Name: isolation of exosome-enriched extracellular vesicles carrying granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from embryonic stem cells
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Nous sommes reconnaissants à M. Arkadiusz Slusarczyk et au Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) d’avoir acquis des images au microscope électronique à transmission. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions des NIH AA018016-01 (J.W.E.), du Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), des NIH CA106599 et CA175003 (C.L.), nih CA198249 (K.Y.) et Free to Breathe Research Grant (K.Y.).

1. Cultiver des cellules ES-D3
<ol><li>Pour générer du sérum bovin fœtal (FBS) sans exosomes, chargez FBS dans une ultracentrifugeuse et centrifugez à 100 000 x g pendant 16 h à 4 °C. Après la centrifugation, prélever le surnageant sérique sous forme de FBS sans exosomes pour la culture de la lignée cellulaire murine ESC ES-D3 et l’acquisition de VE enrichis en exosomes.</li>
	<li>Avant de plaquer les cellules ES-D3, recouvrir des boîtes de culture tissulaire de 15 cm à l’aide de gélatine (0...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Sakthiswary, R., Raymond, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+in+neurodegenerative+diseases:+From+principles+to+practice.">Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice.</a> Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).</li><li>Liu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+restore+function+in+infarcted+hearts+of+non-human+primates.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).</li><li>Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+for+type+1+diabetes+mellitus.">Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).</li><li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles.">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).</li><li>Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Presentation+by+Extracellular+Vesicles+from+Professional+Antigen-Presenting+Cells.">Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells.</a> Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).</li><li>Kunigelis, K. E., Graner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dichotomy+of+Tumor+Exosomes+(TEX)+in+Cancer+Immunity:+Is+It+All+in+the+ConTEXt?.">The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?.</a> Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).</li><li>Becher, B., Tugues, S., Greter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF:+From+Growth+Factor+to+Central+Mediator+of+Tissue+Inflammation.">GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation.</a> Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).</li><li>Conti, L., Gessani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+in+the+generation+of+dendritic+cells+from+human+blood+monocyte+precursors:+recent+advances.">GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances.</a> Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).</li><li>Higano, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+data+from+2+randomized,+double-blind,+placebo-controlled,+phase+3+trials+of+active+cellular+immunotherapy+with+sipuleucel-T+in+advanced+prostate+cancer.">Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer.</a> Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).</li><li>Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+GM-CSF-based+cancer+immunotherapy.">Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy.</a> Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).</li><li>Dranoff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+irradiated+tumor+cells+engineered+to+secrete+murine+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+potent,+specific,+and+long-lasting+anti-tumor+immunity.">Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).</li><li>Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1,+Unit+1C+4,+Culture+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).</li><li>Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+fluorescence+intensity+and+protein+expression+in+HeLa+cells+stably+transfected+with+hrGFP.">Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP.</a> Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+of+hrGFP+by+mouse+embryonic+stem+cells:+promoter+activity+in+the+undifferentiated+state+and+during+dopaminergic+neural+differentiation.">Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation.</a> Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).</li><li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+embryonic+stem+cells+protects+against+lung+cancer:+is+a+broad-spectrum+prophylactic+vaccine+against+cancer+possible?.">Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?.</a> PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).</li><li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent:+primary+neurons,+siRNA,+and+high-throughput+applications.">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Unit+3+22,+Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+for+Immunoregulation+and+Therapeutic+Intervention+in+Cancer.">Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer.</a> Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).</li><li>Bunggulawa, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+the+use+of+exosomes+as+drug+delivery+systems.">Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems.</a> Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).</li><li>Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proviral+silencing+in+embryonic+cells+is+regulated+by+Yin+Yang+1.">Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1.</a> Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).</li><li>Dranoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF-based+cancer+vaccines.">GM-CSF-based cancer vaccines.</a> Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Feeder+Cell+Types+on+Culture+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+In+Vitro.">Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro.</a> Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).</li><li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).</li><li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+GM-CSF+expressing+embryonic+stem+cells+are+an+effective+prophylactic+vaccine+for+cancer+prevention.">Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention.</a> OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).</li></ol>

Cette étude montre une méthode très efficace de production de VE enrichis en exosomes portant la protéine immunostimulatrice GM-CSF, qui peut être utilisée pour étudier les effets immunomodulateurs des VE enrichis en exosomes. Plusieurs études suggèrent que les exosomes présentent des fonctions immunorégulatrices etantitumorales 22. Ainsi, les exosomes des CSE exprimant le GM-CSF pourraient également posséder des activités biologiques qui régulent la réponse immunitaire. Dans ce pr...

