Name: a porcine corneal endothelial organ culture model using split corneal buttons
Uploaded: 2019-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons at JoVE.com

ودعم إنشاء نموذج البحث المقدم من قبل KMU-ايفنتيف (FKZ: 13GW0037F) من وزاره التعليم والبحوث الاتحادية في ألمانيا.

ويتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية الاخلاقيه لمؤسستنا. وفقا للنظام الأساسي للجنة المراجعة الاخلاقيه لمؤسستنا ، لم يكن يجب الحصول علي موافقه اخلاقيه قبل التجارب ، كما تم الحصول علي جميع القرنيات الخنازير من المسلخ المحلي.
1-ثقافة الجهاز
<ol><li>اعداد عيون الخنازير.<ol>
<li>م?...

<ol>
	<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking.">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li><li>Roy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro.">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).</li><li>Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+density+in+porcine+corneas+after+exposure+to+hypotonic+solutions.">Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).</li><li>Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+temporary+hypothermia+on+corneal+endothelial+cell+density+during+organ+culture+preservation.">Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).</li><li>Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+temporary+hyperthermia+on+corneal+endothelial+cell+survival+during+organ+culture+preservation.">Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).</li><li>Kunzmann, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+Of+A+Porcine+Corneal+Endothelial+Organ+Culture+Model+For+Research+Purposes.">Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes.</a> Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).</li><li>Redbrake, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histochemical+study+of+the+distribution+of+dextran+500+in+human+corneas+during+organ+culture.">A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture.</a> Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamines+for+Deswelling+of+Organ-Cultured+Corneas.">Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas.</a> Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).</li><li>Filev, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-quantitative+assessments+of+dextran+toxicity+on+corneal+endothelium:+conceptual+design+of+a+predictive+algorithm.">Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).</li><li>Pels, E., Schuchard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-culture+preservation+of+human+corneas.">Organ-culture preservation of human corneas.</a> Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).</li><li>Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology,+Histology+and+Ultrastructure+of+Human+C31+Organ-Cultured+Corneas.">Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas.</a> Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).</li><li>Linke, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+cornea+cultivation:+long-term+experience+in+a+single+eye+bank.">Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank.</a> Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).</li><li>Schroeter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbeitsrichtlinien+-+Gute+Fachliche+Praxis+f&#252;r+Hornhautbanken+[Procedural+guidelines.+Good+tissue+practice+for+cornea+banks].">Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis f&#252;r Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks].</a> Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).</li><li>Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+swelling+pressure+of+the+corneal+stroma.">The swelling pressure of the corneal stroma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 1, 158-162 (1962).</li><li>Xuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+corneal+stroma:+importance+in+visual+function.">Proteins of the corneal stroma: importance in visual function.</a> Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).</li><li>Sperling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Corneal+Endothelium+in+Organ+Culture+-+The+Influence+of+Temperature+and+Medium+of+Incubation.">Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation.</a> Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).</li><li>Schroeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Evaluation+in+the+Cornea+Bank.">Endothelial Evaluation in the Cornea Bank.</a> Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).</li><li>Pels, E., Schuchard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+High+Molecular+Weight+dextran+on+the+Presevation+of+Human+Corneas.">The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas.</a> Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).</li><li>van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopy+of+Cultured+Human+Corneas+Osmotic+Hydration+and+the+Use+of+dextran+Fraction+(dextran+T+500)+in+Organ+Culture.">Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture.</a> Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).</li><li>Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+compound-free+medium+and+poloxamer+for+human+corneal+organ+culture+and+Deswelling.">Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).</li><li>Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+endothelial+cells+does+not+change+the+result+of+cell+density.">Staining of endothelial cells does not change the result of cell density.</a> Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).</li><li>Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+perfluorobutylpentane+(F4H5)+on+corneal+endothelial+cells.">Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells.</a> Current Eye Research. , (2019).</li><li>Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sand&#248;e, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+principle+-+mind+the+ethical+gap!.">The 3Rs principle - mind the ethical gap!.</a> ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).</li><li>Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parameters+of+the+porcine+eyeball.">The parameters of the porcine eyeball.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).</li><li>Kim, M. K., Hara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+corneal+xenotransplantation.">Current status of corneal xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Proliferative+Capacity+of+Genetically-Engineered+Pig+and+Human.">Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human.</a> Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).</li></ol>

