Name: isolation of exosome-enriched extracellular vesicles carrying granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from embryonic stem cells
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells at JoVE.com

We zijn de heer Arkadiusz Slusarczyk en Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) dankbaar voor het verkrijgen van transmissie-elektronenmicroscoopbeelden. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 en CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) en Free to Breathe Research Grant (K.Y.).

1. ES-D3 cellen kweken
<ol><li>Om exosoomvrij foetaal runderserum (FBS) te genereren, laadt u FBS in een ultracentrifuge en centrifugeer u gedurende 16 uur bij 4 °C bij 100.000 x g. Verzamel na centrifugeren serumsupernatant als exosoomvrije FBS voor het kweken van de muriene ESC-cellijn ES-D3 en het verwerven van exosoomverrijkte EV's.</li>
	<li>Voordat u de ES-D3-cellen plateert, bedekt u de 15 cm weefselkweekschalen met gelatine (0,1%) op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Volgens een eerder...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Sakthiswary, R., Raymond, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+in+neurodegenerative+diseases:+From+principles+to+practice.">Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice.</a> Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).</li><li>Liu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+restore+function+in+infarcted+hearts+of+non-human+primates.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).</li><li>Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+for+type+1+diabetes+mellitus.">Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).</li><li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles.">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).</li><li>Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Presentation+by+Extracellular+Vesicles+from+Professional+Antigen-Presenting+Cells.">Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells.</a> Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).</li><li>Kunigelis, K. E., Graner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dichotomy+of+Tumor+Exosomes+(TEX)+in+Cancer+Immunity:+Is+It+All+in+the+ConTEXt?.">The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?.</a> Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).</li><li>Becher, B., Tugues, S., Greter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF:+From+Growth+Factor+to+Central+Mediator+of+Tissue+Inflammation.">GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation.</a> Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).</li><li>Conti, L., Gessani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+in+the+generation+of+dendritic+cells+from+human+blood+monocyte+precursors:+recent+advances.">GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances.</a> Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).</li><li>Higano, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+data+from+2+randomized,+double-blind,+placebo-controlled,+phase+3+trials+of+active+cellular+immunotherapy+with+sipuleucel-T+in+advanced+prostate+cancer.">Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer.</a> Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).</li><li>Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+GM-CSF-based+cancer+immunotherapy.">Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy.</a> Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).</li><li>Dranoff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+irradiated+tumor+cells+engineered+to+secrete+murine+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+potent,+specific,+and+long-lasting+anti-tumor+immunity.">Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).</li><li>Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1,+Unit+1C+4,+Culture+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).</li><li>Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+fluorescence+intensity+and+protein+expression+in+HeLa+cells+stably+transfected+with+hrGFP.">Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP.</a> Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+of+hrGFP+by+mouse+embryonic+stem+cells:+promoter+activity+in+the+undifferentiated+state+and+during+dopaminergic+neural+differentiation.">Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation.</a> Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).</li><li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+embryonic+stem+cells+protects+against+lung+cancer:+is+a+broad-spectrum+prophylactic+vaccine+against+cancer+possible?.">Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?.</a> PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).</li><li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent:+primary+neurons,+siRNA,+and+high-throughput+applications.">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Unit+3+22,+Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+for+Immunoregulation+and+Therapeutic+Intervention+in+Cancer.">Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer.</a> Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).</li><li>Bunggulawa, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+the+use+of+exosomes+as+drug+delivery+systems.">Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems.</a> Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).</li><li>Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proviral+silencing+in+embryonic+cells+is+regulated+by+Yin+Yang+1.">Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1.</a> Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).</li><li>Dranoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF-based+cancer+vaccines.">GM-CSF-based cancer vaccines.</a> Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Feeder+Cell+Types+on+Culture+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+In+Vitro.">Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro.</a> Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).</li><li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).</li><li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+GM-CSF+expressing+embryonic+stem+cells+are+an+effective+prophylactic+vaccine+for+cancer+prevention.">Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention.</a> OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).</li></ol>

Deze studie toont een zeer efficiënte methode voor het produceren van exosoom-verrijkte EV's met het immuunstimulerende eiwit GM-CSF, dat kan worden gebruikt om de immuunmodulerende effecten van exosoom-verrijkte EV's te bestuderen. Verschillende studies suggereren dat exosomen immuunregulerende en antitumorale functies vertonen22. Exosomen van SER's die GM-CSF tot expressie komen, kunnen dus ook biologische activiteiten bezitten die de immuunrespons reguleren. In dit protocol werd exogene murine...

