Name: isolation of exosome-enriched extracellular vesicles carrying granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from embryonic stem cells
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells at JoVE.com

透過型電子顕微鏡画像を取得してくれたアルカディウシュ・スルサルチク氏とケンタッキー州生物医学研究基盤ネットワーク(KBRIN、P20GM103436)に感謝しています。この研究の一環として、NIH AA018016-01(J.W.E.)、ケンタッキー州連邦リサーチチャレンジトラストファンド(J.W.E.)、NIH CA106599、CA175003(C.L.)、NIH CA198249(K.Y.)、フリー・オブ・ブレス・リサーチ・グラント(K.Y.)からの助成金が支えられました。

1. ES-D3細胞の培養
<ol><li>エキソソームフリーウシ血清(FBS)を生成するには、FBSを超遠心分離機に、遠心分離機を100,000 x g で4°Cで16時間ロードします。 遠心分離後、マウスESC細胞株ES-D3を培養し、エキソソームエンリッチEVを取得するためのエキソソームフリーFBSとして血清上清を収集します。</li>
	<li>ES-D3細胞をめっきする前に、ゼラチン(0.1%)を室温で30分間使用して15cmの組織培養皿を?...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Sakthiswary, R., Raymond, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+in+neurodegenerative+diseases:+From+principles+to+practice.">Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice.</a> Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).</li><li>Liu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+restore+function+in+infarcted+hearts+of+non-human+primates.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).</li><li>Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+for+type+1+diabetes+mellitus.">Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).</li><li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles.">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).</li><li>Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Presentation+by+Extracellular+Vesicles+from+Professional+Antigen-Presenting+Cells.">Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells.</a> Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).</li><li>Kunigelis, K. E., Graner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dichotomy+of+Tumor+Exosomes+(TEX)+in+Cancer+Immunity:+Is+It+All+in+the+ConTEXt?.">The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?.</a> Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).</li><li>Becher, B., Tugues, S., Greter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF:+From+Growth+Factor+to+Central+Mediator+of+Tissue+Inflammation.">GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation.</a> Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).</li><li>Conti, L., Gessani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+in+the+generation+of+dendritic+cells+from+human+blood+monocyte+precursors:+recent+advances.">GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances.</a> Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).</li><li>Higano, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+data+from+2+randomized,+double-blind,+placebo-controlled,+phase+3+trials+of+active+cellular+immunotherapy+with+sipuleucel-T+in+advanced+prostate+cancer.">Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer.</a> Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).</li><li>Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+GM-CSF-based+cancer+immunotherapy.">Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy.</a> Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).</li><li>Dranoff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+irradiated+tumor+cells+engineered+to+secrete+murine+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+potent,+specific,+and+long-lasting+anti-tumor+immunity.">Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).</li><li>Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1,+Unit+1C+4,+Culture+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).</li><li>Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+fluorescence+intensity+and+protein+expression+in+HeLa+cells+stably+transfected+with+hrGFP.">Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP.</a> Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+of+hrGFP+by+mouse+embryonic+stem+cells:+promoter+activity+in+the+undifferentiated+state+and+during+dopaminergic+neural+differentiation.">Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation.</a> Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).</li><li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+embryonic+stem+cells+protects+against+lung+cancer:+is+a+broad-spectrum+prophylactic+vaccine+against+cancer+possible?.">Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?.</a> PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).</li><li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent:+primary+neurons,+siRNA,+and+high-throughput+applications.">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Unit+3+22,+Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+for+Immunoregulation+and+Therapeutic+Intervention+in+Cancer.">Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer.</a> Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).</li><li>Bunggulawa, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+the+use+of+exosomes+as+drug+delivery+systems.">Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems.</a> Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).</li><li>Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proviral+silencing+in+embryonic+cells+is+regulated+by+Yin+Yang+1.">Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1.</a> Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).</li><li>Dranoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF-based+cancer+vaccines.">GM-CSF-based cancer vaccines.</a> Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Feeder+Cell+Types+on+Culture+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+In+Vitro.">Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro.</a> Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).</li><li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).</li><li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+GM-CSF+expressing+embryonic+stem+cells+are+an+effective+prophylactic+vaccine+for+cancer+prevention.">Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention.</a> OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).</li></ol>

本研究は、免疫刺激タンパク質GM-CSFを有するエキソソームエンリッチEVを産生する非常に効率的な方法を示し、エキソソームエンリッチEVの免疫調節効果を研究するために使用することができる。いくつかの研究は、エキソソームが免疫調節および抗腫瘍機能22を示すことを示唆している。したがって、GM-CSFを発現するESCのエキソソームは、免疫応答を調節する生物学的活性?...