يوفر هذا البروتوكول طريقه لاعداد الخنازير تقسيم أزرار القرنية ، والذي يمثل موحده ومنخفضه التكلفة السابقين الجسم الغشائي القرنية النموذج ثقافة الجهاز لأغراض البحث6. وأظهرت الخنازير انقسام القرنية أزرار انخفاض كثافة الخلايا البطانية مماثله لخسائر الخلايا البطانية التي لوحظ...

إجراءات زراعه القرنية هي من بين المزارع الأكثر شيوعا في جميع انحاء العالم1. كما ان هناك نقص حاد في القرنيات المتبرعين البشرية ، والبحوث التجريبية التي تعالج الخلايا البطانية القرنية في القرنيات البشرية من الصعب أداء1. ومع ذلك ، فان إدخال حلول الري وغيرها من المواد المستخدمة داخل العين ، والاجهزه البصرية المطاطية ، فضلا عن الاداات والتقنيات الجراحية (علي سبيل المثال ، أدوات الاستحلاب والتقنيات ، والطاقة الموجات فوق الصوتية) يتطلب تحقيقات صحيحه ومستفيضة فيما يتعلق بآثارها علي بطانة القرنية قبل الاستخدام السريري.
توجد بدائل قليله لقرنيات المتبرعين البشريين للبحوث. نماذج البحوث الحيوانية هي قيمه جدا ولكن في نفس الوقت تستهلك الموارد جدا وبشكل متزايد شكك أخلاقيا. العيب الرئيسي في ثقافات الخلايا الانبوبيه هو ترجمتها المحدودة للعين البشرية. النتائج التي تم الحصول عليها من ثقافات الخلايا يمكن ان تكون غير لائقه في ظروف الجسم الحي ، لان الخلايا قد تمر بمرحله انتقاليه البطانة الغشائية (EMT) ، مما يؤدي إلى الليفية مثل المورفولوجية الناجمة عن فقدان قطبيه الخلية والتغيرات في شكل الخلية والجينات التعبير2.
في حين ذكرت السابقة نماذج الجسم القديم زراعه فترات تصل إلى 120 h فقط ، وهي تقنيه اعداد رواية لإنشاء نموذج ثقافة القرنية الغشاء الوركي الجهاز عن طريق ذبح القرنيات الخنازير الطازجة لمده 15 يوما علي الأقل وقد أدخلت مؤخرا3 ،4،5،6. إذا تمت أزاله ظهاره القرنية وأجزاء من ستروما (حوالي 300 μm في المجموع) من القرنية قبل الزراعة ، يتم تقليل تورم سدي في انقسام أزرار القرنية مما ادي إلى فقدان اقل الخلايا البطانية وبطانية الحفاظ عليها بشكل جيد طبقه الخلية بعد ما يصل إلى 15 يوما ، في حين ان أزرار القرنية غير المنقسمة تظهر خسارة كبيره في الخلايا البطانية بسبب تورم الورم المفتول وتشكيل طيات Descemet. عاده ما تستخدم بنوك العيون عوامل التشبع بالهواء الخافض للحرارة مثل ديكدكان لتقليل تورم القرنيات قبل الزرع. ومع ذلك, وأظهرت هذه العوامل للحث علي زيادة فقدان الخلايا البطانية7,8,9.
تهدف هذه المقالة إلى تصور هذا نموذج البحوث السابقة الفيفو الموحدة في بروتوكول مفصل خطوه بخطوه من أجل تمكين المحققين في المستقبل لاجراء البحوث علي بطانة القرنية باستخدام أزرار القرنية الانقسام. ويمثل هذا النموذج طريقه مباشره لاختبار المواد والتقنيات المستخدمة داخل العين ، مثل الاجهزه البصرية المطاطية ، وحلول الري ، وطاقة الموجات فوق الصوتية ، أو غيرها من الإجراءات التي يكون فيها بطانة القرنية من الفائدة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Subject</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pig eyes</td>
			<td>local abbatoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substances</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium 1, #F9016</td>
			<td>Biochrom GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Biochrom GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypotonic balanced salt solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td>per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidon iodine 7.5%, Braunol</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl) 0.9%</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH) solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials &#38; Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu-jet pro</td>
			<td>Brand GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker Glass 50 mL</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt cannula incl. Filter (5 &#181;m) 18G</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate (12 well)</td>
			<td>Corning Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette</td>
			<td>Eppendorf AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Bulb Holder</td>
			<td>L. Klein, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded Filter &#248; 185 mm</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hockey knife</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MillexGV Filter (5 &#181;m)</td>
			<td>Merck Millopore Ltd., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needler holder</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR International, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel (single use), triangular blade</td>
			<td>Aesculap AG &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cups</td>
			<td>Greiner Bio-One, &#214;sterreich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td>Paul Hartmann AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical drape</td>
			<td>Paul Hartmann AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stitch scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6</td>
			<td>Ethicon Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (5 mL)</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trephine &#248; 7.5 mm</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tying forceps</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment &#38; Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular surgical microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera mounted on microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Entry (software)</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold-light source</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Olympus GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer with heating function</td>
			<td>IKA-Werke GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter pHenomenal</td>
			<td>VWR International, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS2</td>
			<td>Adobe Systems, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Ohaus Europe GmbH, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a porcine corneal endothelial organ culture model using split corneal buttons