SER's zijn afgeleid van het blastocyststadium van een pre-implantatie-embryo1. Als pluripotente stamcellen hebben SER's het vermogen om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in elk type embryonale cel. Vanwege hun opmerkelijke ontwikkelingspotentieel en proliferatieve capaciteit op lange termijn zijn SER's uiterst waardevol voor biomedisch onderzoek1. De huidige onderzoeksinspanningen hebben zich grotendeels gericht op het therapeutisch potentieel van SER's voor een verscheidenheid aan belangrijke pathologische aandoeningen, waaronder diabetes, hartaandoeningen en neurodegeneratieve ziekten2,3,4.
Van zoogdiercellen, waaronder SER's, is bekend dat ze blaasjes met variabele grootte afgeven aan de extracellulaire omgeving, en deze EV's bezitten veel fysiologische en pathologische functies vanwege hun rol in intercellulaire communicatie5. Onder verschillende subtypen van EV's zijn exosomen kleine membraanblaasjes die vrijkomen uit verschillende celtypen in de extracellulaire ruimte bij fusie van intermediaire endocytische compartimenten, multivesiculaire lichamen (MWB's), met het plasmamembraan6. Van exosomen is gemeld dat ze intercellulaire communicatie bemiddelen en zijn kritisch betrokken bij veel (patho)fysiologische processen7,8. Exosomen erven sommige biologische functies van hun eigen ouderlijke cellen, omdat exosomen biologische materialen bevatten die uit het cytosol zijn verkregen, waaronder eiwitten en nucleïnezuren. De geassocieerde antigenen of factoren die de immuunrespons specifiek voor een bepaalde ziekte stimuleren, zijn dus ingekapseld in de exosomen van bepaalde soorten cellen9. Dit maakte de weg vrij voor klinische onderzoeken naar tumor-afgeleide exosomen als een anti-kankervaccin10.
GM-CSF is een cytokine uitgescheiden door verschillende soorten immuuncellen11. Opkomend bewijs toont aan dat GM-CSF het immuunsysteem activeert en reguleert en een essentiële rol speelt in het antigeen-presenterende proces12. Een klinisch rapport suggereert bijvoorbeeld dat GM-CSF de immuunrespons op tumoren stimuleert als een vaccinadjuvans13. Verschillende gm-csf-gebaseerde kanker immunotherapie strategieën om de krachtige immuunstimulerende activiteit van GM-CSF te benutten zijn onderzocht in klinische onderzoeken14. Onder deze, een kankervaccin samengesteld uit bestraalde GM-CSF-afscheidende tumorcellen heeft enige belofte getoond bij gevorderde melanoompatiënten door cellulaire en humorale antitumorreacties en daaropvolgende necrose in uitgezaaide tumoren te induceren15.
Omdat de exosomen afgeleid van SER's vergelijkbare biologische activiteiten hebben als de oorspronkelijke SER's, kunnen GM-CSF-dragende exosomen van SER's misschien functioneren als celvrije blaasjes om de immuunrespons te reguleren. In dit artikel wordt een gedetailleerde methode beschreven om hoogwaardige exosoom-verrijkte EV's te produceren van SER's die GM-CSF tot expressie geven. Deze exosoom-verrijkte EV's hebben het potentieel om te dienen als immuunregulerende blaasjes om de immuunrespons te moduleren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphate, Calf Intestinal</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>Dephosphorylating DNA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Annexin V mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone H-3, sc-74438</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_1118989</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD81 mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone B-11, sc-166029</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_2275892</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome c mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone A-8, sc-13156</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_627385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flotillin-1 mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone C-2; sc-74566</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_2106563</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH pAb</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>600-401-A33S</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_11182910</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31430</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_228307</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>clone 20E8C12 A21348</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_221509</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ADI-SPA-890</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_10616242</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31460</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_228341</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA (bicinchoninic acid) assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23223</td>
			<td>Determining protein concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M42015</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin, Disodium Salt</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10177012</td>
			<td>Selecting E. coli colonies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Avanti J-26 XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge rotor, JA-10</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>09U1597</td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottle, Nalgene PPCO</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3120-0500PK</td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu grids with carbon support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF200-Cu</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0101</td>
			<td>Digesting DNA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced chemiluminescence detection system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>32106</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACScalibur flow cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Examining GFP levels of ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRR-30-2020</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Filtering ES-D3 cells for FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (0.1%)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ES006B</td>
			<td>Culturing ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF ELISA kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88733422</td>
			<td>Determining GM-CSF concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10-829-018</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRL0131-0100</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfecting ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader, PowerWave XS</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Determining GM-CSF concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP high-speed cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Isolating single ES-D3 cell clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2988J</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10-131-035</td>
			<td>Selecting ES-D3 clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat dry milk</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9022655</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Transfecting ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>sc45000-652</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>37270</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membranes</td>
			<td>Millipore EMD</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligation Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HT7700</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-660</td>
			<td>Culturing ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor, 45Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>09U4454</td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge polycarbonate bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UranyLess staining solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22409</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of exosome-enriched extracellular vesicles carrying granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from embryonic stem cells

