Name: a porcine corneal endothelial organ culture model using split corneal buttons
Uploaded: 2019-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons at JoVE.com

Etableringen af den præsenterede forskningsmodel blev støttet af KMU-Inno (FKZ: 13GW0037F) fra Forbundsministeriet for undervisning og forskning Tyskland.

Denne protokol følger vores institutions etiske retningslinjer. I overensstemmelse med vedtægterne for vores institutions etiske undersøgelsesudvalg skulle der ikke indhentes etisk godkendelse forud for forsøgene, da alle svine horn blev indhentet fra det lokale slagteri.
1. organ kultur
<ol><li>Forbered grise øjne.<ol>
<li>Fra det lokale slagteri, få grise øjne, der blev fjernet kort efter slagtning, men før termisk behandling. Transportere øjnene til laboratoriet og behandle dem i...

<ol>
	<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking.">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li><li>Roy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro.">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).</li><li>Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+density+in+porcine+corneas+after+exposure+to+hypotonic+solutions.">Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).</li><li>Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+temporary+hypothermia+on+corneal+endothelial+cell+density+during+organ+culture+preservation.">Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).</li><li>Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+temporary+hyperthermia+on+corneal+endothelial+cell+survival+during+organ+culture+preservation.">Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).</li><li>Kunzmann, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+Of+A+Porcine+Corneal+Endothelial+Organ+Culture+Model+For+Research+Purposes.">Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes.</a> Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).</li><li>Redbrake, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histochemical+study+of+the+distribution+of+dextran+500+in+human+corneas+during+organ+culture.">A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture.</a> Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamines+for+Deswelling+of+Organ-Cultured+Corneas.">Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas.</a> Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).</li><li>Filev, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-quantitative+assessments+of+dextran+toxicity+on+corneal+endothelium:+conceptual+design+of+a+predictive+algorithm.">Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).</li><li>Pels, E., Schuchard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-culture+preservation+of+human+corneas.">Organ-culture preservation of human corneas.</a> Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).</li><li>Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology,+Histology+and+Ultrastructure+of+Human+C31+Organ-Cultured+Corneas.">Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas.</a> Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).</li><li>Linke, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+cornea+cultivation:+long-term+experience+in+a+single+eye+bank.">Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank.</a> Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).</li><li>Schroeter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbeitsrichtlinien+-+Gute+Fachliche+Praxis+f&#252;r+Hornhautbanken+[Procedural+guidelines.+Good+tissue+practice+for+cornea+banks].">Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis f&#252;r Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks].</a> Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).</li><li>Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+swelling+pressure+of+the+corneal+stroma.">The swelling pressure of the corneal stroma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 1, 158-162 (1962).</li><li>Xuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+corneal+stroma:+importance+in+visual+function.">Proteins of the corneal stroma: importance in visual function.</a> Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).</li><li>Sperling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Corneal+Endothelium+in+Organ+Culture+-+The+Influence+of+Temperature+and+Medium+of+Incubation.">Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation.</a> Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).</li><li>Schroeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Evaluation+in+the+Cornea+Bank.">Endothelial Evaluation in the Cornea Bank.</a> Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).</li><li>Pels, E., Schuchard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+High+Molecular+Weight+dextran+on+the+Presevation+of+Human+Corneas.">The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas.</a> Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).</li><li>van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopy+of+Cultured+Human+Corneas+Osmotic+Hydration+and+the+Use+of+dextran+Fraction+(dextran+T+500)+in+Organ+Culture.">Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture.</a> Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).</li><li>Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+compound-free+medium+and+poloxamer+for+human+corneal+organ+culture+and+Deswelling.">Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).</li><li>Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+endothelial+cells+does+not+change+the+result+of+cell+density.">Staining of endothelial cells does not change the result of cell density.</a> Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).</li><li>Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+perfluorobutylpentane+(F4H5)+on+corneal+endothelial+cells.">Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells.</a> Current Eye Research. , (2019).</li><li>Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sand&#248;e, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+principle+-+mind+the+ethical+gap!.">The 3Rs principle - mind the ethical gap!.</a> ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).</li><li>Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parameters+of+the+porcine+eyeball.">The parameters of the porcine eyeball.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).</li><li>Kim, M. K., Hara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+corneal+xenotransplantation.">Current status of corneal xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Proliferative+Capacity+of+Genetically-Engineered+Pig+and+Human.">Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human.</a> Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).</li></ol>

Denne protokol giver en metode til fremstilling af svin split cornea-knapper, som repræsenterer en standardiseret og billig ex vivo cornea endotel organ kulturmodel til forskningsformål6. Porcin split cornea-knapper viste et fald i endotel celletætheden, der kan sammenlignes med endotelcelletab observeret i human donor hornhinder dyrket i øjen banker over en to-ugers periode6,10,11, <sup c...