يرتبط البحث التجريبي علي الخلايا البطانية القرنية مع العديد من الصعوبات. القرنيات المتبرعة البشرية نادره ونادرا ما تكون متاحه للتحقيقات التجريبية لأنها عاده ما تكون ضرورية لزرع. الخلايا البطانية الثقافات في كثير من الأحيان لا تترجم بشكل جيد في الحالات المجرية. نظرا للخصائص الهيكلية الحيوية لقرنيات غير البشرية ، فان تورم الورم اللحمية اثناء الزراعة يؤدي إلى فقدان الخلايا البطانية القرنية الكبيرة ، مما يجعل من الصعب القيام بالزراعة لفتره طويلة من الزمن. وتستخدم عوامل أزاله الترسبات مثل دكديكان لمواجهه هذه الاستجابة. ومع ذلك ، فانها تسبب أيضا فقدان الخلايا البطانية كبيره. ولذلك ، تم إنشاء نموذج ثقافة الجهاز السابق الجسم الذي لا يتطلب وكلاء القاع. واستخدمت عيون الخنازير من مسلخ محلي لاعداد أزرار القرنية الانقسام. بعد التراص الجزئي القرنية ، تمت أزاله الطبقات الخارجية من القرنية (ظهاره ، طبقه بومان ، وأجزاء من سدي). هذا يقلل بشكل كبير من فقدان الخلايا البطانية القرنية الناجمة عن تورم الورم الدموي الضخم وطي غشاء Descemet في جميع انحاء فترات زراعه أطول ويحسن الحفاظ العام علي طبقه الخلايا البطانية. وتبع ذلك أزاله القرنية الكاملة اللاحقة من الجزء المتبقي من زر القرنية من لمبة العين والزراعة. وتم تقييم كثافة الخلايا البطانية في أوقات المتابعة التي تصل إلى 15 يوما بعد الاعداد (اي الأيام 1 و 8 و 15) باستخدام المجهر الضوئي. تقنيه التحضير المستخدمة تسمح بحفظ أفضل لطبقه الخلايا البطانية التي يتم تمكينها من خلال تورم الانسجه الأقل تضخما ، مما يؤدي إلى انخفاض معدلات الانحدار البطيء والخطي في انقسام أزرار القرنية مقارنه بالقرنيات المتبرعة البشرية. وبما ان هذا النموذج الموحد للبحوث الذي يزرع عاده للمرة الاولي يسمح بزراعه مستقره لمده أسبوعين علي الأقل ، فهو بديل قيم لقرنيات المتبرعين البشريين بالنسبة للتحقيقات المستقبلية للعوامل الخارجية المختلفة فيما يتعلق الآثار علي بطانة القرنية.

