Name: isolation of exosome-enriched extracellular vesicles carrying granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from embryonic stem cells
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Somos gratos ao Sr. Arkadiusz Slusarczyk e à Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) por adquirir imagens de microscópio eletrônico de transmissão. Este trabalho foi apoiado em parte por subvenções do NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 e CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) e Free to Breathe Research Grant (K.Y.).

1. Culturing células ES-D3
<ol><li>Para gerar soro bovino fetal livre de exosome (FBS), carregue FBS em uma ultracentrifuagem e centrífuga a 100.000 x g por 16 h a 4 °C. Após a centrifugação, colete o supernante soro como FBS sem exosome para a cultura da linha celular ES-D3 e a aquisição de EVs enriquecidos com exosomos.</li>
	<li>Antes de emplacamento das células ES-D3, cubra pratos de cultura tecidual de 15 cm usando gelatina (0,1%) à temperatura ambiente por 30 minutos.</li>
	<li>Seguindo um pro...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Sakthiswary, R., Raymond, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+in+neurodegenerative+diseases:+From+principles+to+practice.">Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice.</a> Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).</li><li>Liu, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+restore+function+in+infarcted+hearts+of+non-human+primates.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates.</a> Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).</li><li>Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapy+for+type+1+diabetes+mellitus.">Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus.</a> Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication.">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).</li><li>Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+and+diagnostic+applications+of+extracellular+vesicles.">Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles.</a> Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).</li><li>Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Presentation+by+Extracellular+Vesicles+from+Professional+Antigen-Presenting+Cells.">Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells.</a> Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).</li><li>Kunigelis, K. E., Graner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Dichotomy+of+Tumor+Exosomes+(TEX)+in+Cancer+Immunity:+Is+It+All+in+the+ConTEXt?.">The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?.</a> Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).</li><li>Becher, B., Tugues, S., Greter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF:+From+Growth+Factor+to+Central+Mediator+of+Tissue+Inflammation.">GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation.</a> Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).</li><li>Conti, L., Gessani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF+in+the+generation+of+dendritic+cells+from+human+blood+monocyte+precursors:+recent+advances.">GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances.</a> Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).</li><li>Higano, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+data+from+2+randomized,+double-blind,+placebo-controlled,+phase+3+trials+of+active+cellular+immunotherapy+with+sipuleucel-T+in+advanced+prostate+cancer.">Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer.</a> Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).</li><li>Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+GM-CSF-based+cancer+immunotherapy.">Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy.</a> Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).</li><li>Dranoff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+irradiated+tumor+cells+engineered+to+secrete+murine+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+potent,+specific,+and+long-lasting+anti-tumor+immunity.">Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).</li><li>Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+1,+Unit+1C+4,+Culture+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).</li><li>Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+fluorescence+intensity+and+protein+expression+in+HeLa+cells+stably+transfected+with+hrGFP.">Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP.</a> Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).</li><li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+expression+of+hrGFP+by+mouse+embryonic+stem+cells:+promoter+activity+in+the+undifferentiated+state+and+during+dopaminergic+neural+differentiation.">Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation.</a> Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).</li><li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+embryonic+stem+cells+protects+against+lung+cancer:+is+a+broad-spectrum+prophylactic+vaccine+against+cancer+possible?.">Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?.</a> PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).</li><li>Dalby, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+transfection+with+Lipofectamine+2000+reagent:+primary+neurons,+siRNA,+and+high-throughput+applications.">Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications.</a> Methods. 33 (2), 95-103 (2004).</li><li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3,+Unit+3+22,+Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids.">Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , (2006).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+for+Immunoregulation+and+Therapeutic+Intervention+in+Cancer.">Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer.</a> Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).</li><li>Bunggulawa, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advancements+in+the+use+of+exosomes+as+drug+delivery+systems.">Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems.</a> Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).</li><li>Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proviral+silencing+in+embryonic+cells+is+regulated+by+Yin+Yang+1.">Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1.</a> Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).</li><li>Dranoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM-CSF-based+cancer+vaccines.">GM-CSF-based cancer vaccines.</a> Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).</li><li>Park, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Feeder+Cell+Types+on+Culture+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+In+Vitro.">Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro.</a> Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).</li><li>Lin, S., Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+culturing+mouse+and+human+embryonic+stem+cells.">Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).</li><li>Yaddanapudi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+GM-CSF+expressing+embryonic+stem+cells+are+an+effective+prophylactic+vaccine+for+cancer+prevention.">Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention.</a> OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).</li></ol>