Cornea-transplantationer procedurer er blandt de hyppigst udførte transplantationer over hele verden1. Da der er en alvorlig mangel på menneskelige donor hornhinder, eksperimentel forskning adressering cornea endotheliale celler i humane hornhinder er vanskeligt at udføre1. Men indførelsen af vandings løsninger og andre stoffer, der anvendes i øjet, oftalmisk viskoelastisk udstyr, samt kirurgiske instrumenter og teknikker (f. eks, phacoemulgering instrumenter og teknikker, ultralyd energi) kræver og omfattende undersøgelser vedrørende deres virkninger på cornea-endotelet før klinisk brug.
Der findes få alternativer til human donor hornhinder til forskning. Dyre forskningsmodeller er meget værdifulde, men på samme tid meget ressourceforbrugende og i stigende grad spørgsmålstegn etisk. En stor ulempe ved in vitro-cellekulturer er deres begrænsede oversættelse til det menneskelige øje. Resultater opnået fra cellekulturer kan være inkongruous til in vivo betingelser, fordi cellerne kan gennemgå endotel mesenchymal Transition (EMT), hvilket resulterer i fibroblast-lignende morfologi forårsaget af tab af celle polaritet og ændringer i celle form og gen udtryk2.
Der henviser til, at tidligere ex vivo-modeller rapporterede dyrkningsperioder på op til kun 120 h, en ny forberedelses teknik til at etablere en endotel organ kulturmodel af svine horn ved dyrkning af fersk gris hornhinder i mindst 15 dage, blev for nylig introduceret3 ,4,5,6. Hvis cornea epitel og dele af stroma fjernes (ca. 300 μm i alt) fra hornhinden før dyrkning, er hævelse af stroma reduceret i Split cornea-knapper, hvilket resulterer i mindre endotel celle tab og en velholdt endotel cellelaget efter op til 15 dage, hvorimod ikke-opdelte cornea-knapper viser signifikant endotelcelletab på grund af ujævn strin ende hævelse og dannelse af afkalktes folder. Øjen banker bruger normalt osmotiske deswelling agenter såsom dextran at reducere hævelse af hornhinder før transplantation. Men, disse agenter viste sig at inducere øget endotelcelletab7,8,9.
Denne artikel har til formål at visualisere denne standardiserede ex vivo forskningsmodel i en detaljeret trin-for-trin protokol for at gøre det muligt for fremtidige efterforskere til at udføre forskning på cornea endotelet ved hjælp af Split cornea knapper. Denne model repræsenterer en enkel metode til at teste stoffer og teknikker, der anvendes i øjet, såsom oftalmisk viskoelastisk udstyr, vandings løsninger, og ultralyd energi, eller andre procedurer, hvor hornhinden endotelet er af interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Subject</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pig eyes</td>
			<td>local abbatoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substances</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium 1, #F9016</td>
			<td>Biochrom GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Biochrom GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypotonic balanced salt solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td>per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidon iodine 7.5%, Braunol</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl) 0.9%</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH) solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials &#38; Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu-jet pro</td>
			<td>Brand GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker Glass 50 mL</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt cannula incl. Filter (5 &#181;m) 18G</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate (12 well)</td>
			<td>Corning Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette</td>
			<td>Eppendorf AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Bulb Holder</td>
			<td>L. Klein, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded Filter &#248; 185 mm</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hockey knife</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MillexGV Filter (5 &#181;m)</td>
			<td>Merck Millopore Ltd., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needler holder</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR International, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel (single use), triangular blade</td>
			<td>Aesculap AG &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cups</td>
			<td>Greiner Bio-One, &#214;sterreich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td>Paul Hartmann AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical drape</td>
			<td>Paul Hartmann AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stitch scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6</td>
			<td>Ethicon Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (5 mL)</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trephine &#248; 7.5 mm</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tying forceps</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment &#38; Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular surgical microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera mounted on microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Entry (software)</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold-light source</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Olympus GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer with heating function</td>
			<td>IKA-Werke GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter pHenomenal</td>
			<td>VWR International, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS2</td>
			<td>Adobe Systems, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Ohaus Europe GmbH, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a porcine corneal endothelial organ culture model using split corneal buttons