تقنيه التشريح المعروضة تعني الازاله الجزئية للانسجه اللحمية ، مما يؤدي إلى ارق عينه القرنية التالي التورم الأقل تضخما (الشكل 1 والشكل 2). اقل تورم الورم يدفع اقل القص وقرصه القوات التي لها تاثير سلبي علي بطانة القرنية ، مما تسبب في انخفاض م?...

Watch this Scientific Journal Video about A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons at JoVE.com

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

هنا ، يتم تقديم بروتوكول خطوه بخطوه لاعداد وزراعه الخنازير الانقسام أزرار القرنية. كما يظهر هذا النموذج العضوي المزروع عاده معدلات وفيات الخلايا في غضون 15 يوما ، مقارنه بالقرنيات المتبرعة البشرية ، فانه يمثل النموذج الأول الذي يسمح للزراعة طويلة الأجل من القرنيات غير البشرية دون أضافه السامة ديكسان.

نموذج ثقافة الجهاز البطانية القرنية الخنازير باستخدام أزرار القرنية الانقسام

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

يقدم هذا البروتوكول النموذج البحثي الأول الذي يسمح بزراعة الخلايا البطانية القرنية على المدى الطويل من الخلايا القرنية التي تحققت مع إعداد أزرار القرنية المنقسمة. عن طريق إزالة جزئيا طبقات القرنية الخارجية، يتم تقليل فقدان الخلايا البطانية بشكل كبير، مما يسمح بزراعة الخلايا البطانية القرنية لمدة 15 يوما على الأقل. ولذلك، فإن هذا النموذج قيمة للتحقيق في آثار مواد محددة أو تقنيات ذات فائدة مثل حلول الري أو الأجهزة الفيسكويلاستيكية العينية على endothelium القرنية.بعد تلقي عيون الخنازير التي أزيلت بعد الوفاة بعد فترة وجيزة، واستخدام مقص العين والملقط القولونية لإزالة كل من adnexes المدارية. ضع خمسة إلى ستة عيون في محلول PBS اليود في خمسة في المئة لمدة خمس دقائق لتطهير أسطح العين بشكل صحيح ، مع التحريك الدقيق مرة واحدة في الدقيقة لضمان غمر الأسطح بالكامل لتحقيق تطهير كامل. بعد خمس دقائق، نقل العينين المطهرتين إلى كوب من برنامج تلفزيوني نقي، وتحريك بعناية لغسل دقيق محلول برنامج تلفزيوني اليود من أسطح العين.قبل البدء في تشريح, استخدام قسطرة حادة لملء حقنة خمسة ملليلتر مع مليلتر اثنين من مصل عجل الجنين ذاب حديثا, وسلالة المصل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر في 80 ملليلتر من الدكستران خالية من الثقافة المتوسطة. يهيج بلطف الخليط لتحقيق توزيع متجانس للمصل، وإضافة ثلاثة ملليلترات من المتوسطة إلى كل بئر من لوحة ثقافة الخلايا 12-جيدا. عندما تكون اللوحة جاهزة، قم بنقل لمبة عين إلى حامل لمبة العين تحت مجهر جراحي للعيون مع القرنية التي تواجهها، واستخدم حقنة مملوءة بكلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪لتطبيق شفط طفيف على العين على حامل لمبة العين لإصلاح العين في مكانها.استخدام التريبين التي تحتوي على تطعيم موحدة لقطع سطحيا في القرنية المركزية، لا أعمق من 300 ميكرومتر، واستخدام ملقط كوليبري ومشرط واحد الاستخدام مع شفرة مثلثة لقطع وإزالة جزء من القرنية جزئيا من خلال ستروما. وضع سطحيا خياطة 10-0 في ستروما للسماح التمايز من endothelial من الجانب stromal خلال التجارب، دون اختراق endothelium القرنية، واستخدام trephine دون تطعيم للتقدم قطع trephine إلى العمق الكامل حتى يتم التوصل إلى غرفة العين الأمامية. ويمكن أن ينظر إلى انخفاض واضح في المقاومة والسوائل تسرب من غرفة العين الأمامية بعد اختراق كامل للقرنية.ضع زر القرنية المنقسم الذي تم الحصول عليه الذي يحتوي على جزء من الستروما، وغشاء Descemet، وشقة القرنية في بئر واحد من لوحة 12-well مع الجانب الموسومة التي تواجه لأسفل. ثم تسمية كل بئر على لوحة الثقافة مع عدد فردي لكل زر قرنية تقسيم لتحديد أثناء عمليات المتابعة. عندما تم جمع جميع أزرار القرنية ، ضع لوحة 12 بئرًا في حاضنة ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، وخمسة في المئة من ثاني أكسيد الكربون ، والرطوبة بنسبة 95 ٪ ، لتحل محل السوبر في اليوم الثامن إذا تم تجاوز فترة حضانة لمدة سبعة أيام.