Este estudo mostra um método altamente eficiente de produção de EVs enriquecidos com exosomos carregando a proteína imuno-estimulante GM-CSF, que pode ser empregada para estudar os efeitos imuno-modulatórios de EVs enriquecidos com exosomos. Vários estudos sugerem que os exosóis exibem funções imuno-regulatórias e anti-tumores22. Assim, exosóis de ESCs expressando GM-CSF também podem possuir atividades biológicas que regulam a resposta imune. Neste protocolo, o exógeno murine GM-CSF ...

Os ESCs são derivados do estágio blastocisto de um embrião de pré-implantação1. Como células-tronco pluripotentes, os ESCs têm a capacidade de se auto-renovar e diferenciar-se em qualquer tipo de célula embrionária. Devido ao seu notável potencial de desenvolvimento e capacidade proliferativa a longo prazo, os CES são extremamente valiosos para a pesquisa biomédica1. Os esforços atuais de pesquisa têm se concentrado em grande parte no potencial terapêutico das ESCs para uma variedade de doenças patológicas graves, incluindo diabetes, doenças cardíacas e doenças neurodegenerativas2,3,4.
As células mamíferas, incluindo os ESCs, são conhecidas por liberar vesículas com tamanhos variáveis para o ambiente extracelular, e esses EVs possuem muitas funções fisiológicas e patológicas devido ao seu papel na comunicação intercelular5. Entre diferentes subtipos de EVs, exósmos são pequenas vesículas de membrana liberadas de vários tipos de células para o espaço extracelular após a fusão de compartimentos endocíticos intermediários, corpos multivesiculares (MVBs), com a membrana plasmática6. Exosomos têm sido relatados para mediar a comunicação intercelular e estão criticamente envolvidos em muitos processos (patho)fisiológicos7,8. Exosomos herdam algumas funções biológicas de suas próprias células parentais, porque exosomos contêm materiais biológicos adquiridos a partir do citosol, incluindo proteínas e ácidos nucleicos. Assim, os antígenos ou fatores associados que estimulam a resposta imune específica para uma determinada doença são encapsulados nos exossomos de determinados tipos de células9. Isso abriu caminho para testes clínicos explorando exosóis derivados de tumores como uma vacina anticâncativa10.
GM-CSF é uma citocina secretada por diferentes tipos de células imunes11. Evidências emergentes demonstram que o GM-CSF ativa e regula o sistema imunológico e desempenha um papel essencial no processo de apresentação de antígenos12. Por exemplo, um relatório clínico sugere que o GM-CSF estimula a resposta imune aos tumores como adjuvante da vacina13. Várias estratégias de imunoterapia contra o câncer baseadas em GM-CSF para explorar a potente atividade imuno-estimulante do GM-CSF têm sido investigadas em ensaios clínicos14. Entre elas, uma vacina contra o câncer composta por células tumorais irradiadas de GM-CSF tem mostrado alguma promessa em pacientes com melanoma avançado, induzindo respostas de antitumorais celulares e humorais e necrose subsequente em tumores metástases15.
Como os exosóis derivados de ESCs possuem atividades biológicas semelhantes às ESCs originais, talvez exosósmos portadores de GM-CSF de ESCs possam funcionar como vesículas livres de células para regular a resposta imune. Neste artigo, é descrito um método detalhado para produzir EVs exossome enriquecidos de alta qualidade de ESCs expressando GM-CSF. Esses EVs exosome enriquecidos têm o potencial de servir como vesículas imuno-regulatórias para modular a resposta imune.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphate, Calf Intestinal</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>Dephosphorylating DNA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Annexin V mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone H-3, sc-74438</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_1118989</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD81 mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone B-11, sc-166029</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_2275892</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-cytochrome c mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone A-8, sc-13156</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_627385</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flotillin-1 mAb</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>clone C-2; sc-74566</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_2106563</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH pAb</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>600-401-A33S</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_11182910</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31430</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_228307</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAb</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>clone 20E8C12 A21348</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_221509</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAb</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ADI-SPA-890</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_10616242</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31460</td>
			<td>Western blot, RRID:AB_228341</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA (bicinchoninic acid) assay</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>23223</td>
			<td>Determining protein concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>M42015</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin, Disodium Salt</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10177012</td>
			<td>Selecting E. coli colonies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, Avanti J-26 XPI</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge rotor, JA-10</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>09U1597</td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottle, Nalgene PPCO</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3120-0500PK</td>
			<td>Low speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cu grids with carbon support film</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FF200-Cu</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EcoRI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0101</td>
			<td>Digesting DNA plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced chemiluminescence detection system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>32106</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACScalibur flow cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Examining GFP levels of ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRR-30-2020</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40&#956;m</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22-363-547</td>
			<td>Filtering ES-D3 cells for FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin (0.1%)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ES006B</td>
			<td>Culturing ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF ELISA kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>88733422</td>
			<td>Determining GM-CSF concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10-829-018</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRL0131-0100</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfecting ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader, PowerWave XS</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Determining GM-CSF concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP high-speed cell sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>Isolating single ES-D3 cell clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2988J</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10-131-035</td>
			<td>Selecting ES-D3 clones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SH3023801</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat dry milk</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NC9022655</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
			<td>Transfecting ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>sc45000-652</td>
			<td>Medium for ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>37270</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membranes</td>
			<td>Millipore EMD</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Ligation Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M2200S</td>
			<td>Generating GM-CSF expression plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HT7700</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>45000-660</td>
			<td>Culturing ES-D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge rotor, 45Ti</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>09U4454</td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge polycarbonate bottle</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>355622</td>
			<td>High speed centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UranyLess staining solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22409</td>
			<td>Acquiring electron microscopy images</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of exosome-enriched extracellular vesicles carrying granulocyte-macrophage colony-stimulating factor from embryonic stem cells