Embryonale stamcellen (SER's) zijn pluripotente stamcellen die in staat zijn tot zelfvernieuwing en differentiatie in alle soorten embryonale cellen. Net als veel andere celtypen geven SER's kleine membraanblaasjes, zoals exosomen, af aan de extracellulaire omgeving. Exosomen dienen als essentiële bemiddelaars van intercellulaire communicatie en spelen een basisrol in veel (patho)fysiologische processen. Granulocyte-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) functioneert als een cytokine om de immuunrespons te moduleren. De aanwezigheid van GM-CSF in exosomen heeft het potentieel om hun immuunregulerende functie te stimuleren. Hier werd GM-CSF stabiel overexpressie in de muriene ESC-cellijn ES-D3. Er werd een protocol ontwikkeld om hoogwaardige exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes (EV's) te isoleren uit ES-D3-cellen die GM-CSF overexpressie geven. Geïsoleerde exosoom-verrijkte EV's werden gekenmerkt door een verscheidenheid aan experimentele benaderingen. Belangrijk is dat aanzienlijke hoeveelheden GM-CSF aanwezig bleken te zijn in exosoom-verrijkte EV's. Over het algemeen kunnen GM-CSF-dragende exosoom-verrijkte EV's van SER's functioneren als celvrije blaasjes om hun immuunregulerende activiteiten uit te oefenen.

GM-CSF is overexpressie in murine SER's. Om GM-CSF stabiel te overexpressie in ES-D3-cellen, werd murine GM-CSF cDNA gekloond in een transfectievector om de expressievector pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP te genereren (Figuur 1A). GM-CSF was overexpressie in ES-D3-cellen door transfectie en ongeveer 20% van de tijdelijk getransfecteerde ES-D3-cellen was GFP-positief. Celklonen die GM-CSF stabiel overexpressie of de lege vectorco...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Deze studie beschrijft een methode om exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes te isoleren die immuunstimulerende granulocyten macrofaagkolonie-stimulerende factoren dragen uit embryonale stamcellen.

Isolatie van exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes met granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor uit embryonale stamcellen

