Name: isolation of exosome-enriched extracellular vesicles carrying granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from embryonic stem cells
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Vi er takknemlige til Mr. Arkadiusz Slusarczyk og Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) for å skaffe overføringselektronmikroskopbilder. Dette arbeidet ble delvis støttet av tilskudd fra NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 og CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) og Free to Breathe Research Grant (K.Y.).

1. Culturing ES-D3 celler
<ol><li>For å generere exosome-fri foster bovint serum (FBS), last FBS inn i en ultracentrifuge og sentrifuge ved 100,000 x g i 16 timer ved 4 °C. Etter sentrifugering samler du serum supernatant som exosome-free FBS for å dyrke murine ESC celle linje ES-D3 og anskaffe exosome-beriket ELBILER.</li>
	<li>Før du plating ES-D3 celler, frakk 15 cm vev kultur retter ved hjelp av gelatin (0,1%) ved romtemperatur i 30 min.</li>
	<li>Etter en tidligere beskrevet protokoll<sup class="xref...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Sakthiswary, R., Raymond, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+in+neurodegenerative+diseases:+From+principles+to+practice.">Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice.</a> Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).</li><li>Liu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+restore+function+in+infarcted+hearts+of+non-human+primates.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).</li><li>Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+for+type+1+diabetes+mellitus.">Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).</li><li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles.">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).</li><li>Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Presentation+by+Extracellular+Vesicles+from+Professional+Antigen-Presenting+Cells.">Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells.</a> Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).</li><li>Kunigelis, K. E., Graner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dichotomy+of+Tumor+Exosomes+(TEX)+in+Cancer+Immunity:+Is+It+All+in+the+ConTEXt?.">The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?.</a> Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).</li><li>Becher, B., Tugues, S., Greter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF:+From+Growth+Factor+to+Central+Mediator+of+Tissue+Inflammation.">GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation.</a> Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).</li><li>Conti, L., Gessani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+in+the+generation+of+dendritic+cells+from+human+blood+monocyte+precursors:+recent+advances.">GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances.</a> Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).</li><li>Higano, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+data+from+2+randomized,+double-blind,+placebo-controlled,+phase+3+trials+of+active+cellular+immunotherapy+with+sipuleucel-T+in+advanced+prostate+cancer.">Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer.</a> Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).</li><li>Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+GM-CSF-based+cancer+immunotherapy.">Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy.</a> Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).</li><li>Dranoff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+irradiated+tumor+cells+engineered+to+secrete+murine+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+potent,+specific,+and+long-lasting+anti-tumor+immunity.">Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).</li><li>Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1,+Unit+1C+4,+Culture+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).</li><li>Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+fluorescence+intensity+and+protein+expression+in+HeLa+cells+stably+transfected+with+hrGFP.">Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP.</a> Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+of+hrGFP+by+mouse+embryonic+stem+cells:+promoter+activity+in+the+undifferentiated+state+and+during+dopaminergic+neural+differentiation.">Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation.</a> Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).</li><li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+embryonic+stem+cells+protects+against+lung+cancer:+is+a+broad-spectrum+prophylactic+vaccine+against+cancer+possible?.">Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?.</a> PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).</li><li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent:+primary+neurons,+siRNA,+and+high-throughput+applications.">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Unit+3+22,+Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+for+Immunoregulation+and+Therapeutic+Intervention+in+Cancer.">Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer.</a> Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).</li><li>Bunggulawa, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+the+use+of+exosomes+as+drug+delivery+systems.">Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems.</a> Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).</li><li>Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proviral+silencing+in+embryonic+cells+is+regulated+by+Yin+Yang+1.">Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1.</a> Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).</li><li>Dranoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF-based+cancer+vaccines.">GM-CSF-based cancer vaccines.</a> Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Feeder+Cell+Types+on+Culture+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+In+Vitro.">Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro.</a> Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).</li><li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).</li><li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+GM-CSF+expressing+embryonic+stem+cells+are+an+effective+prophylactic+vaccine+for+cancer+prevention.">Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention.</a> OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).</li></ol>

Denne studien viser en svært effektiv metode for å produsere eksosomberikede elbiler som bærer immunstimulatorisk protein GM-CSF, som kan brukes til å studere immunmodulatoriske effekter av exosome-beriket EVs. Flere studier tyder på at eksosomer viser immunregulerende og anti-tumor funksjoner22. Dermed kan eksosomer fra ESC som uttrykker GM-CSF også ha biologiske aktiviteter som regulerer immunresponsen. I denne protokollen ble eksogen murin GM-CSF stabilt overekspressert i murine ES-D3-cel...

