Name: isolation of exosome-enriched extracellular vesicles carrying granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from embryonic stem cells
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells at JoVE.com

우리는 전송 전자 현미경 이미지를 획득하기 위한 Arkadiusz Slusarczyk 및 켄터키 생물 의학 연구 인프라 네트워크 (KBRIN, P20GM103436)에 감사드립니다. 이 작품은 NIH AA018016-01 (J.W.E.), 켄터키 연구 챌린지 트러스트 펀드 (J.W.E.), NIH CA106599 및 CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.), 무료 호흡 연구 (K.Y.)의 보조금에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

1. ES-D3 세포 배양
<ol><li>외성 없는 태아 소 혈청(FBS)을 생성하려면 FBS를 4°C에서 16시간 동안 100,000 x g의 초원심분리기 및 원심분리기로 로드합니다. 원심분리에 따라, 뮤린 ESC 세포주 ES-D3를 배양하고 엑소좀 농축 된 전기를 획득하기 위한 외성 없는 FBS로서 혈청 상피물을 수집합니다.</li>
	<li>ES-D3 세포를 도금하기 전에 실온에서 젤라틴(0.1%)을 사용하여 15cm 조직 배양 접시를 30분 동안 코팅?...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Sakthiswary, R., Raymond, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+in+neurodegenerative+diseases:+From+principles+to+practice.">Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice.</a> Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).</li><li>Liu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+restore+function+in+infarcted+hearts+of+non-human+primates.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).</li><li>Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+for+type+1+diabetes+mellitus.">Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).</li><li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles.">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).</li><li>Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Presentation+by+Extracellular+Vesicles+from+Professional+Antigen-Presenting+Cells.">Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells.</a> Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).</li><li>Kunigelis, K. E., Graner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dichotomy+of+Tumor+Exosomes+(TEX)+in+Cancer+Immunity:+Is+It+All+in+the+ConTEXt?.">The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?.</a> Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).</li><li>Becher, B., Tugues, S., Greter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF:+From+Growth+Factor+to+Central+Mediator+of+Tissue+Inflammation.">GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation.</a> Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).</li><li>Conti, L., Gessani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+in+the+generation+of+dendritic+cells+from+human+blood+monocyte+precursors:+recent+advances.">GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances.</a> Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).</li><li>Higano, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+data+from+2+randomized,+double-blind,+placebo-controlled,+phase+3+trials+of+active+cellular+immunotherapy+with+sipuleucel-T+in+advanced+prostate+cancer.">Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer.</a> Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).</li><li>Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+GM-CSF-based+cancer+immunotherapy.">Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy.</a> Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).</li><li>Dranoff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+irradiated+tumor+cells+engineered+to+secrete+murine+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+potent,+specific,+and+long-lasting+anti-tumor+immunity.">Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).</li><li>Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1,+Unit+1C+4,+Culture+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).</li><li>Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+fluorescence+intensity+and+protein+expression+in+HeLa+cells+stably+transfected+with+hrGFP.">Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP.</a> Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+of+hrGFP+by+mouse+embryonic+stem+cells:+promoter+activity+in+the+undifferentiated+state+and+during+dopaminergic+neural+differentiation.">Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation.</a> Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).</li><li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+embryonic+stem+cells+protects+against+lung+cancer:+is+a+broad-spectrum+prophylactic+vaccine+against+cancer+possible?.">Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?.</a> PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).</li><li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent:+primary+neurons,+siRNA,+and+high-throughput+applications.">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Unit+3+22,+Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+for+Immunoregulation+and+Therapeutic+Intervention+in+Cancer.">Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer.</a> Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).</li><li>Bunggulawa, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+the+use+of+exosomes+as+drug+delivery+systems.">Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems.</a> Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).</li><li>Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proviral+silencing+in+embryonic+cells+is+regulated+by+Yin+Yang+1.">Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1.</a> Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).</li><li>Dranoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF-based+cancer+vaccines.">GM-CSF-based cancer vaccines.</a> Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Feeder+Cell+Types+on+Culture+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+In+Vitro.">Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro.</a> Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).</li><li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).</li><li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+GM-CSF+expressing+embryonic+stem+cells+are+an+effective+prophylactic+vaccine+for+cancer+prevention.">Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention.</a> OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).</li></ol>

이 연구는 면역 자극성 단백질 GM-CSF를 운반하는 외성 농축 된 전기를 생산하는 매우 효율적인 방법을 보여줍니다, 이는 외식 농축 된 EV의 면역 변조 효과를 연구하기 위해 사용할 수 있습니다. 몇몇 연구 결과는 엑소좀이 면역 조절 및 항종양 기능을 전시한다는 것을 건의합니다22. 따라서, GM-CSF를 표현하는 ESCs에서 엑소솜은 또한 면역 반응을 통제하는 생물학 활동을 소유할 수 ?...

