSF, der genereres af GM-CSF, der udtrykker ESD-tre celler, til den, der produceres af STO-fibroblaster, der udtrykker GM-CSF. Transmission elektronmikroskopi af ekstracellulære vesikler isoleret fra vektortransduced og GM-CSF transduced cellekulturer afslører vesikler af forskellige størrelser, der falder inden for den forventede 30 til 100 nanometer diameter rækkevidde.Udtrykket af exosomale markører, herunder CD81, Annexin V og flotillin-1, forstærkes markant i ekstracellulære vesikler, isoleret fra ESD tre celler sammenlignet med tilsvarende engrosekstrakter ved western blot-analyse. Det er vigtigt, at tilstedeværelsen af andre subcellulære rummarkører i ESD tre afledte ekstracellulære vesikler ikke blev opdaget, herunder endoplasmisk reticulummarkør, Protein Disulfid Isomerase, mitokondriemarkørerne, cytochromE C og Oxphos komplekse IV-subunit IV og den cytosoliske GAP-markørDH. Efter vask med 0,05% mellem 20, baggrunden GM-CSF niveauer opdaget i kontrol Extracellular vesikler blev reduceret betydeligt.I modsætning hertil blev GM-CSF-niveauerne i de ekstracellulære vesikler i GM-CSF udtrykkende celler signifikant forøget med mellem 20. Erhvervelse af exosome beriget ekstracellulære vesikler af høj kvalitet, der transporterer GMCSF, er det vigtigste skridt for denne protokols succes. Forskere kan udføre yderligere eksperimenter, såsom undersøgelser i GM-CSF afhængige cellelinjer og dyr for at afgøre, om exosome beriget ekstracellulære vesikler pleje GM-CSF kan fungere som cellefri immunregulerende vesikler.Disse exosome beriget ekstracellulære vesikler kan derefter bruges til at undersøge, hvordan graduering af immunresponset påvirker forskellige sygdomstilstande.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasiv Opførsel af humane brystcancerceller i embryonale zebrafisk

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Udnyttelse af DNA-farve-udløst sidebefolkningens fenotype til at detektere og rense kræftstamceller fra biologiske prøver

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

En prækliniske musemodel af osteosarkom at definere den ekstracellulære vesikel-medieret kommunikation mellem Tumor og mesenkymale stamceller

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering og karakterisering af tumor initierende celler fra sarkom patient afledte Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolering af menneskelige endotelceller fra normale kolon og Colorectal karcinom - en forbedret protokol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymale stamceller isoleret fra Pulp væv og fælles kultur med kræftceller til at studere deres interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Udvinding af ekstracellulære vesikler fra hele væv

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Rumlig og tidsmæssig kontrol af murine melanom initiering fra mutant melanocyte stamceller

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolering af Stem-lignende celler fra 3-dimensionelle sfæriske kulturer

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolering og funktionel vurdering af stamceller fra brystkræft fra celle- og vævsprøver

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...