ESC er avledet fra blastocyststadiet av et preimplantasjonsembryo1. Som pluripotente stamceller har ESC evnen til å fornye seg selv og differensiere seg i alle typer embryonale celler. På grunn av deres bemerkelsesverdige utviklingspotensial og langsiktige proliferative kapasitet, er ESC-er ekstremt verdifulle for biomedisinsk forskning1. Nåværende forskningsinnsats har i stor grad fokusert på det terapeutiske potensialet til ESC for en rekke store patologiske lidelser, inkludert diabetes, hjertesykdom og nevrodegenerative sykdommer2,3,4.
Pattedyrceller, inkludert ESCer, er kjent for å frigjøre vesikler med variable størrelser til det ekstracellulære miljøet, og disse EVene har mange fysiologiske og patologiske funksjoner på grunn av deres rolle i intercellulær kommunikasjon5. Blant forskjellige undertyper av elbiler er eksosomer små membran vesicles frigjort fra ulike celletyper i det ekstracellulære rommet ved sammensmelting av mellomliggende endokytiske rom, multivesikulære legemer (MVB), med plasmamembranen6. Eksosomer har blitt rapportert å megle intercellulær kommunikasjon og er kritisk involvert i mange (pato)fysiologiske prosesser7,8. Eksosomer arver noen biologiske funksjoner fra sine egne foreldreceller, fordi eksosomer inneholder biologiske materialer anskaffet fra cytosolen, inkludert proteiner og nukleinsyrer. Dermed er de tilknyttede antigener eller faktorer som stimulerer immunresponsen som er spesifikk for en gitt sykdom, innkapslet i eksosomene fra bestemte typer celler9. Dette banet vei for kliniske studier som utforsket tumor-avledede eksosomer som en anti-kreftvaksine10.
GM-CSF er en cytokin utskilt av forskjellige typer immunceller11. Nye bevis viser at GM-CSF aktiverer og regulerer immunforsvaret og spiller en viktig rolle i antigen-presentasjonsprosessen12. For eksempel antyder en klinisk rapport at GM-CSF stimulerer immunresponsen på svulster som en vaksine adjuvant13. Flere GM-CSF-baserte kreftimmunoterapistrategier for å utnytte den potente immunstimulatoriske aktiviteten til GM-CSF har blitt undersøkt i kliniske studier14. Blant disse har en kreftvaksine sammensatt av bestrålede GM-CSF-utskillende tumorceller vist noe løfte hos avanserte melanompasienter ved å indusere cellulære og humorale antitumorresponser og påfølgende nekrose i metastaserte svulster15.
Fordi eksosomene avledet fra ESCs har lignende biologiske aktiviteter som de opprinnelige ESCene, kan kanskje GM-CSF-bærende eksosomer fra ESC-er fungere som cellefrie vesicles for å regulere immunresponsen. I dette dokumentet beskrives en detaljert metode for å produsere eksosomberikede elbiler av høy kvalitet fra ESC-er som uttrykker GM-CSF. Disse eksosomberikede ELBIL-ene har potensial til å fungere som immunregulerende vesikler for å modulere immunresponsen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphate, Calf Intestinal</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>Dephosphorylating DNA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Annexin V mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone H-3, sc-74438</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_1118989</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD81 mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone B-11, sc-166029</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_2275892</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome c mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone A-8, sc-13156</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_627385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flotillin-1 mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone C-2; sc-74566</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_2106563</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH pAb</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>600-401-A33S</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_11182910</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31430</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_228307</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>clone 20E8C12 A21348</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_221509</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ADI-SPA-890</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_10616242</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31460</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_228341</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA (bicinchoninic acid) assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23223</td>
			<td>Determining protein concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M42015</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin, Disodium Salt</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10177012</td>
			<td>Selecting E. coli colonies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Avanti J-26 XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge rotor, JA-10</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>09U1597</td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottle, Nalgene PPCO</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3120-0500PK</td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu grids with carbon support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF200-Cu</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0101</td>
			<td>Digesting DNA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced chemiluminescence detection system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>32106</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACScalibur flow cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Examining GFP levels of ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRR-30-2020</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Filtering ES-D3 cells for FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (0.1%)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ES006B</td>
			<td>Culturing ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF ELISA kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88733422</td>
			<td>Determining GM-CSF concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10-829-018</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRL0131-0100</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfecting ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader, PowerWave XS</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Determining GM-CSF concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP high-speed cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Isolating single ES-D3 cell clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2988J</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10-131-035</td>
			<td>Selecting ES-D3 clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat dry milk</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9022655</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Transfecting ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>sc45000-652</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>37270</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membranes</td>
			<td>Millipore EMD</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligation Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HT7700</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-660</td>
			<td>Culturing ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor, 45Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>09U4454</td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge polycarbonate bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UranyLess staining solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22409</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of exosome-enriched extracellular vesicles carrying granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from embryonic stem cells