Les CSE sont dérivés du stade de blastocyste d’un embryon préimplantatoire1. En tant que cellules souches pluripotentes, les CSE ont la capacité de s’auto-renouveler et de se différencier en tout type de cellule embryonnaire. En raison de leur potentiel de développement remarquable et de leur capacité proliférative à long terme, les CES sont extrêmement précieux pour la recherche biomédicale1. Les efforts de recherche actuels se sont largement concentrés sur le potentiel thérapeutique des CSE pour une variété de troubles pathologiques majeurs, y compris le diabète, les maladies cardiaques et les maladies neurodégénératives2,3,4.
Les cellules de mammifères, y compris les CSE, sont connues pour libérer des vésicules de tailles variables dans l’environnement extracellulaire, et ces VE possèdent de nombreuses fonctions physiologiques et pathologiques en raison de leur rôle dans la communication intercellulaire5. Parmi les différents sous-types de VE, les exosomes sont de petites vésicules membranaires libérées par divers types de cellules dans l’espace extracellulaire lors de la fusion de compartiments endocytaires intermédiaires, de corps multivésiculaires (M MVB), avec la membraneplasmique 6. Il a été rapporté que les exosomes médient la communication intercellulaire et sont impliqués de manière critique dans de nombreux processus (patho)physiologiques7,8. Les exosomes héritent de certaines fonctions biologiques de leurs propres cellules parentales, car les exosomes contiennent des matériaux biologiques acquis à partir du cytosol, y compris des protéines et des acides nucléiques. Ainsi, les antigènes associés ou les facteurs stimulant la réponse immunitaire spécifique à une maladie donnée sont encapsulés dans les exosomes de types particuliers de cellules9. Cela a ouvert la voie à des essais cliniques explorant les exosomes dérivés de tumeurs en tant que vaccin anticancéreux10.
Gm-CSF est une cytokine sécrétée par différents types de cellules immunitaires11. De nouvelles preuves démontrent que le GM-CSF active et régule le système immunitaire et joue un rôle essentiel dans le processus de présentation de l’antigène12. Par exemple, un rapport clinique suggère que le GM-CSF stimule la réponse immunitaire aux tumeurs en tant qu’adjuvantvaccinal 13. Plusieurs stratégies d’immunothérapie du cancer à base de GM-CSF pour exploiter la puissante activité immunostimulatrice du GM-CSF ont été étudiées dans des essais cliniques14. Parmi ceux-ci, un vaccin anticancéreux composé de cellules tumorales sécrérant du GM-CSF irradiées s’est révélé prometteur chez les patients atteints de mélanome avancé en induisant des réponses antitumorales cellulaires et humorales et une nécrose ultérieure dans les tumeurs métastasées15.
Parce que les exosomes dérivés des CSE possèdent des activités biologiques similaires à celles des CES d’origine, peut-être que les exosomes porteurs de GM-LCR des CES pourraient fonctionner comme des vésicules sans cellules pour réguler la réponse immunitaire. Dans cet article, une méthode détaillée pour produire des VÉHICULES enrichis en exosomes de haute qualité à partir de CES exprimant gm-CSF est décrite. Ces VE enrichis en exosomes ont le potentiel de servir de vésicules immunorégulatrices pour moduler la réponse immunitaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphate, Calf Intestinal</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>Dephosphorylating DNA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Annexin V mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone H-3, sc-74438</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_1118989</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD81 mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone B-11, sc-166029</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_2275892</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome c mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone A-8, sc-13156</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_627385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flotillin-1 mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone C-2; sc-74566</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_2106563</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH pAb</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>600-401-A33S</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_11182910</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31430</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_228307</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>clone 20E8C12 A21348</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_221509</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ADI-SPA-890</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_10616242</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31460</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_228341</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA (bicinchoninic acid) assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23223</td>
			<td>Determining protein concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M42015</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin, Disodium Salt</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10177012</td>
			<td>Selecting E. coli colonies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Avanti J-26 XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge rotor, JA-10</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>09U1597</td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottle, Nalgene PPCO</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3120-0500PK</td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu grids with carbon support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF200-Cu</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0101</td>
			<td>Digesting DNA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced chemiluminescence detection system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>32106</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACScalibur flow cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Examining GFP levels of ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRR-30-2020</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Filtering ES-D3 cells for FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (0.1%)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ES006B</td>
			<td>Culturing ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF ELISA kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88733422</td>
			<td>Determining GM-CSF concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10-829-018</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRL0131-0100</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfecting ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader, PowerWave XS</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Determining GM-CSF concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP high-speed cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Isolating single ES-D3 cell clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2988J</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10-131-035</td>
			<td>Selecting ES-D3 clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat dry milk</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9022655</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Transfecting ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>sc45000-652</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>37270</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membranes</td>
			<td>Millipore EMD</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligation Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HT7700</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-660</td>
			<td>Culturing ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor, 45Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>09U4454</td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge polycarbonate bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UranyLess staining solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22409</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of exosome-enriched extracellular vesicles carrying granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from embryonic stem cells