Eksperimentel forskning i cornea endotheliale celler er forbundet med flere vanskeligheder. Human donor hornhinder er knappe og sjældent til rådighed for eksperimentelle undersøgelser, da de normalt er nødvendige for transplantation. Endotelcelle kulturer oversætter ofte ikke godt til in vivo-situationer. På grund af de biostrukturelle egenskaber af ikke-humane corneas, stromale hævelse under dyrkning inducerer betydelige cornea endotel celle tab, hvilket gør det vanskeligt at udføre dyrkning i en længere periode. Deswelling-agenter som dextran anvendes til at modvirke dette respons. Men, de også forårsage signifikant endotel celle tab. Der blev derfor fastlagt en ex vivo-organ dyrknings model, som ikke krævede deswelling-midler. Grise øjne fra et lokalt slagteri blev brugt til at forberede split cornea-knapper. Efter delvis cornea-trephination blev de yderste lag af hornhinden (epithelium, Bowman lag, dele af stroma) fjernet. Dette reducerer markant cornea endotel celletab induceret af massive stromale hævelse og Descemets membran folde hele længere dyrkningsperioder og forbedrer generel bevarelse af endotelcellelag. Efterfølgende fuldstændig cornea-udmejsling blev efterfulgt af fjernelsen af Split cornea-knappen fra den resterende øjen pære og dyrkning. Endotel celletæthed blev vurderet ved opfølgnings tider på op til 15 dage efter klargøring (dvs. dag 1, 8, 15) ved hjælp af let mikroskopi. Den anvendte forberedelses teknik giver mulighed for en bedre bevaring af endotelcellelag, der er aktiveret ved mindre stromale vævshævelse, hvilket resulterer i langsom og lineær tilbagegang i Split cornea-knapper svarende til human donor corneas. Da denne standardiserede organo-typisk dyrkede forskningsmodel for første gang giver mulighed for en stabil dyrkning i mindst to uger, er det et værdifuldt alternativ til human donor hornhinder til fremtidige undersøgelser af forskellige eksterne faktorer med hensyn til deres virkninger på hornhinde endothelium.

Den præsenterede dissektions teknik indebærer delvis fjernelse af stromale væv, hvilket resulterer i en tyndere cornea prøve og dermed mindre stromale hævelse (figur 1 og figur 2). Mindre stromale hævelse inducerer mindre forskydning og knibe kræfter, der har en negativ indvirkning på cornea endothelium, dermed forårsager lavere endoteliale celle tab satser6. Split cornea-knapper viser et signifik...

Watch this Scientific Journal Video about A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons at JoVE.com

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

Her præsenteres en trin-for-trin-protokol til tilberedning og dyrkning af Porcin split cornea-knapper. Da denne organo-typisk dyrkede organ kulturmodel viser celledødelighed inden for 15 dage, sammenlignelige med human donor hornhinder, det repræsenterer den første model, der tillader langvarig dyrkning af ikke-humane hornhinder uden at tilføje giftige dextran.