ESC는 이식 전 배아1의배반성 단계에서 유래된다. 만능 줄기 세포로서, ESC는 배아 세포의 어떤 모형든지로 자기 갱신하고 분화할 수 있는 기능을 가지고 있습니다. 그들의 놀라운 발달 잠재력 및 장기 증식 능력으로 인해, ESC는 생물 의학 연구1에매우 귀중하다. 현재의 연구 노력은 주로 당뇨병, 심장 질환 및 신경 퇴행성 질환2,3,4를포함한 다양한 주요 병리학 적 질환에 대한 EsC의 치료잠재력에초점을 맞추고 있다.
ESC를 포함한 포유류 세포는 세포간 환경에 가변 크기로 소포를 방출하는 것으로 알려져 있으며, 이들 EV는 세포간 통신5에서의역할로 인해 많은 생리적 및 병리학적 기능을 갖는다. 이외 용이성 중에서도, 외형은 플라즈마 멤브레인6을가진 중간 내구, 다중 혈관 체납체(MVBs)의 융합시 세포외 공간으로 다양한 세포 유형에서 방출되는 작은 막 소포이다. 엑소좀은 세포간 통신을 중재하기 위해 보고되었으며 많은 (patho)의 생리적 과정에 비판적으로 관여하고있다7,8. 엑소좀은 단백질과 핵산을 포함한 사이토솔에서 획득한 생물학적 물질을 함유하고 있기 때문에 자신의 부모 세포로부터 일부 생물학적 기능을 상속합니다. 따라서, 주어진 질병에 특이적인 면역 반응을 자극하는 관련 항원 또는 인자는 특정 유형의 세포로부터 엑소좀에서 캡슐화된다9. 이는 항암 백신10으로종양 유래 엑소좀을 탐구하는 임상 시험을 위한 길을 열어주었다.
GM-CSF는 면역세포(11)의상이한 모형에 의해 분비되는 사이토카인이다. 새로운 증거는 GM-CSF가 면역 계통을 활성화하고 통제하고 항원 제시 프로세스12에서필수적인 역할을 한다는 것을 보여줍니다. 예를 들어, 임상 보고서는 GM-CSF가 백신보조제 13로서종양에 대한 면역 반응을 자극한다는 것을 시사한다. GM-CSF의 강력한 면역 자극 활성을 악용하기 위한 여러 GM-CSF 기반 암 면역 요법 전략은 임상 시험14에서조사되었다. 이들 중, 조사된 GM-CSF-분비 종양 세포로 구성된 암 백신은 전이 종양에서 세포 및 유머 항종양 반응 및 후속 괴사를 유도하여 고급 흑색종 환자에서 몇 가지 약속을 나타내고있다.
ESC에서 파생된 엑소솜은 원래 ESC와 유사한 생물학적 활동을 가지고 있기 때문에, 아마도 ESC에서 GM-CSF 운반 엑소좀은 면역 반응을 조절하기 위하여 세포 없는 소포로 작동할 수 있었습니다. 본 백서에서는 GM-CSF를 발현하는 ESC로부터 고품질 엑소좀 농축 전기자동차를 생산하는 상세한 방법이 설명되어 있다. 이 엑소좀 농축 된 전기 는 면역 반응을 조절하기 위해 면역 조절 소포역할을 할 가능성이 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphate, Calf Intestinal</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>Dephosphorylating DNA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Annexin V mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone H-3, sc-74438</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_1118989</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD81 mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone B-11, sc-166029</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_2275892</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome c mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone A-8, sc-13156</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_627385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flotillin-1 mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone C-2; sc-74566</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_2106563</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH pAb</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>600-401-A33S</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_11182910</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31430</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_228307</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>clone 20E8C12 A21348</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_221509</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ADI-SPA-890</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_10616242</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31460</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_228341</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA (bicinchoninic acid) assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23223</td>
			<td>Determining protein concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M42015</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin, Disodium Salt</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10177012</td>
			<td>Selecting E. coli colonies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Avanti J-26 XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge rotor, JA-10</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>09U1597</td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottle, Nalgene PPCO</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3120-0500PK</td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu grids with carbon support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF200-Cu</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0101</td>
			<td>Digesting DNA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced chemiluminescence detection system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>32106</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACScalibur flow cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Examining GFP levels of ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRR-30-2020</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Filtering ES-D3 cells for FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (0.1%)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ES006B</td>
			<td>Culturing ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF ELISA kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88733422</td>
			<td>Determining GM-CSF concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10-829-018</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRL0131-0100</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfecting ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader, PowerWave XS</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Determining GM-CSF concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP high-speed cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Isolating single ES-D3 cell clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2988J</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10-131-035</td>
			<td>Selecting ES-D3 clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat dry milk</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9022655</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Transfecting ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>sc45000-652</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>37270</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membranes</td>
			<td>Millipore EMD</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligation Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HT7700</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-660</td>
			<td>Culturing ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor, 45Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>09U4454</td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge polycarbonate bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UranyLess staining solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22409</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of exosome-enriched extracellular vesicles carrying granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from embryonic stem cells