As células-tronco embrionárias (ESCs) são células-tronco pluripotentes capazes de auto-renovação e diferenciação em todos os tipos de células embrionárias. Como muitos outros tipos de células, os ESCs liberam pequenas vesículas de membrana, como exosomos, para o ambiente extracelular. Os exosóis servem como mediadores essenciais da comunicação intercelular e desempenham um papel básico em muitos processos (patho)fisiológicos. O fator estimulante da colônia granulocito-macrófago (GM-CSF) funciona como uma citocina para modular a resposta imune. A presença de GM-CSF em exosóis tem o potencial de aumentar sua função imuno-regulatória. Aqui, GM-CSF foi expressado na linha de células ESC murina ES-D3. Um protocolo foi desenvolvido para isolar vesículas extracelulares supercelulares (EVs) de células ES-D3 superexpressas GM-CSF. EVs isolados enriquecidos com exosome foram caracterizados por uma variedade de abordagens experimentais. É importante ressaltar que quantidades significativas de GM-CSF foram encontradas presentes em EVs exosome enriquecidos. No geral, os EVs exosóicos enriquecidos por GM-CSF dos ESCs podem funcionar como vesículas livres de células para exercer suas atividades imuno-reguladoras.

O GM-CSF é superexpresso em ESCs murine. Para expressar de forma estável GM-CSF em células ES-D3, o cDNA murine GM-CSF foi clonado em um vetor de transfecção para gerar a expressão vetor pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP(Figura 1A). O GM-CSF foi superexpresso em células ES-D3 por transfecção, e cerca de 20% das células ES-D3 transitóriamente transfectadas foram GFP-positivos. Clones de células que expressam demais o GM...

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Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

Este estudo descreve um método para isolar vesículas extracelulares exosome enriquecidas carregando fatores estimulantes da colônia de granulocitos imunes de células-tronco embrionárias.

Isolamento de vesículas extracelulares exosome enriquecidas carregando fator estimulante da colônia granulocito-macrófago de células-tronco embrionárias