ESCは、着床前胚1の胚盤胞期に由来する。多能性幹細胞として、ESCは自己更新し、あらゆるタイプの胚細胞に分化する能力を有する。その著しい発達力と長期的な増殖能力のために、ESCは生物医学研究のために非常に価値がある1.現在の研究努力は、糖尿病、心臓病、および神経変性疾患2、3、4を含む様々な主要な病的障害に対するESCの治療可能性に主に焦点を当てている。
ESCを含む哺乳類細胞は、細胞外環境に可変サイズの小胞を放出することが知られており、これらのEVは細胞間コミュニケーションにおけるそれらの役割のために多くの生理学的および病理学的機能を有する5。EVの異なるサブタイプの中で、エキソソームは、中間内視鏡コンパートメント、多胞体(MVB)の融合時に細胞外空間に様々な細胞タイプから放出される小さな膜小胞である、血漿膜6を有する。エキソソームは細胞間通信を媒介することが報告されており、多くの(パソ)生理学的プロセス7,8に批判的に関与している。エキソソームは、タンパク質や核酸を含むサイトゾルから得られた生物学的物質を含んでいるため、自分の親細胞からいくつかの生物学的機能を継承します。従って、特定の疾患に特異的な免疫応答を刺激する関連抗原または因子は、特定のタイプの細胞9からエキソソームに封入される。これは、抗癌ワクチン10として腫瘍由来エキソソームを探索する臨床試験への道を開いた。
GM-CSFは、異なるタイプの免疫細胞11によって分泌されるサイトカインである。新たな証拠は、GM-CSFが免疫系を活性化し、調節し、抗原提示プロセス12において不可欠な役割を果たしていることを示す。例えば、臨床報告は、GM-CSFがワクチンアジュバント13として腫瘍に対する免疫応答を刺激することを示唆している。GM-CSFの強力な免疫刺激活性を利用するいくつかのGM-CSFベースの癌免疫療法戦略は、臨床試験14で調査されている。これらの中で、照射されたGM-CSF分泌腫瘍細胞からなるがんワクチンは、転移性腫瘍15において細胞および体液性抗腫瘍応答とその後の壊死を誘導することによって進行した黒色腫患者に何らかの約束を示している。
ESCに由来するエキソソームは元のESCと同様の生物学的活性を有するため、ESCからのGM-CSFを運ぶエキソソームは、免疫応答を調節するための無細胞小胞として機能する可能性があります。本論文では、GM-CSFを発現するESCから高品質エキソソームエンリッチEVを製造する詳細な方法を説明する。これらのエキソソームエンリッチEVは、免疫応答を調節する免疫調節小胞として機能する可能性を秘めています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphate, Calf Intestinal</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>Dephosphorylating DNA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Annexin V mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone H-3, sc-74438</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_1118989</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD81 mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone B-11, sc-166029</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_2275892</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome c mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone A-8, sc-13156</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_627385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flotillin-1 mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone C-2; sc-74566</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_2106563</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH pAb</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>600-401-A33S</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_11182910</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31430</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_228307</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>clone 20E8C12 A21348</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_221509</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ADI-SPA-890</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_10616242</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31460</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_228341</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA (bicinchoninic acid) assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23223</td>
			<td>Determining protein concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M42015</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin, Disodium Salt</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10177012</td>
			<td>Selecting E. coli colonies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Avanti J-26 XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge rotor, JA-10</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>09U1597</td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottle, Nalgene PPCO</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3120-0500PK</td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu grids with carbon support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF200-Cu</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0101</td>
			<td>Digesting DNA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced chemiluminescence detection system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>32106</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACScalibur flow cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Examining GFP levels of ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRR-30-2020</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Filtering ES-D3 cells for FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (0.1%)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ES006B</td>
			<td>Culturing ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF ELISA kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88733422</td>
			<td>Determining GM-CSF concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10-829-018</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRL0131-0100</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfecting ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader, PowerWave XS</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Determining GM-CSF concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP high-speed cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Isolating single ES-D3 cell clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2988J</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10-131-035</td>
			<td>Selecting ES-D3 clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat dry milk</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9022655</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Transfecting ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>sc45000-652</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>37270</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membranes</td>
			<td>Millipore EMD</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligation Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HT7700</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-660</td>
			<td>Culturing ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor, 45Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>09U4454</td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge polycarbonate bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UranyLess staining solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22409</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of exosome-enriched extracellular vesicles carrying granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from embryonic stem cells