배아 줄기 세포 (ESC)는 모든 유형의 배아 세포로 자가 재생 및 분화를 할 수있는 만능 줄기 세포입니다. 다른 많은 세포 유형과 마찬가지로, ESC는 외식과 같은 작은 막 소포를 세포 외 환경에 방출합니다. 엑소좀은 세포간 통신의 필수 중재자 역할을 하며 많은 (patho) 생리적 과정에 기본적인 역할을 합니다. 과립구-대식세포 식민지 자극 인자(GM-CSF)는 면역 반응을 조절하기 위해 사이토카인으로서 기능한다. 엑소좀에 GM-CSF의 존재는 면역 조절 기능을 높일 가능성이 있다. 여기서, GM-CSF는 뮤린 ESC 세포주 ES-D3에서 안정적으로 과발현되었다. 프로토콜은 GM-CSF를 과발현하는 ES-D3 세포로부터 고품질 엑소좀 농축 세포 소포(EV)를 분리하기 위해 개발되었다. 고립 된 엑소좀 농축 된 전기는 다양한 실험적 접근법을 특징으로하였다. 중요한 것은, 상당한 양의 GM-CSF는 엑소좀 농축 된 전기 에 존재하는 것으로 나타났습니다. 전반적으로, ESC에서 GM-CSF 베어링 엑소좀 농축 된 전기 는 그들의 면역 규제 활동을 발휘 하기 위해 세포 없는 소포로 작동할 수 있습니다.

GM-CSF는 뮤린 ESC에서 과발현된다. ES-D3 세포에서 GM-CSF를 안정적으로 과발적으로 표현하기 위해, 뮤린 GM-CSF cDNA는 발현 벡터 pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP(도1A)를생성하는 형질 벡터로 복제되었다. GM-CSF는 ES-D3 세포에서 과발현되었고, 과도적으로 과도하게 감염된 ES-D3 세포의 약 20%가 GFP 양성이었다. 세포 클론은 GM-CSF 또는 빈 벡터 제?...

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Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

이 연구는 배아 줄기 세포에서 면역 자극 과립 대세포 식민지 자극 인자를 운반하는 외약 농축 세포 소포를 분리하는 방법을 설명합니다.