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Ons protocol kan worden gebruikt om exosoom-verrijkte extracellulaire blaasjes van hoge kwaliteit te produceren uit embryonale stamcellen die de immuunstimulerende factor, GM-CSF, tot expressie brengen. Exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes die GM-CSF dragen, hebben het potentieel om een celvrije immuunregulerende blaasjes te dienen die de immuunrespons kunnen moduleren. Onderzoekers met de basis moleculaire en cellulaire biologie training, zou in staat moeten zijn om dit protocol gemakkelijk te kunnen, maar iedereen die dit protocol voor de eerste keer uitvoert, moet de aanwijzingen nauwlettend volgen.Omdat ons protocol ingewikkeld is, zal het visualiseren van de ingewikkelde details van elke stap andere onderzoekers helpen om exosoomvrije FBS te genereren, het gewenste volume FBS ultracentrifugeren en het exosoomvrije supernatant verzamelen. Voordat u de ESD drie cellen plateert, bedekt u 15 centimeter weefselkweekschalen met 0,1% gelatine bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Verwijder gelatine door aspiratie en kweek de ESD drie cellen zonder feederlaag cellen in ESD drie cel kweekmedium bij 37 graden Celsius in 5% Kooldioxide bevochtigde incubator totdat de cellen 90% confluency bereiken.Was de bijna samenvloeiende culturen met vijf milliliter 0,05% trypsine per gerecht gevolgd door een incubatie van vijf minuten bij 37 graden Celsius in verse trypsine. Trek aan het einde van de incubatie de losgemaakte cellen in een centrifugebuis en inactiveer de trypsine met vijf milliliter vers kweekmedium. Bezink de cellen door centrifugering en suspensie de pallets opnieuw in vers medium voor het tellen Voor het passeren, plaat vijf keer 10 tot de zesde van de ESD drie cellen in 15 milliliter celkweekmedium op nieuwe gelatine gecoate platen gedurende drie dagen cultuur voordat de cellen worden gesubkweekt Om de celcultuursupernatant te verzamelen voor de isolatie van exosoom verrijkte extracellulaire blaasjesplaat één keer 10 tot de zevende ESD drie cellen in 15 milliliter celkweekmedium per nieuwe gelatine gecoate plaat gedurende drie dagen voorafgaand aan het verzamelen van de celkweeksupernatanten Voor exosoom verrijkte extra cellulaire blaasjesisolatie, Eerst sediment de grote celfragmenten in de supernatanten verzameld uit 72 uur gekweekte ESD drie cellen door centrifugatie.Na het verzamelen van het supernatant, ultracentrifugeer de monsters en gooi de supernatanten weg. Spoel elke pallette voorzichtig twee keer met één milliliter PBS per wasbeurt om eventuele resterende cultuur supernatant te verwijderen en kwantificeer het exosoom verrijkte extracellulaire blaasje-eiwitgehalte met een Bicinchoninic acid-test, volgens de instructies van de fabrikant. Vervolgens suspensies de exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes in PBS met een concentratie van zes microgram per micrometer voor opslag bij min 80 graden Celsius.Om de exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes te visualiseren door transmissie elektronenmicroscopie fixeren drie tot vijf microgram per milliliter van de extracellulaire blaasjes met de uiteindelijke concentratie van 2% elektronenmicroscoop raster paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Laad aan het einde van de incubatie 10 microliter van de vaste monsters gedurende één minuut op copper grids met koolstofondersteuningsfilm voordat u de roosters met filterpapier aftapt, blijf in de roosters met een geschikte kleuringsoplossing, volgens het protocol van de fabrikant en gebruik een pincet om de roosters over te brengen naar een stuk filterpapier, gebruik vervolgens de transmissie-elektronenmicroscoop met een vergroting van 50.000 keer om elektronenmicroscopiebeelden te verkrijgen, volgens de standaardprotocollen. Om hele celextracten te bereiden, verzamelt u ESD drie cellen uit de kweek zoals aangetoond en suspenseert u de geoogste cellen opnieuw in PBS voor het tellen.Na een tweede centrifugatie, suspensie de cellen opnieuw van vijf keer 10 tot de derde cellen per microliter SDS-paginalaadbuffer met 0,5% SDS-concentratie en Sonicate de monsters gedurende 10 seconden op een Sonicator met een amplitude van 10%. Verwarm de monsters vervolgens gedurende vijf minuten op 100 graden Celsius. Om lysaten voor te bereiden op de exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes, suspensie de exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes opnieuw op in SDS-paginalaadbuffer met 0,5% SDS bij een concentratie van 1,2 microgram per microliter en soniceer de monsters gedurende 10 seconden zoals gedemonstreerd en verwarm de monsters vervolgens gedurende vijf minuten op 100 graden Celsius.Voor Western Blot-analyse laadt u 10 microliter groothandelsextract en exosoom verrijkte extracellulaire blaasjeslysaatmonsters in individuele putten van een beste stresspaginagel. Breng aan het einde van de run de eiwitten over op PVDF-membranen en incubeer de membranen met de juiste primaire en secundaire antilichamen van belang, detecteer vervolgens de eiwitexpressie met behulp van een