Embryonale stamceller (ESC) er pluripotente stamceller som er i stand til selvfornyelse og differensiering i alle typer embryonale celler. Som mange andre celletyper frigjør ESC-er små membran vesicles, for eksempel eksosomer, til det ekstracellulære miljøet. Eksosomer tjener som essensielle formidlere av intercellulær kommunikasjon og spiller en grunnleggende rolle i mange (pato)fysiologiske prosesser. Granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF) fungerer som en cytokin for å modulere immunresponsen. Tilstedeværelsen av GM-CSF i eksosomer har potensial til å øke immunforsvaret. Her ble GM-CSF stabilt overekspressert i murine ESC-cellelinjen ES-D3. En protokoll ble utviklet for å isolere eksosole-berikede ekstracellulære vesikler av høy kvalitet (EVer) fra ES-D3-celler som overekspresserer GM-CSF. Isolerte eksosomberikede elbiler var preget av en rekke eksperimentelle tilnærminger. Det er viktig at betydelige mengder GM-CSF finnes i eksosomberikede elbiler. Totalt sett kan GM-CSF-bærende exosome-berikede EVer fra ESC-er fungere som cellefrie vesicles for å utøve sine immunregulerende aktiviteter.

GM-CSF er overekspressert i murine ESCs. For å stabilt overekspressere GM-CSF i ES-D3-celler ble murine GM-CSF cDNA klonet til en transfeksjonsvektor for å generere uttrykksvektoren pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (Figur 1A). GM-CSF ble overekspressert i ES-D3-celler ved transfeksjon, og omtrent 20% av forbigående transfekterte ES-D3-celler var GFP-positive. Cellekloner stabilt overekspresserende GM-CSF eller tom vektorkontro...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Denne studien beskriver en metode for å isolere eksosomberikede ekstracellulære vesikler som bærer immunstimulatorisk granulocytt makrofagkolonistimulerende faktorer fra embryonale stamceller.

Isolering av exosome-beriket ekstracellulære vesikler som bærer granulocytt-makrofag kolonistimulerende faktor fra embryonale stamceller