배아 줄기 세포에서 과립구-대식세포 식민지 자극 인자를 운반하는 외식 농축 세포 외 소포의 격리

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

우리의 프로토콜은 면역 자극 인자, GM-CSF를 표현하는 배아 줄기 세포에서 고품질 엑소좀 농축 세포 소포를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. GM-CSF를 운반하는 Exosome 농축 세포 외 소포는 면역 반응을 조절할 수 있는 세포 없는 면역 조절 소포를 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 기본적인 분자 및 세포 생물학 훈련을 가진 연구원은, 이 프로토콜을 할 수 있는 것처럼 쉽게 할 수 있어야 합니다, 그러나 처음으로 이 프로토콜을 능력을 발휘하는 사람은 밀접하게 지시를 따라야 합니다.우리의 프로토콜은 복잡하기 때문에 각 단계의 복잡한 세부 사항을 시각화하면 다른 연구자들이 외형 무료 FBS를 생성하고 FBS의 원하는 볼륨을 초원심 분리하고 엑소좀 무료 상신수를 수집하는 데 도움이 됩니다. ESD 3개의 세포를 도금하기 전에 실온에서 0.1%젤라틴으로 15센티미터 조직 배양 접시를 30분 동안 코팅하십시오. 세포가 90%에 도달할 때까지 37°C에서 37°C에서 37°C에서 37°C에서 ESD 3세포 세포가 없는 ESD 3세포를 포부및 배양시킴으로써 젤라틴을 제거한다.요리당 0.05%의 트립신 5밀리리터로 거의 혼잡한 문화를 씻어내고, 신선한 트립신에서 섭씨 37도에서 5분간 배양을 합니다. 인큐베이션의 끝에서 원심 분리 기 튜브에 분리 된 세포를 당기고 신선한 배양 배지의 5 밀리리터와 트립신을 비활성화합니다. 세포 중퇴는 15밀리리터에서 ESD 3세포의 5배에서 6분의 1을 10으로 플레이트하여 15밀리리터의 새로운 젤라틴 코팅 플레이트에 10배씩 세포배양식을 수집하여 외성 농축 외세포의 분리를 위한 세포 배양 슈퍼탄트 10배를 수집하여 10배의 세포배양식에 대한 세포배양초극을 수집하여 10배의 세포배양소에 다시 중단한다. 새로운 젤라틴 코팅 판당 세포 배양 배지의 밀리리터는 세포 배양 체계를 수집하기 3일 전에 엑소좀 농축된 엑스트라 세포 소포 절연, 72시간 배양ESD 3세포로부터 수집된 초중질 내의 큰 세포 단편을 원심분리에 의한 것으로 한다.상체를 수집한 후, 초원심분리는 샘플을 폐기하고 초월제를 폐기한다. 제조사의 지시에 따라 세척당 PBS 1밀리리터로 각 팔레트를 두 번 부드럽게 헹구어 잔류 배양 슈퍼네탄을 제거하고 비신천산 분석으로 외성 농축 세포 외 소포 단백질 함량을 정량화합니다. 그런 다음 영하 80도에서 저장하기 위해 마이크로 미터 농도당 6 마이크로 그램으로 PBS에서 외식 농축 세포 외 소포를 다시 중단합니다.투과 전자 현미경에 의해 외형 농축 외세포 소포를 시각화하려면 2시간 동안 실온에서 2%의 전자 현미경 그리드 파라포름알데히드의 최종 농도로 세포외 소포의 밀리리터당 3~5마이크로그램을 수정한다. 인큐베이션의 끝에서, 필터 종이로 그리드를 배출하기 전에 1 분 동안 탄소 지원 필름구리 그리드에 고정 된 샘플의 10 마이크로 리터를로드, 적절한 염색 솔루션그리드에 머물고, 제조 업체의 프로토콜에 따라 핀셋을 사용하여 필터 용지의 조각으로 그리드를 전송, 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 전자 현미경 이미지를 획득하기 위해 50 배율, 000 배율로 전송 전자 현미경을 사용합니다. 전세포 추출물을 준비하려면, 입증된 바와 같이 배양으로부터 ESD 3개의 세포를 수집하고, 계산을 위해 PBS에서 수확된 세포를 다시 중단한다.두 번째 원심 분리 후, 0.5%SDS 농도를 포함하는 SDS 페이지 로딩 버퍼의 마이크로리터 당 5배 10에서 세 번째 세포로 세포를 다시 중단하고 10%의 진폭을 가진 소닉레이터에서 10초 동안 샘플을 초음파 처리합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 100도에서 5분간 가열합니다. 외형 농축 세포 소포에 대한 용액을 준비하기 위해, 마이크로 리터 농도 당 1.2 마이크로 그램에서 0.5 %SDS를 포함하는 SDS 페이지 로딩 버퍼에서 외성 농축 세포 외 소포를 다시 중단하고 시연 된 바와 같이 샘플을 10 초 동안 초음파 처리한 다음 샘플을 섭씨 100도에서 5 분 동안 가열합니다.웨스턴 블롯 분석을 위해, 10 마이크로 리터 도매 추출물과 엑소좀 농축 세포 외 소포 리세이트 샘플을 최고의 스트레스 페이지 젤의 개별 우물에 적재하십시오. 실행의 끝에서, PVDF 막에 단백질을 전송하고 관심의 적절한 기본 및 이차 항체와 막을 배양, 다음 향상된 화학 발광 검출 키트를 사용하여 단백질 발현을 감지, 제조 업체의 지침에 따르면. 