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Nosso protocolo pode ser usado para produzir vesículas extracelulares exosome enriquecidas de alta qualidade a partir de células-tronco embrionárias que expressam o fator estimulante imunológico, GM-CSF. As vesículas extracelulares enriquecidas exósias que carregam GM-CSF têm o potencial de servir a vesículas regulatórias imunológicas livres de células que podem modular a resposta imune. Pesquisadores com o treinamento básico de biologia molecular e celular, devem ser capazes de facilmente, como poderia este protocolo, mas qualquer pessoa que realize este protocolo pela primeira vez deve seguir as instruções de perto.Como nosso protocolo é complicado, visualizar os detalhes intrincados de cada etapa ajudará outros pesquisadores a gerar FBS livres exosome, ultracentrifuugar o volume desejado de FBS e coletar o supernatante livre exosome. Antes de emplacamento do ESD três células, cubra pratos de cultura tecidual de 15 centímetros com gelatina de 0,1% à temperatura ambiente por 30 minutos. Remova a Gelatina por aspiração e cultura a ESD três células sem células de camada alimentadora em ESD três culturas celulares média a 37 graus Celsius em 5% Dióxido de carbono umaidificado incubadora até que as células atinjam 90% de confluência.Lave as culturas quase confluentes com cinco mililitros de 0,05% de trippsina por prato seguido de uma incubação de cinco minutos a 37 graus Celsius em trippsina fresca. No final da incubação puxe as células separadas em um tubo de centrífuga e inativa a trippsina com cinco mililitros de meio de cultura fresca. Sedimentar as células por centrifugação e suspender as paletes em meio fresco para contar para a passagem, placa cinco vezes 10 a o sexto do ESD três células em 15 mililitros de cultura celular meio em novas placas revestidas de gelatina para três dias de cultura antes de sub-cultivar as células Para coletar a cultura celular supernatante para o isolamento de placa de vesículas extracelular enriquecida um vezes 10 para o sétimo ESD três células em 15 mililitros de cultura celular médio por nova placa revestida de gelatina por três dias antes de coletar os supernacantes da cultura celular Para o isolamento extra de vesícula celular enriquecido, primeiro sedimentar os fragmentos de células grandes dentro dos supernantes coletados de 72 horas cultivadas ESD três células por centrifugação.Depois de coletar o supernascido, ultracentrifuugar as amostras e descartar os supernantes. Enxágue suavemente cada palette duas vezes com um mililitro de PBS por lavagem para remover qualquer supernanato de cultura residual e quantificar o teor exósiado de proteína vesícula extracelular com um ensaio de ácido bicinchonínico, de acordo com a instrução do fabricante. Em seguida, suspenda novamente as vesículas extracelulares enriquecidas em PBS a uma concentração de seis microgramas por micrometro para armazenamento a menos 80 graus Celsius.Para visualizar as vesículas extracelulares enriquecidas exósias por microscopia eletrônica de transmissão fixe três a cinco microgramas por mililitro das vesículas extracelulares com a concentração final de paraformaldeído de rede de microscópio de 2% a temperatura ambiente por duas horas. No final da incubação, carregue 10 microlitadores das amostras fixas em grades de cobre com película de suporte de carbono por um minuto antes de drenar as grades com papel filtro, fique nas grades com uma solução de coloração adequada, de acordo com o protocolo do fabricante e use pinças para transferir as grades para um pedaço de papel filtro, em seguida, use o microscópio eletrônico de transmissão com uma ampliação de 50.000 vezes para adquirir imagens de microscopia eletrônica, de acordo com os protocolos padrão. Para preparar extratos celulares inteiros, colete ESD três células da cultura como demonstrado, e suspenda as células colhidas na PBS para contagem.Após uma segunda centrifugação, suspenda as células de cinco vezes 10 para a terceira células por microliter de buffer de carregamento de página SDS contendo concentração de SDS de 0,5% e Sonicate as amostras por 10 segundos em um Sonicator com uma amplitude de 10%. Em seguida, aqueça as amostras a 100 graus Celsius por cinco minutos. Para preparar lises para as vesículas extracelulares exósias enriquecidas, suspenda novamente as vesículas extracelulares enriquecidas em tampão de carregamento de página SDS contendo 0,5% SDS a 1,2 microgramas por concentração de microliter e Sonicate as amostras por 10 segundos, como demonstrado, então aqueça as amostras a 100 graus Celsius por cinco minutos.Para a Western Blot Analysis, carregue 10 extratos por atacado de microliter e amostras de liseto de vesícula extracelular enriquecido em wells individuais de um gel de página de estresse melhor. No final da corrida, transfira as proteínas para as membranas PVDF e incuba as membranas com os anticorpos primários e secundários apropriados de interesse, em