لإجراء فحص غير مطعّم، أضف ثلاثة ملليلترات من محلول الملح المتوازن الهابطي إلى كل بئر من ألواح 12 بئرًا، واتّسم بعناية زر قرنية منقسم في كل بئر للحث على تورم الخلايا البطانية القرنية، وتحسين رؤية الخلايا للعد. بعد دقيقة إلى دقيقتين، استخدم كاميرا المجهر للحصول على ما لا يقل عن ثلاث صور لثلاث مناطق مختلفة من بطانة الغدد العضلية للحصول على انطباع تمثيلي للحالة الفعلية للاندورفين القرنية، وإضافة شريط مقياس بطول صحيح إلى مقياس 100 ميكرومتر للتحليل لاحقًا. لمنع تلف التناضح، قم بنقل زر القرنية المنقسم من الحل بعد خمس دقائق كحد أقصى إلى الوسط الثقافي.لإجراء فحص ملون، ضع أزرار القرنية المنقسمة في أطباق بيتري الفردية، والجانب البطاني للأعلى، واستخدم ماصة لإسقاط 0.25٪ Trypam حل أزرق على كل endothelium القرنية لمدة 90 ثانية لكل عينة. المقبل، بعناية شطف الأزرار ثلاث مرات في كلوريد الصوديوم 0.9٪في كوب زجاجي صغير قبل استخدام ماصة لإسقاط ببطء 0.2٪ Alizarin الأحمر S الحل على endothelia لمدة 90 ثانية. ثم صورة العينات كما أظهرت للتو.لإعداد الصور لتقييم كثافة الخلايا ومورفولوجيا، افتح الصور في برنامج تحرير الرسومات المناسب ومشروع مربع مع طول الجانب الحقيقي إلى مقياس من 100 ميكرومتر على الصورة. لاقص شريط المقياس، استخدم أداة التحديد المستطيلة لتحديد شريط المقياس وتحديد التحرير والمحاصيل. انقر فوق ملف وجديد، وحدد الحافظة.لاحظ وحدات البكسل المقابلة للصور الأخرى وانقر فوق موافق. انقر فوق ملف وجديد مرة أخرى، ثم قم بإدراج عرض وطول مربع العد بالبكسل في الإطار المنبثق وفقاً لطول شريط المقياس. حدد الأبيض كـ لون خلفية، ثم انقر فوق موافق لتحديد الكل، ثم نسخ الصورة المحددة. حدد صورة endothelium القرنية ولصق مربع على endothelium القرنية.حدد الطبقة المربعة وقم بتعيين التعتيم إلى 30٪ ثم انقر فوق موافق ثم احفظ الصورة مع المربع المسقط بطول الشريحة الحقيقية إلى الحجم 100 ميكرومتر. لتقييم كثافة الخلايا البطانية، افتح الصور مع المربعات المتوقعة في ImageJ، وافتح المكوّن الإضافي لعارض الخلية. لحساب الخلايا داخل المربع، انقر فوق تهيئة لحساب الخلايا البطانية على جانبي المربع، ثم قم بتسجيل النتيجة.لتقييم المعلمات المورفولوجية، عد الاجتماع المشترك لا يقل عن أربع خلايا لكل حد خلية، والمظهر المميز على شكل وردة، ومناطق أليسارين الأحمر داخل المربعات المتوقعة. على مدى فترة 15 يوما، أزرار القرنية الانقسام تظهر انخفاضا مطردا في كثافة الخلايا البطانية، مع متوسط نسبة أسبوعية فقدان الخلايا البطانية من 4.90٪ تلطيخ طبقة الخلية البطانية في اليوم 15 يسمح التحليل المورفولوجي للخلايا القرنية، مع أرقام الإصلاح تشكل ما يقرب من سبعة في المئة من حدود الخلية دمج، وهو متوسط لتشكيل وردة واحدة تقريبا لكل عينة ملليمتر مربع ، وحوالي 13 فقدان الخلايا في الوقت المحدد لكل ملليمتر مربع. هنا، يمكن ملاحظة صور تمثيلية للبصال القرنية خلال التقييم المجهري في محلول الملح المتوازن الهاونتوني، وبعد التلطيخ باللون الأزرق Trypan وAlzarin Red S.إذا كانت تزرع أزرار القرنية الانقسام مع الجانب البطانية التي تواجه أسفل، من المتوقع الأضرار واسعة الخلايا البطانية. أزرار القرنية غير المنقسمة تعاني من زيادة كبيرة في فقدان الخلايا البطانية بسبب تورم السترومال ، مما تسبب في طي غشاء Descemet على مدى 15 يومًا من الزراعة ، في حين أن أزرار القرنية المنقسمة تظهر بطانة قرنية محفوظة إلى حد كبير بعد 15 يومًا من الزراعة ، كما يتضح من المناطق المتناثرة الملطخة بالمواعيد Alizarin Red الملطخة ، مما يدل على وجود خلايا واحدة مدمرة. لتقليل فقدان الخلايا، يجب الحرص على عدم لمس بطانة القرنية في جميع مراحل هذا البروتوكول.