Les cellules souches embryonnaires (CSE) sont des cellules souches pluripotentes capables de s’auto-renouveler et de se différencier en tous types de cellules embryonnaires. Comme beaucoup d’autres types de cellules, les CSE libèrent de petites vésicules membranaires, telles que des exosomes, dans l’environnement extracellulaire. Les exosomes servent de médiateurs essentiels de la communication intercellulaire et jouent un rôle fondamental dans de nombreux processus (patho)physiologiques. Le facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF) fonctionne comme une cytokine pour moduler la réponse immunitaire. La présence de GM-CSF dans les exosomes a le potentiel de renforcer leur fonction immunorégulatrice. Ici, gm-CSF a été surexprimé de manière stable dans la lignée cellulaire murine ESC ES-D3. Un protocole a été développé pour isoler des vésicules extracellulaires (VE) enrichies en exosomes de haute qualité à partir de cellules ES-D3 surexprimant le GM-CSF. Les véhicules électriques isolés enrichis en exosomes ont été caractérisés par une variété d’approches expérimentales. Il est important de se trouver des quantités importantes de GM-CSF dans les véhicules électriques enrichis en exosomes. Dans l’ensemble, les VE enrichis en exosomes porteurs de GM-CSF provenant de CES pourraient fonctionner comme des vésicules sans cellules pour exercer leurs activités immunorégulatrices.

Gm-CSF est surexprimé dans les ESC murins. Pour surexprimer de manière stable le GM-CSF dans les cellules ES-D3, l’ADNc GM-CSF murin a été cloné dans un vecteur de transfection pour générer le vecteur d’expression pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (Figure 1A). Le GM-CSF a été surexprimé dans les cellules ES-D3 par transfection, et environ 20% des cellules ES-D3 transfectées transitoirement étaient GFP-positives. De...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Cette étude décrit une méthode pour isoler des vésicules extracellulaires enrichies en exosomes porteuses de facteurs de stimulation des colonies de macrophages granulocytaires immunostimulants à partir de cellules souches embryonnaires.

Isolement de vésicules extracellulaires enrichies en exosomes transportant un facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages à partir de cellules souches embryonnaires