verbeterde chemiluminescentiedetectiekit, volgens de instructies van de fabrikant. Om de hoeveelheid GM-CSF in exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes te evalueren, gebruikt u een kit Murine GM-CSF om een ELISA-plaat te coaten met anti GM-CSF-opvangantilichaam, behandel vervolgens 0,6 microgram exosoom verrijkte extracellulaire blaasjesmonsters met 100 microliter PBS alleen, of PBS plus 0,05% tween 20 bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.Voeg aan het einde van de incubatie de behandelde monsters toe aan afzonderlijke putten van de voorbereide ELISA-plaat gedurende een incubatie van één uur bij kamertemperatuur, gevolgd door het wassen van de juiste overeenkomstige putten met alleen PBS, of PBS plus 0,05% tween 20. Voeg na de wasbeurt het detectie-antilichaam toe aan de monsters gedurende een incubatie van een uur bij kamertemperatuur, gevolgd door een wasbeurt met PBS alleen of PBS plus 0,05% tween 20 zoals aangetoond, voeg vervolgens Avidin Mierikswortelperoxidase toe aan de monsters gedurende een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door een wasbeurt en het meten van de absorptie in elke put op een microplaatlezer op 450 nanometer. De GFP-fluorescentie-intensiteit van een GM-CSF die ESD-driecellige lijn tot expressie brengt of een ESD-driecellige lijn die een lege vector tot expressie brengt, is veel hoger dan die van hun ouderlijke tegenhangers.ELISA onthult dat ESD drie cellen die GM-CSF tot expressie brengen aanzienlijk hogere niveaus van GMCSF produceren in hun celkweek supernatant dan lege vectorcontrolecellen. Bovendien is de hoeveelheid GM-CSF die wordt gegenereerd door GM-CSF die ESD-drie cellen tot expressie brengen, vergelijkbaar met die geproduceerd door STO-fibroblasten die GM-CSF tot expressie brengen. Transmissie-elektronenmicroscopie van extracellulaire blaasjes geïsoleerd uit vector getransduceerde en GM-CSF getransduceerde celculturen onthullen blaasjes van verschillende grootte die binnen het verwachte diameterbereik van 30 tot 100 nanometer vallen.De expressie van exosomale markers, waaronder CD81, Annexine V en flotilline-1, is aanzienlijk verbeterd in extracellulaire blaasjes, geïsoleerd uit ESD-drie cellen in vergelijking met overeenkomstige groothandelsextracten door Western blot-analyse. Belangrijk is dat de aanwezigheid van andere subcellulaire compartimentmarkers in ESD drie afgeleide extracellulaire blaasjes niet werd gedetecteerd, waaronder de endoplasmatische reticulummarker, Protein Disulfide Isomerase, de mitochondriale markers, cytochroom C en Oxphos complex IV-subunit IV en de cytosolische marker GAPDH. Na het wassen met 0,05% tween 20, waren de gm-csf-waarden op de achtergrond die werden gedetecteerd in de extracellulaire blaasjes van de controle aanzienlijk verminderd.Daarentegen waren de GM-CSF-niveaus in de extracellulaire blaasjes van GM-CSF-expressiecellen significant verhoogd met tween 20. Het verkrijgen van hoogwaardige exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes met GMCSF is de belangrijkste stap voor het succes van dit protocol. Onderzoekers kunnen aanvullende experimenten uitvoeren, zoals studies in GM-CSF-afhankelijke cellijnen en dieren om te bepalen of exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes die GM-CSF verzorgen, kunnen functioneren als celvrije immuunregulerende blaasjes.Deze exosoom verrijkte extracellulaire blaasjes kunnen vervolgens worden gebruikt om te onderzoeken hoe modulatie van de immuunrespons verschillende ziekteomstandigheden beïnvloedt.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasief gedrag van menselijke borstkankercellen in embryonale zebravis

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

De DNA-kleurstof geactiveerde zijbevolkingsfenotype gebruiken om de kankerstamcellen van biologische monsters te detecteren en te zuiveren

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Een preklinische muismodel van osteosarcoom definiëren de extracellulaire vesikel-gemedieerde communicatie tussen Tumor en mesenchymale stamcellen

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolatie en karakterisering van tumor initiërende cellen uit Sarcoom patiënt-afgeleide xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolatie van menselijke endotheliale cellen van normale Colon en colorectaal carcinoom - een verbeterde Protocol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymale stamcellen isolatie uit Pulp weefsel en co cultuur met kankercellen te bestuderen van hun interacties

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Winning van extracellulaire blaasjes uit hele weefsel

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Ruimtelijke en temporele controle van muizen melanoom initiatie van mutant melanocyt stamcellen

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolatie van stam-achtige cellen uit 3-dimensionale Spheroid-culturen

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolatie en functionele beoordeling van menselijke borstkankerstamcellen uit cel- en weefselmonsters

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...