胚性幹細胞(ESC)は、自己再生および分化が可能な多能性幹細胞であり、すべてのタイプの胚細胞に分化することができる。他の多くの細胞タイプと同様に、ESCはエキソソームなどの小さな膜小胞を細胞外環境に放出する。エキソソームは細胞間コミュニケーションの不可欠なメディエーターとして機能し、多くの(パソ)生理学的プロセスにおいて基本的な役割を果たす。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)は、免疫応答を調節するサイトカインとして機能する。エキソソームにおけるGM-CSFの存在は、免疫調節機能を高める可能性を秘めています。ここで、GM-CSFは、マウスESC細胞株ES-D3において安定的に過剰発現していた。GM-CSFを過剰発現するES-D3細胞から高品質のエキソソームエンリッチ細胞小胞(EV)を分離するプロトコルが開発されました。分離エキソソームエンリッチEVは、様々な実験的アプローチによって特徴付けられていた。重要なことに、大量のGM-CSFがエキソソームエンリッチEVに存在することが判明した。全体として、ESCからのGM-CSFを持つエキソソームエンリッチEVは、免疫調節活動を行うために無細胞小胞として機能する可能性があります。

GM-CSFはマウスESCで過剰発現している。 ES-D3細胞中でGM-CSFを安定的に過剰発現させるために、マウスGM-CSF cDNAをトランスフェクションベクターにクローニングし、発現ベクターpEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFPを生成した(図1A)。GM-CSFはトランスフェクションによりES-D3細胞で過剰発現し、一過性トランスフェクションES-D3細胞の約20%がG...

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Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