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

متحد البؤر المجهري القرنية : رواية غير الغازية تقنيات لقياس الصغيرة الأمراض الليفية في اعتلال الأعصاب المحيطية

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

القرنية تحضير الأنسجة من الجهات المانحة لغشائي keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

والقلوي حرق الإصابات نموذج من القرنية اتساع الأوعية الدموية في ماوس

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

الفئران زرع القرنية: نموذج لدراسة الشكل الأكثر شيوعا من الصلبة زراعة الأعضاء

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

القرنية تحضير الأنسجة المانحة لديسميه غشاء القرنية غشائي

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, ...

Technique of Porcine Liver Procurement and Orthotopic Transplantation using an Active Porto-Caval Shunt

تقنية المشتريات الكبد الخنازير وزرع مثلي باستخدام أحدث بورتو الأجوف التحويلة

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

سحجه الظهارة القرنية مع لدغ العين كنموذج للقرنية التئام الجروح

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

السابقين فيفو الجهاز القرنية الثقافة النموذجية لالتئام الدراسات

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

تطوير نموذج تجريبي غير باضع بمساعدة الليزر لفقدان الخلايا الانهوفية القرنية

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Orthotopic Kidney Auto-Transplantation in a Porcine Model Using 24 Hours Organ Preservation And Continuous Telemetry

عملية زرع الكلى التلقائية في نموذج بورسين باستخدام 24 ساعة لحفظ الأعضاء والقياس المستمر عن بعد

In the present era of organ transplantation with critical organ shortage, various strategies are employed to expand the pool of available allografts for ...