En Ornesen Endothelial organ kultur model ved hjælp af Split cornea-knapper

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

Denne protokol præsenterer den første forskningsmodel, der tillader organotypisk langtidsdyrkning af hornhinde endotelceller opnået med forberedelse af split hornhinde knapper. Ved delvis at fjerne de ydre hornhindelag reduceres etendotelcelletabet betydeligt, hvilket gør det muligt at dyrke hornhindeendolale celler i mindst 15 dage. Derfor er denne model værdifuld til at undersøge virkningerne af specifikke stoffer eller teknikker af interesse såsom vandingsløsninger eller oftalmologiske viskoelastiske anordninger på hornhinden endotel.Efter at have modtaget gris øjne, der blev fjernet kort efter mortem, bruge øjet saks og Colibri kraftvipper til at fjerne alle de orbital adnexes. Placer fem til seks øjne i fem procent jod PBS opløsning i alt fem minutter til korrekt desinficere øjet overflader, med omhyggelig omrøring en gang i minuttet for at sikre, at overfladerne er helt nedsænket for at opnå en fuldstændig desinfektion. Efter fem minutter overføres de desinficerede øjne til en kop ren PBS, og den omrøres forsigtigt for grundigt at vaske jod PBS-opløsningen fra øjenfladerne.Før dissektionen påbegyndes, skal du bruge et stumpt kateter til at fylde en fem millilitersprøjte med to milliliter frisk optøet føtal kalveserum, og serum gennem et 0,22 mikrometerfilter belastes i 80 milliliter dextranfrit dyringsmedie. Forsigtigt omrøre blandingen for at opnå en homogen fordeling af serum, og tilsæt tre milliliter af mediet til hver brønd af en 12-brønd celle kultur plade. Når pladen er klar, overføres en øjenpær til en øjenpæreholder under et oftalmisk kirurgisk mikroskop med hornhinden opad, og brug en sprøjte fyldt med 0,9 % natriumchlorid til at påføre øjet en let sugning over øjenpæreholderen for at fikse øjet på plads.Brug en trephine, der indeholder en standardiseret indlæg til at skære overfladisk ind i den centrale hornhinde, ikke dybere end 300 mikrometer, og bruge Colibri kraftang og en engangs-skalpel med en trekantet klinge til at skære og fjerne delvist trephined fragment af hornhinden vandret gennem stroma. Overfladisk placere en 10-0 sutur i stroma at tillade differentiering af endotel fra den stromale side under forsøgene, uden at trænge ind i hornhinden endotel, og bruge en trephine uden et indlæg til at fremme trephin skåret til den fulde dybde, indtil den forreste øjenkammer er nået. Et tydeligt fald i modstand og væske, der lækker fra det forreste øjenkammer, kan opfattes efter fuldstændig indtrængning af hornhinden.Placer den opnåede split hornhinde knap, der indeholder en del af stroma, Descemet membran, og hornhinden endotel i en brønd af 12-brønd plade med den mærkede side vender nedad. Derefter mærke hver brønd på kulturpladen med et individuelt nummer for hver split hornhinde knap til identifikation under opfølgninger. Når alle hornhinden knapper er blevet indsamlet, placere 12-brønd plade i en celle kultur inkubator på 37 grader celsius, fem procent kuldioxid, og 95% fugtighed, der erstatter supernatant på dag otte, hvis en syv-dages inkubationstid overskrides.For at udføre en uhæmmet undersøgelse, tilsættes tre milliliter hypotonisk afbalanceret saltopløsning til hver brønd af en 12-brønd plade, og omhyggeligt placere en enkelt split hornhinde knap i hver brønd til at fremkalde hævelse af hornhinden endotelceller, og for at forbedre synligheden af cellerne til optælling. Efter et til to minutter, bruge et mikroskop kamera til at erhverve mindst tre billeder af tre forskellige områder af endotelet for at opnå et repræsentativt indtryk af den faktiske tilstand af hornhinden endotel, og tilsæt en skala bar med den sande-til-skala længde på 100 mikrometer til senere analyse. For at undgå osmotiske skader overføres den opdelte hornhindeknap fra opløsningen efter højst fem minutter tilbage til kulturmediet.For at udføre en plettet undersøgelse, placere split hornhinde knapper i individuelle petriskåle, endotel side op, og bruge en pipette til langsomt at falde 0,25% Trypam blå opløsning på hver hornhinde endotel i 90 sekunder pr prøve. Dernæst skylles knapperne omhyggeligt tre gange i 0,9% natriumchlorid i et lille glasbæger, før du bruger en pipette til langsomt at falde 0,2% Alizarin Red S opløsning