この研究では、胚性幹細胞から免疫刺激性顆粒球マクロファージマクロファージを担う外生富化細胞外小胞を単離する方法について説明する。

胚性幹細胞からの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を運ぶ外生エンリッチ細胞小胞の分離

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

我々のプロトコルは、免疫刺激因子、GM-CSFを発現する胚性幹細胞から高品質のエキソソームエンリッチ細胞小胞を生成するために使用することができる。外因性の富化した細胞外小胞は、GM-CSFを担い、免疫応答を調節できる無細胞免疫調節小胞を提供する可能性を有する。基本的な分子および細胞生物学の訓練を受けた研究者, このプロトコルのように簡単にできるはずです, しかし、初めてこのプロトコルを実行する人は、密接に指示に従う必要があります.私たちのプロトコルは複雑であるため、各ステップの複雑な詳細を視覚化することは、他の研究者がエキソソームフリーFBSを生成し、FBSの所望の体積を超遠回しにし、外生フリー上清を収集するのに役立ちます。ESD 3個の細胞をめっきする前に、室温で15センチメートルの組織培養皿を室温で30分間コーティングします。ESDのフィーダー層細胞を含まないESD細胞を吸引して培養し、5%の炭酸ガス加湿インキュベーターで37°Cの細胞培養液を細胞が90%合流するまで培養した。1皿あたり0.05%トリプシンの5ミリリットルで、新鮮なトリプシンで摂氏37度で5分間のインキュベーションを行い、ほぼコンフルエントな文化を洗います。インキュベーションの終わりに遠心分離管に分離した細胞を引っ張り、新鮮な培養培地の5ミリリットルでトリプシンを不活性化.遠心分離によって細胞を沈降し、過越のために数える新鮮な媒体でパレットを再中断し、 細胞培養後3ミリリットルの新しいゼラチンコーティングプレート上のESDの3細胞の5倍の10~6番目の細胞を3日間培養してから3日間培養し、外因性豊約細胞外小胞板を10回から7番目のESD3細胞に1回採取する。新しいゼラチンコーティングプレートにつきミリリットルの細胞培養培地は、細胞培養上清を収集する前に3日間、外因性の余分な細胞小胞の分離のために、最初の沈降は遠心分離によってESD3細胞を培養した72時間培養した上清内の大細胞断片を沈降させる。上清を収集した後、Ultra遠回しにサンプルを採取し、上清を捨てます。メーカーの指示によると、各パレットを1回のPBSで2回洗浄して残留培養上清を除去し、ビチンコニン酸アッセイで外因性豊結細胞外小胞タンパク質含有量を定量化する。その後、PBSの外因性豊量な細胞外小胞をマイクロメートル濃度あたり6マイクログラムで再中断し、摂氏80度で貯蔵する。透過電子顕微鏡法により外因性富化細胞外小胞を可視化し、室温で2%電子顕微鏡グリッドパラホルムアルデヒドの最終濃度で細胞外小胞の1ミリリットル当たり3〜5マイクログラムを2時間固定した。インキュベーションの最後に、固定サンプルの10マイクロリットルをカーボンサポートフィルムで銅グリッドに1分間ロードしてから、フィルターペーパーでグリッドを排出し、メーカーのプロトコルに従って適切な染色液でグリッドにとどまり、ピンセットを使用してグリッドをフィルターペーパーに転送します。 その後、透過型電子顕微鏡を50,000倍の倍率で使用し、標準的なプロトコルに従って電子顕微鏡画像を取得します。全細胞抽出物を調製するために、示されているように培養物からESD3細胞を採取し、採取した細胞をPBSで再中断してカウントする。2回目の遠心分離の後、0.5%SDS濃度を含むSDSページローディングバッファのマイクロリットル当たり3番目の細胞に5倍10回の細胞を再中断し、10%振幅のソニケーターでサンプルを10秒間超音波処理します。その後、サンプルを摂氏100度で5分間加熱します。エキソソーム濃縮された細胞外小胞のリセートを調製するには、0.5%SDSを含むSDSページ負荷バッファーの外皮濃縮細胞外小胞をマイクロリットル1.2マイクログラムで再中断し、サンプルを10秒間超音波処理し、サンプルを100°Cで5分間加熱します。ウェスタンブロット分析では、10マイクロリットルの卸用抽出物とエキソソーム濃縮細胞外小胞リセートサンプルを、最良のストレスページゲルの個々のウェルにロードします。実行の最後に、PVDF膜にタンパク質を移し、目的の適切な一次および二次抗体で膜をインキュベートし、強化された化学発光検出キットを使用してタンパク質発現を検出する、メーカーの指示に従う。エキソソーム濃縮細胞外小胞内のGM-CSFの量を評価するには、キットのマウスGM-CSFを使用して次に抗GM-CSF捕捉抗体でELISAプレートをコーティングし、100マイクロリットルのPBSでエキソソーム濃縮細胞外小胞サンプルの0.6マイクログラムを治療するか、PBSに加えて0.05%tween 20を室温で30分間室温で処理します。インキュベーションの終わりに、処理したサンプルを調製したELISAプレートの個々のウェルに、室温で1時間インキュベーションし、その後にPBS単独で適切な対応するウェルの洗浄、またはPBSプラス0.05%トゥイーン20を加える。洗浄後、検出抗体をサンプルに加えて、室温で1時間インキュベーションし、PBS単独で洗浄し、PBSに0.05%トゥイーン20を加え、アビジン・ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼを室温で30分間インキュベーションし、続いて450ナノメートルのマイクロプレートリーダーで各ウェルウェルの吸光度を洗浄して測定します。空のベクターを発現するESD3細胞株またはESD 3細胞株を発現するGM-CSFのGFP蛍光強度は、親の細胞株よりもはるかに高い。ELISAは、GM-CSFを発現するESD3細胞が、空のベクターコントロール細胞よりも細胞培養上清において著しく高いレベルのGMCSFを産生することを明らかにした。さらに、3細胞を発現するGM-CSFで生成されるGM-CSFの量は、GM-CSFを発現するSTO線維芽細胞によって生成されるものと同様である。細胞外小胞を導入したベクターから分離した透過電子顕微鏡と、GM-CSFの細胞培養により、予想される直径30~100ナノメートルの範囲内に収まる、異なるサイズの小胞が明らかになります。CD81、アネキシンVおよびフロチリン-1を含むエキソソームマーカーの発現は、細胞外小胞で顕著に増強され、ウェスタンブロット分析による対応する卸売抽出物と比較してESD 3細胞から単離される。重要なことに、ESDに他の細胞下コンパートメントマーカーの存在は、小胞体小胞、プロテインジスルフィドイソメラーゼ、ミトコンドリアマーカー、チトクロムCおよびオックスホス複合IVサブユニットIVおよび細胞質マーカーGAPDHを含む、3つの細胞外小胞を検出しなかった。0.05%トゥイーン20で洗浄した後、コントロール細胞外小胞で検出されたGM-CSFレベルの背景が有意に低下した。これに対し、GM-CSF発現細胞の細胞外小胞中のGM-CSFレベルは、トゥイーン20によって有意に増加した。GMCSFを運ぶ高品質のエキソソーム富化細胞外小胞を獲得することは、このプロトコルの成功のための最も重要なステップです。研究者は、GM-CSF依存性細胞株および動物の研究など、GM-CSFを世話する外因性豊かな細胞外小胞が無細胞免疫調節小胞として機能できるかどうかを判断するなどの追加の実験を行うことができる。これらの外因性豊かな細胞外小胞は、免疫応答の調節が異なる疾患状態にどのように影響するかを探求するために使用することができる。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

胚ゼブラフィッシュにおけるヒト乳癌細胞の浸潤挙動

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

生物学的サンプルからの癌幹細胞の検出と精製のためのDNA色素誘発側母集団表現型の活用

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

腫瘍と間葉系幹細胞の間細胞小胞を介した通信を定義する骨肉腫のマウスの前臨床モデル

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

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The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

通常のコロンと大腸癌 - 改良されたプロトコルから人間の血管内皮細胞の分離

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

それらの相互作用を研究する歯髄組織と癌細胞との共培養から間葉系幹細胞の分離

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

全体組織からの細胞の小胞の抽出

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

変異体メラノサイト幹細胞からのマウス黒色腫開始の空間的および時間的制御

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

3次元スフェロイド培養からの幹様細胞の分離

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...