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Notre protocole peut être utilisé pour produire des vésicules extracellulaires enrichies en exosomes de haute qualité à partir de cellules souches embryonnaires qui expriment le facteur de stimulation immunitaire, GM-CSF. Les vésicules extracellulaires enrichies en exosomes porteuses de GM-CSF ont le potentiel de servir de vésicules régulatrices immunitaires sans cellules qui peuvent moduler la réponse immunitaire. Les chercheurs ayant une formation de base en biologie moléculaire et cellulaire devraient être en mesure de suivre facilement ce protocole, mais toute personne effectuant ce protocole pour la première fois devrait suivre les instructions de près.Comme notre protocole est compliqué, visualiser les détails complexes de chaque étape aidera d’autres chercheurs à générer des FBS sans exosomes, à ultracentrifuger le volume souhaité de FBS et à collecter le surnageant libre d’exosomes. Avant de plaquer les trois cellules ESD, recouvrir les boîtes de culture tissulaire de 15 centimètres de 0,1% de gélatine à température ambiante pendant 30 minutes. Retirer la gélatine par aspiration et culture les trois cellules ESD sans cellules de la couche nourricière dans un milieu de culture à trois cellules ESD à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié au dioxyde de carbone à 5% jusqu’à ce que les cellules atteignent 90% de confluence.Laver les cultures presque confluentes avec cinq millilitres de trypsine à 0,05% par plat, suivis d’une incubation de cinq minutes à 37 degrés Celsius dans de la trypsine fraîche. À la fin de l’incubation, tirez les cellules détachées dans un tube de centrifugeuse et inactivez la trypsine avec cinq millilitres de milieu de culture frais. Sédimenter les cellules par centrifugation et re-suspendre les palettes dans un milieu frais pour le comptage Pour le passage, plaque cinq fois 10 à la sixième de l’ESD trois cellules dans 15 millilitres de milieu de culture cellulaire sur de nouvelles plaques enduites de gélatine pendant trois jours de culture avant de sous-cultiver les cellules Pour collecter le surnageant de culture cellulaire pour l’isolement des vésicules extracellulaires enrichies en exosomes plaque une fois 10 à la septième ESD trois cellules sur 15 millilitres de milieu de culture cellulaire par nouvelle plaque revêtue de gélatine pendant trois jours avant la collecte des surnageants de culture cellulaire Pour l’isolement des vésicules extracellulaires enrichies en exosomes, d’abord sédimenter les gros fragments cellulaires dans les surnageants collectés à partir de trois cellules ESD cultivées pendant 72 heures par centrifugation.Après avoir recueilli le surnageant, Ultracentrifuge les échantillons et jeter les surnageants. Rincez doucement chaque palette deux fois avec un millilitre de PBS par lavage pour éliminer tout surnageant de culture résiduel et quantifier la teneur en protéines de vésicules extracellulaires enrichies en exosomes avec un test d’acide bicinchoninique, selon les instructions du fabricant. Ensuite, re-suspendez les vésicules extracellulaires enrichies en exosomes dans le PBS à une concentration de six microgrammes par micromètre pour un stockage à moins 80 degrés Celsius.Pour visualiser les vésicules extracellulaires enrichies en exosomes par microscopie électronique à transmission, fixez trois à cinq microgrammes par millilitre des vésicules extracellulaires avec la concentration finale de paraformaldéhyde de grille de microscope électronique à 2% à température ambiante pendant deux heures. À la fin de l’incubation, chargez 10 microlitres des échantillons fixes sur des grilles de cuivre avec un film de support en carbone pendant une minute avant de vider les grilles avec du papier filtre, restez dans les grilles avec une solution de coloration appropriée, conformément au protocole du fabricant et utilisez une pince à épiler pour transférer les grilles sur un morceau de papier filtre, puis utilisez le microscope électronique à transmission avec un grossissement de 50 000 fois pour acquérir des images de microscopie électronique, selon les protocoles standard. Pour préparer des extraits de cellules entières, prélevez trois cellules ESD de la culture comme démontré, et re-suspendez les cellules récoltées dans PBS pour le comptage.Après une deuxième centrifugation, re-suspendre les cellules de cinq fois 10 à la troisième cellule par microlitre de tampon de chargement de page SDS contenant une concentration de 0,5% de SDS et Sonicate les échantillons pendant 10 secondes sur un Sonicator avec une amplitude de 10%. Ensuite, chauffez les échantillons à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes. Pour préparer les lysates pour les vésicules extracellulaires enrichies en exosomes, re-suspendez les vésicules extracellulaires enrichies en exosomes dans un tampon de chargement de page SDS contenant 0,5% de FDS à une concentration de 1,2 microgramme par microlitre et Sonicate les échantillons pendant 10 secondes comme démontré, puis chauffez les échantillons à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes.Pour l’analyse Western Blot, chargez 10 microlitres d’extrait en gros et d’échantillons de lysate de vésicules extracellulaires enrichis en exosomes dans des puits individuels d’un meilleur gel de page de stress. À la fin de l’exécution, transférez les protéines sur des membranes PVDF et incubez les membranes avec les anticorps primaires et secondaires appropriés d’intérêt, puis détectez l’expression des protéines à l’aide d’un kit de détection de chimiluminescence amélioré, selon les instructions du fabricant. Pour évaluer la quantité de GM-CSF dans les vésicules extracellulaires enrichies en exosomes, utilisez un kit Murine GM-CSF pour recouvrir une plaque ELISA d’anticorps anti-GM-CSF capture ensuite, traiter 0,6 microgrammes d’échantillons de vésicules extracellulaires enrichies en exosomes avec 100 microlitres de PBS seul, ou PBS plus 0,05% interpolation 20 à température ambiante pendant 30 minutes.