seguida, detecte a expressão proteica usando um kit de detecção de chemiluminescência aprimorada, de acordo com as instruções do fabricante. Para avaliar a quantidade de GM-CSF dentro de vesículas extracelulares exóricas enriquecidas, use um kit Murine GM-CSF para revestir uma placa ELISA com anticorpo anti GM-CSF de captura em seguida, tratar 0,6 microgramas de amostras de vesículas extracelulares enriquecidas exósias com 100 microlitrais de PBS sozinho, ou PBS mais 0,05% interpolação 20 a temperatura ambiente por 30 minutos.Ao final da incubação, adicione as amostras tratadas aos Poços individuais da placa ELISA preparada para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente, seguida pela lavagem dos Poços correspondentes apropriados apenas com PBS, ou PBS mais 0,05% interpolação 20. Após a lavagem, adicione o anticorpo de detecção às amostras para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente, seguido de uma lavagem apenas com PBS ou PBS mais 0,05% entre 20 como demonstrado, em seguida, adicione Avidin Horseradish Peroxidase às amostras para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, seguido de uma lavagem e medindo a absorção em cada poço em um Leitor de Microplata a 450 nações. A intensidade de fluorescência GFP de um GM-CSF expressando ESD três linhas celulares ou uma linha de três células ESD expressando um vetor vazio é muito maior do que a de seus colegas parentais.ELISA revela que três células expressas GM-CSF produzem níveis notavelmente mais altos de GMCSF em sua cultura celular supernaduante do que células vazias de controle vetorial. Além disso, a quantidade de GM-CSF gerada pela GM-CSF expressando ESD três células é semelhante à produzida por fibroblastos STO que expressam GM-CSF. A microscopia eletrônica de transmissão de vesículas extracelulares isoladas de culturas celulares transduzidas por vetores e GM-CSF revelam vesículas de diferentes tamanhos que se enquadram na faixa esperada de 30 a 100 nanômetros de diâmetro.A expressão de marcadores exosômicos, incluindo CD81, Anexo V e flotillina-1 é marcadamente aprimorada em vesículas extracelulares, isoladas de ESD três células em comparação com extratos de atacado correspondentes pela análise de manchas ocidentais. É importante ressaltar que não foi detectada a presença de outros marcadores de compartimento subcelular em ESD três vesículas extracelulares derivadas, incluindo o marcador de ânticulo endoplasmático, Isomerase de Dissulfeto proteico, os marcadores mitocondriais, o complexo citocromo C e Oxphos IV-subunit IV e o marcador citosolmático GAPDH. Após a lavagem com 0,05% de interpolação 20, os níveis gm-CSF de fundo detectados no controle Vesículas extracelulares foram significativamente reduzidos.Em contraste, os níveis de GM-CSF nas vesículas extracelulares das células expressas GM-CSF foram significativamente aumentados por interpolação 20. Adquirir vesículas extracelulares supercelulares enriquecidas de alta qualidade carregando GMCSF é o passo mais importante para o sucesso deste protocolo. Os pesquisadores podem realizar experimentos adicionais, como estudos em linhas celulares e animais dependentes de GM-CSF para determinar se vesículas extracelulares enriquecidas que cuidam do GM-CSF podem funcionar como vesículas regulatórias imunológicas livres de células.Essas vesículas extracelulares enriquecidas exósmos podem então ser usadas para explorar como a modulação da resposta imune afeta diferentes condições da doença.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

Comportamento invasiva de células de cancro da mama humano em Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Pesquisa do câncer

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Aprovação do DNA Dye-desencadeada fenótipo de população lateral para detectar e purificar células-tronco de câncer de amostras biológicas

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Um modelo de Mouse pré-clínicos de osteossarcoma para definir a comunicação mediada por vesículas extracelular entre Tumor e as células-tronco mesenquimais

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolamento e caracterização de células iniciantes tumorais de sarcoma de xenoenxertos derivados do paciente

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolamento de células endoteliais humanas do cólon Normal e Carcinoma colorrectal - um protocolo melhorado

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido pulpar e co-cultura com células cancerosas para estudar suas interações

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Extração de vesículas extracelulares de todo tecido

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Controle espacial e temporal da iniciação de melanoma murino de células-tronco de melanócitos mutantes

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolamento de células-tronco a partir de culturas esferóides tridimensionais

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...