엑소좀 농축 세포 외 소포 내에서 GM-CSF의 양을 평가하기 위해 키트 Murine GM-CSF를 사용하여 ELISA 플레이트를 안티 GM-CSF 포획 항체로 코팅하고, PBS 의 마이크로리터 100마이크로리터를 단독으로 처리하거나 PBS 플러스 0.05%tween 200분 실내에서 20분 동안 0.05%tween을 치료하십시오.인큐베이션이 끝나면, 준비된 ELISA 플레이트의 개별 우물에 1시간 동안 실내 온도에서 배양한 다음 PBS단독으로 적절한 해당 웰을 세척하거나 PBS 플러스 0.05%tween 20을 첨가한다. 세척 후, 실온에서 1시간 동안 배양한 후 PBS단독으로 세척한 다음 PBS와 0.05%tween 20을 첨가한 다음, 실온에서 30분 동안 시료에 아비딘 호스레디시어 페록시다제를 첨가한 다음, 40마이크로미터의 각 마이크로플레이트에서 각 마이크로플레이트에서 흡수를 측정한다. GFP 형광 강도는 ESD 3 세포주 또는 빈 벡터를 표현하는 ESD 3 세포주 또는 ESD 3 세포줄을 표현하는 GM-CSF의 형광 강도는 부모의 세포보다 훨씬 높습니다.ELISA는 GM-CSF를 발현하는 ESD 3개의 세포가 빈 벡터 제어 세포보다 세포 배양 상류체에서 현저하게 더 높은 수준의 GMCSF를 생성한다는 것을 밝힙니다. 더욱이, GM-CSF가 ESD 3세포를 발현하는 GM-CSF에 의해 생성된 GM-CSF의 양은 GM-CSF를 발현하는 STO 섬유아세포에 의해 생성된 것과 유사하다. 벡터 트랜스듀시 및 GM-CSF 트랜스포이크 세포 배양으로부터 분리된 세포외 소포의 전송 전자 현미경 검사는 예상 된 30 ~ 100 나노미터 직경 범위 내에 속하는 다른 크기의 소포를 나타낸다.CD81, 부속서 V 및 플로틸린-1을 포함한 외경 마커의 발현은 세포외 소포에서 현저하게 향상되며, 서구 블롯 분석에 의한 해당 도매 추출물에 비해 ESD 3세포로부터 분리된다. 중요한 것은, ESD에서 다른 세포체 구획 마커의 존재3 유래 세포 외 소포는 내시경 망상 마커, 단백질 이섬화증, 미토콘드리아 마커, 사이토크롬 C 및 옥스포스 복합 IV-서브유닛 IV 및 세포성 마커 GAPDH를 포함하였나. 0.05%tween 20으로 세척한 후, 대조군에서 검출된 배경 GM-CSF 수준이 크게 감소하였다.대조적으로, GM-CSF 발현 세포의 세포외 소포에서 GM-CSF 수준은 트위닝에 의해 현저하게 증가하였다 20. GMCSF를 운반하는 고품질 엑소좀 농축 세포 외 소포를 획득하는 것은이 프로토콜의 성공을위한 가장 중요한 단계입니다. 연구원은 GM-CSF 종속 세포주 및 동물에 있는 연구 결과와 같은 추가 실험을 능력을 발휘할 수 있습니다 GM-CSF를 돌보는 외민농축 세포 세포 소포가 세포 없는 면역 규제 소포로 작동할 수 있는지 여부를 결정합니다.이러한 엑소좀 농축 세포 외 소포는 면역 반응의 변조가 다른 질병 조건에 어떻게 영향을 미치는지 탐구하는 데 사용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

배아 Zebrafish의 인간 유방암 세포의 침략 행동

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

연구

암 연구학

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

DNA 염료에 의한 측면 집단 표현형을 활용하여 생물학적 샘플에서 암 줄기 세포를 검출하고 정제

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

종양 및 중간 엽 줄기 세포 사이의 세포 외 기 중재 통신을 정의 하는 다리의 전 임상 마우스 모델

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 발하는 세포의 격리 및 특성화

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

정상적인 대 장 암과 대 장 암-향상 된 프로토콜에서 인간의 내 피 세포의 고립

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

펄프 조직 문화와 공동 암 세포와 그들의 상호 작용을 공부 하에서 중간 엽 줄기 세포 분리

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

전체 조직에서 세포 외 Vesicles의 추출

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

돌연변이 멜 뮤 린 줄기 세포에서 시작 하는의 공간적 및 시간적 제어

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

3차원 스페로이드 배양에서 줄기와 같은 세포의 분리

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...