À la fin de l’incubation, ajouter les échantillons traités aux puits individuels de la plaque ELISA préparée pour une incubation d’une heure à température ambiante suivie du lavage des puits correspondants appropriés avec PBS seul, ou PBS plus 0,05% tween 20. Après le lavage, ajouter l’anticorps de détection aux échantillons pour une incubation d’une heure à température ambiante suivie d’un lavage avec DU PBS seul ou du PBS plus 0,05% entre 20 comme démontré, Puis ajouter la peroxydase de raifort Avidin aux échantillons pour une incubation de 30 minutes à température ambiante, suivie d’un lavage et de la mesure de l’absorbance dans chaque puits sur un lecteur de microplaques à 450 nanomètres. L’intensité de fluorescence GFP d’un GM-CSF exprimant une lignée cellulaire ESD trois ou d’une lignée ESD trois cellules exprimant un vecteur vide est beaucoup plus élevée que celle de leurs homologues parentaux.ELISA révèle que trois cellules EXPRIMANT GM-CSF produisent des niveaux nettement plus élevés de GMCSF dans leur surnageant de culture cellulaire que les cellules de contrôle vectoriel vides. En outre, la quantité de GM-CSF générée par GM-CSF exprimant trois cellules ESD est similaire à celle produite par les fibroblastes STO exprimant GM-CSF. La microscopie électronique à transmission de vésicules extracellulaires isolées à partir de cultures cellulaires transduies vectorielles et transduies par GM-CSF révèle des vésicules de différentes tailles qui se situent dans la plage de diamètre attendue de 30 à 100 nanomètres.L’expression des marqueurs exosomaux, y compris CD81, Annexine V et flottilline-1, est nettement améliorée dans les vésicules extracellulaires, isolées à partir de trois cellules ESD par rapport aux extraits de gros correspondants par analyse par transfert Western. Il est important de noter que la présence d’autres marqueurs de compartiments subcellulaires dans trois vésicules extracellulaires dérivées d’ESD n’a pas été détectée, y compris le marqueur de réticulum endoplasmique, l’isomérase de disulfure de protéine, les marqueurs mitochondriaux, le cytochrome C et le complexe Oxphos IV-sous-unité IV et le marqueur cytosolique GAPDH. Après lavage à 0,05% entre 20, les niveaux de GM-CSF de fond détectés dans les vésicules extracellulaires témoins ont été considérablement réduits.En revanche, les niveaux de GM-CSF dans les vésicules extracellulaires des cellules exprimant gm-CSF ont été significativement augmentés entre 20. L’acquisition de vésicules extracellulaires enrichies en exosomes de haute qualité portant GMCSF est l’étape la plus importante pour le succès de ce protocole. Les chercheurs peuvent effectuer des expériences supplémentaires, telles que des études sur des lignées cellulaires et des animaux dépendants du GM-CSF pour déterminer si les vésicules extracellulaires enrichies en exosomes soignant le GM-CSF peuvent fonctionner comme des vésicules régulatrices immunitaires sans cellules.Ces vésicules extracellulaires enrichies en exosomes peuvent ensuite être utilisées pour explorer comment la modulation de la réponse immunitaire affecte différentes maladies.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Comportement invasif des cellules cancéreuses du sein humain dans Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Tirer parti du phénotype de population latérale déclenchée par l&#39;ADN pour détecter et purifier les cellules souches du cancer à partir d&#39;échantillons biologiques

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Un modèle de souris préclinique de l’ostéosarcome pour définir la Communication médiée par les vésicules extracellulaire entre la tumeur et les cellules souches mésenchymateuses

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolement et caractérisation des cellules initiatrices de tumeurs des xénogreffes dérivées du sarcome

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolement des cellules endothéliales humaines du côlon Normal et carcinome Colorectal - un protocole amélioré

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu de pulpe et co-culture avec les cellules cancéreuses afin d’étudier leurs Interactions

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Extraction des vésicules extracellulaires du tissu entier

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Contrôle spatial et temporel de l’initiation du mélanome murin à partir de cellules souches de mélanocytes mutants

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolement des cellules souches des cultures sphéroïdes tridimensionnelles

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolement et évaluation fonctionnelle des cellules souches du cancer du sein humain à partir d’échantillons de cellules et de tissus

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...