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Vår protokoll kan brukes til å produsere eksosomberikede ekstracellulære vesikler av høy kvalitet fra embryonale stamceller som uttrykker immunstimulatorisk faktor, GM-CSF. Exosome beriket ekstracellulære vesicles bærer GM-CSF, har potensial til å tjene en cellefri immun regulatorisk vesicles som kan modulere immunresponsen. Forskere med grunnleggende molekylær og cellulær biologi trening, Bør være i stand til lett som kunne denne protokollen, men alle som utfører denne protokollen for første gang bør følge instruksjonene nøye.Siden protokollen vår er komplisert, vil visualisering av de intrikate detaljene i hvert trinn hjelpe andre forskere til å generere exosome gratis FBS, ultracentrifuge ønsket volum av FBS og samle eksosomet gratis supernatant. Før du plating ESD tre celler, frakk 15 centimeter vev kultur retter med 0,1% Gelatin ved romtemperatur i 30 minutter. Fjern Gelatin ved aspirasjon og kultur ESD tre celler uten mater lagceller i ESD tre cellekultur medium ved 37 grader Celsius i 5%Karbondioksid fuktet inkubator til cellene når 90% samløp.Vask de nesten sammenfallende kulturene med fem milliliter 0,05% trypsin per tallerken etterfulgt av en fem minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius i fersk trypsin. På slutten av inkubasjonen trekker de frittliggende cellene i et sentrifugerør og inaktiver trypsin med fem milliliter friskt kulturmedium. Sediment cellene ved sentrifugering og re-suspendere pallene i friskt medium for telling For passaging, plate fem ganger 10 til den sjette av ESD tre celler i 15 milliliter cellekultur medium på nye Gelatin belagte plater for tre dager med kultur før sub-culturing cellene For å samle cellekulturen supernatant for isolering av eksosomet beriket ekstracellulære vesicles plate en ganger 10 til syvende ESD tre celler i 15 milliliter cellekultur medium per nye Gelatin belagt plate i tre dager før innsamling av cellekultur supernatanter For eksosom beriket ekstra cellulær vesicle isolasjon, Først sediment de store cellefragmentene i supernatantene samlet fra 72 timers kultivert ESD tre celler ved sentrifugering.Etter å ha samlet supernatanten, ultracentrifuge prøvene og kaste supernatantene. Skyll forsiktig hver palle to ganger med en milliliter PBS per vask for å fjerne gjenværende kultur supernatant og kvantifisere eksosomet beriket ekstracellulært vesicleproteininnhold med en bicinchoninic acid analyse, i henhold til produsentens instruksjon. Deretter re-suspendere exosome beriket ekstracellulære vesicles i PBS på en seks mikrogram per mikro meter konsentrasjon for lagring på minus 80 grader Celsius.For å visualisere eksosomet beriket ekstracellulære vesicles ved overføring elektronmikroskopi fikse tre til fem mikrogram per milliliter av de ekstracellulære vesiklene med den endelige konsentrasjonen av 2% elektronmikroskop grid paraformaldehyd ved romtemperatur i to timer. På slutten av inkubasjonen legger du 10 mikrolitere av de faste prøvene på kobbergitter med karbonstøttefilm i ett minutt før du drenerer rutenettene med filterpapir, holder deg i gitteret med en passende fargeløsning, i henhold til produsentens protokoll og bruker pinsett til å overføre rutenettene til et stykke filterpapir, Bruk deretter transmisjonselektronmikroskopet med en 50 000 ganger forstørrelse for å skaffe elektronmikroskopibilder, i henhold til standardprotokollene. For å forberede hele celleekstrakter, samle ESD tre celler fra kulturen som demonstrert, og re-suspendere høstede celler i PBS for telling.Etter en ny sentrifugering, re-suspendere cellene ut av fem ganger 10 til tredje celler per mikroliter av SDS side lasting buffer som inneholder 0,5% SDS konsentrasjon og sonikere prøvene i 10 sekunder på en Sonicator med en 10% amplitude. Varm deretter prøvene ved 100 grader Celsius i fem minutter. For å forberede lysater for eksosomet beriket ekstracellulære vesicles, Re-suspendere exosome beriket ekstracellulære vesicles i SDS side lasting buffer som inneholder 0,5%SDS på en 1,2 mikrogram per mikroliter konsentrasjon og Sonicate prøvene i 10 sekunder som demonstrert deretter varme prøvene på 100 Celsius grader i fem minutter.For Western Blot Analysis, last 10 mikroliter engros ekstrakt og exosome beriket ekstracellulær vesicle lysate prøver i individuelle Wells av en beste stress side gel. På slutten av løpet, overfør proteinene på PVDF membraner og inkuber membranene med passende primære og sekundære antistoffer av interesse, og oppdag deretter proteinuttrykket ved hjelp av et forbedret