på endothelia i 90 sekunder. Så billede prøverne som netop demonstreret.For at forberede billederne til celletæthed og morfologi vurdering, åbne billederne i en passende grafik redigering software program og projicere en firkant med en sand-til-skala sidelængde på 100 mikrometer på billedet. Hvis du vil beskære skalalinjen, skal du bruge det rektangulære markeringsrammeværktøj til at afgrænse skalalinjen og vælge rediger og beskære. Klik på fil og ny, og vælg Udklipsholder.Bemærk de tilsvarende pixel for de andre billeder, og klik på OK. Klik på filen og nyt igen, og indsæt bredden og længden af tællepladsen i pixel i pop op-vinduet i henhold til skalalinjens længde. Vælg hvid som baggrundsfarve, og klik på OK for at markere alle, og kopiér det markerede billede. Vælg billedet af hornhinden endotel og indsæt pladsen på hornhinden endotel.Vælg det firkantede lag, og angiv opaciteten til 30 %Klik derefter på OK, og gem billedet med den projicerede firkant med diaslængden på 100 mikrometer. Hvis du vil vurdere endotelcelletætheden, skal du åbne billederne med de projicerede firkanter i ImageJ og åbne celletællerplugp. Hvis du vil tælle cellerne i kvadratet, skal du klikke initialisere for at tælle endotelcellerne på to sider af pladsen og registrere resultatet.For at vurdere de morfologiske parametre skal du tælle det fælles møde mellem mindst fire celler pr. cellekant, det karakteristiske rosetformede udseende og Alizarin Røde områder inden for de projicerede firkanter. Over en periode på 15 dage viser split hornhindeknapper et støt fald i endotelcelletætheden med et gennemsnitligt ugentligt procentviscelletab på 4,90 %Farvning af endotelcellelaget på dag 15 giver mulighed for morfologisk analyse af hornhindensceller, hvor reformationstallene udgør ca. syv procent af de fusionerende cellegrænser, en median på ca. en rosettedannelse pr. , og omkring 13 punktlige celletab pr. millimeter kvadreret. Her kan repræsentative billeder af hornhinden endotel under mikroskopisk evaluering i hypotonisk afbalanceret saltopløsning, og efter farvning med Trypan blå og Alizarin Red S, observeres.Hvis de opdelte hornhindeknapper dyrkes med endotelsiden nedad, kan der forventes omfattende endotelcelleskader. Ikke-split hornhinde knapper lider betydeligt øget endotel celletab på grund af stromale hævelse, forårsager Descemet's membran foldning over 15 dages dyrkning, mens split hornhinde knapper udviser en stort set bevaret hornhinde endotel efter 15 dages dyrkning, som det fremgår af spredte punktlige Alizarin Rød-farvede områder, tegn på enkelt ødelagte celler. For at minimere celletab skal man passe på ikke at røre hornhinden endotel i alle trin i denne protokol.

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Corneal donorvæv Forberedelse til Endothelial keratoplasti

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

En Alkali-burn Injury Model hornhindeneovaskularisering i mus

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Murin hornhindetransplantation: en model til at studere den mest almindelige form for organtransplantation

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

Cornea donorvæv Forberedelse til Descemet membran Endothelial Keratoplasty

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, ...

Technique of Porcine Liver Procurement and Orthotopic Transplantation using an Active Porto-Caval Shunt

Teknik af porcin Liver Indkøb og ortotopisk Transplantation ved hjælp af en Active Porto-Caval Shunt

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Hornhindens epitel slid med okulær Burr som en Model for hornhinden sårheling

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo sårheling hornhinde orgel kultur Model for undersøgelser

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Udvikling af en noninvasive, Laser-Assisteret eksperimentel model af Hornhinde Endotel Cell Loss

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Orthotopic Kidney Auto-Transplantation in a Porcine Model Using 24 Hours Organ Preservation And Continuous Telemetry

Ortopisk nyre auto-transplantation i en porcine model ved hjælp af 24 timers organbevarelse og kontinuerlig telemetri

In the present era of organ transplantation with critical organ shortage, various strategies are employed to expand the pool of available allografts for ...