chemiluminescence detection kit, Ifølge produsentens instruksjoner. For å evaluere mengden GM-CSF i eksosomet beriket ekstracellulære vesikler, bruk et sett Murine GM-CSF til å belegge en ELISA-plate med anti GM-CSF fange antistoff neste, behandle 0,6 mikrogram exosome beriket ekstracellulære vesicles prøver med 100 mikroliter PBS alene, eller PBS pluss 0,05% tween 20 ved romtemperatur i 30 minutter.På slutten av inkubasjonen, legg de behandlede prøvene til individuelle Wells av den forberedte ELISA-platen i en times inkubasjon ved romtemperatur etterfulgt av vasking av de aktuelle tilsvarende Brønnene med PBS alene, eller PBS pluss 0,05% tween 20. Etter vasken, legg til deteksjonsantistoffet til prøvene i en times inkubasjon ved romtemperatur etterfulgt av en vask med PBS alene eller PBS pluss 0,05% tween 20 som demonstrert, Legg deretter Avidin Horseradish Peroxidase til prøvene for en 30 minutters inkubasjon ved romtemperatur, etterfulgt av vask og måling av absorbansen i hver brønn på en mikroplateleser ved 450 nanometer. GFP-fluorescensintensiteten til en GM-CSF som uttrykker ESD trecellet linje eller en ESD trecellet linje som uttrykker en tom vektor, er mye høyere enn foreldrenes kolleger.ELISA avslører at ESD tre celler som uttrykker GM-CSF produserer markant høyere nivåer av GMCSF i sin cellekultur supernatant enn tomme vektor kontrollceller. Videre er mengden GM-CSF generert av GM-CSF som uttrykker ESD tre celler lik den som produseres av STO fibroblasts som uttrykker GM-CSF. Transmisjonselektronmikroskopi av ekstracellulære vesikler isolert fra vektortransduserte og GM-CSF-transinduserte cellekulturer avslører vesikler av forskjellige størrelser som faller innenfor det forventede 30 til 100 nanometerdiameterområdet.Uttrykket av eksosomale markører, inkludert CD81, Annexin V og flotillin-1, er markert forbedret i ekstracellulære vesicles, isolert fra ESD tre celler sammenlignet med tilsvarende engrosekstrakter av vestlig blotanalyse. Viktigst, tilstedeværelsen av andre sub-cellulære rommarkører i ESD tre avledede ekstracellulære vesikler ble ikke oppdaget, inkludert endoplasmatisk retikulummarkør, Protein Disulfide Isomerase, mitokondriemarkørene, cytokrom C og Oxphos-komplekset IV-underenhet IV og den cytosoliske markøren GAPDH. Etter vask med 0,05% tween 20, ble bakgrunnen GM-CSF nivåer oppdaget i kontrollen Ekstracellulære vesicles betydelig redusert.Derimot ble GM-CSF-nivåene i de ekstracellulære vesiklene til GM-CSF som uttrykker celler, betydelig økt med tween 20. Å skaffe seg eksosom av høy kvalitet beriket ekstracellulære vesicles som bærer GMCSF er det viktigste trinnet for suksessen til denne protokollen. Forskere kan utføre flere eksperimenter, for eksempel studier i GM-CSF-avhengige cellelinjer og dyr for å avgjøre om eksosomet beriket ekstracellulære vesikler som bryr seg om GM-CSF, kan fungere som cellefrie immunregulatoriske vesikler.Disse eksosomet beriket ekstracellulære vesicles kan deretter brukes til å utforske hvordan modulering av immunresponsen påvirker ulike sykdomstilstander.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Invasiv Opptreden av humane brystcancerceller i Embryonic Sebrafisk

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Harnessing DNA Dye-utløst Side Population Fenotype for å oppdage og rense kreft stamceller fra biologiske prøver

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

En prekliniske musemodell Osteosarcoma definere den ekstracellulære Vesicle-mediert kommunikasjonen mellom svulst og Mesenchymal stamceller

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering og karakterisering av tumor-initiere celler fra sarkom pasient-avledet Xenotransplantater

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolering av menneskelig endotelceller fra Normal kolon og Colorectal Carcinoma - en forbedret protokoll

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymal stamceller isolert fra cellulose vev og co kultur kreftceller å studere deres samhandling

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Utvinning av ekstracellulære blemmer fra hele vev

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Romlig og Temporal kontroll av murine melanom innvielse fra mutant melanocyte stamceller

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolering av Stem-lignende celler fra 3-dimensjonale spheroid kulturer

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolering og funksjonell vurdering av humane brystkreftstamceller fra celle- og vevsprøver

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...