Name: a porcine corneal endothelial organ culture model using split corneal buttons
Uploaded: 2019-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons at JoVE.com

De oprichting van het gepresenteerde onderzoeksmodel werd gesteund door KMU-Innovativ (FKZ: 13GW0037F) van het federale ministerie van onderwijs en onderzoek Duitsland.

Dit protocol volgt de ethische richtlijnen van onze instelling. In overeenstemming met de statuten van de Commissie voor ethische toetsing van onze instelling, moest voorafgaand aan de experimenten geen ethische goedkeuring worden verkregen, omdat alle varkens cornea's werden verkregen van het lokale slachthuis.
1. orgel cultuur
<ol><li>Bereid varkens ogen.<ol>
<li>Van het plaatselijke slachthuis, het verkrijgen van varkens ogen die kort na het slachten zijn verwijderd maar vóór thermische...

<ol>
	<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking.">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li><li>Roy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro.">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).</li><li>Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+density+in+porcine+corneas+after+exposure+to+hypotonic+solutions.">Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).</li><li>Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+temporary+hypothermia+on+corneal+endothelial+cell+density+during+organ+culture+preservation.">Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).</li><li>Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+temporary+hyperthermia+on+corneal+endothelial+cell+survival+during+organ+culture+preservation.">Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).</li><li>Kunzmann, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+Of+A+Porcine+Corneal+Endothelial+Organ+Culture+Model+For+Research+Purposes.">Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes.</a> Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).</li><li>Redbrake, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histochemical+study+of+the+distribution+of+dextran+500+in+human+corneas+during+organ+culture.">A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture.</a> Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamines+for+Deswelling+of+Organ-Cultured+Corneas.">Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas.</a> Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).</li><li>Filev, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-quantitative+assessments+of+dextran+toxicity+on+corneal+endothelium:+conceptual+design+of+a+predictive+algorithm.">Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).</li><li>Pels, E., Schuchard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-culture+preservation+of+human+corneas.">Organ-culture preservation of human corneas.</a> Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).</li><li>Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology,+Histology+and+Ultrastructure+of+Human+C31+Organ-Cultured+Corneas.">Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas.</a> Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).</li><li>Linke, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+cornea+cultivation:+long-term+experience+in+a+single+eye+bank.">Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank.</a> Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).</li><li>Schroeter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbeitsrichtlinien+-+Gute+Fachliche+Praxis+f&#252;r+Hornhautbanken+[Procedural+guidelines.+Good+tissue+practice+for+cornea+banks].">Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis f&#252;r Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks].</a> Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).</li><li>Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+swelling+pressure+of+the+corneal+stroma.">The swelling pressure of the corneal stroma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 1, 158-162 (1962).</li><li>Xuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+corneal+stroma:+importance+in+visual+function.">Proteins of the corneal stroma: importance in visual function.</a> Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).</li><li>Sperling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Corneal+Endothelium+in+Organ+Culture+-+The+Influence+of+Temperature+and+Medium+of+Incubation.">Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation.</a> Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).</li><li>Schroeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Evaluation+in+the+Cornea+Bank.">Endothelial Evaluation in the Cornea Bank.</a> Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).</li><li>Pels, E., Schuchard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+High+Molecular+Weight+dextran+on+the+Presevation+of+Human+Corneas.">The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas.</a> Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).</li><li>van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopy+of+Cultured+Human+Corneas+Osmotic+Hydration+and+the+Use+of+dextran+Fraction+(dextran+T+500)+in+Organ+Culture.">Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture.</a> Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).</li><li>Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+compound-free+medium+and+poloxamer+for+human+corneal+organ+culture+and+Deswelling.">Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).</li><li>Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+endothelial+cells+does+not+change+the+result+of+cell+density.">Staining of endothelial cells does not change the result of cell density.</a> Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).</li><li>Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+perfluorobutylpentane+(F4H5)+on+corneal+endothelial+cells.">Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells.</a> Current Eye Research. , (2019).</li><li>Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sand&#248;e, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+principle+-+mind+the+ethical+gap!.">The 3Rs principle - mind the ethical gap!.</a> ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).</li><li>Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parameters+of+the+porcine+eyeball.">The parameters of the porcine eyeball.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).</li><li>Kim, M. K., Hara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+corneal+xenotransplantation.">Current status of corneal xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Proliferative+Capacity+of+Genetically-Engineered+Pig+and+Human.">Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human.</a> Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).</li></ol>

Dit protocol biedt een methode voor de bereiding van de corneale knoop knoppen van varkens, die een gestandaardiseerd en voordelig ex vivo corneale endotheliaal orgel cultuur model voor onderzoeksdoeleinden6vertegenwoordigt. Porcine Split corneale knoppen toonden een afname van de endotheliale celdichtheid vergelijkbaar met endotheliale celverliezen waargenomen bij menselijke donor cornea's gekweekt in oogbanken over een periode van twee weken6,...

Corneale transplantatie procedures behoren tot de meest frequent uitgevoerde transplantaties wereldwijd1. Aangezien er een ernstig tekort is aan menselijke donor cornea's, is experimenteel onderzoek naar het aanpakken van corneale endotheel cellen in menselijke cornea's moeilijk uit te voeren1. De introductie van irrigatie oplossingen en andere stoffen die in het oog worden gebruikt, oftalmische viscoelastische apparaten, evenals chirurgische instrumenten en technieken (bijv. phacoemulficatie-instrumenten en-technieken, ultrasone energie) vereist geldige en uitgebreide onderzoeken met betrekking tot hun effecten op het corneale endotheel vóór klinisch gebruik.
Er zijn weinig alternatieven voor de menselijke donor cornea's voor onderzoek. Dieronderzoek modellen zijn zeer waardevol, maar tegelijkertijd zeer hulpbronnen consumeren en steeds meer ethisch worden ondervraagd. Een groot nadeel van in vitro celculturen is hun beperkte vertaling naar het menselijk oog. Resultaten verkregen uit celculturen kunnen in vivo voorwaarden zijn, omdat cellen endotheliale mesenchymale overgang (EMT) kunnen ondergaan, resulterend in fibroblast-achtige morfologie veroorzaakt door het verlies van celpolariteit en veranderingen in de celvorm en het gen expressie2.
Terwijl eerdere ex vivo-modellen teelt perioden van maximaal 120 uur meldden, werd onlangs een nieuwe voorbereidings techniek voor het opzetten van een varkens corneale endotheliale orgel cultuur model door het kweken van vers varken cornea's gedurende ten minste 15 dagen geïntroduceerd3 ,4,5,6. Als het corneale epitheel en delen van de stroma worden verwijderd (ongeveer 300 μm in totaal) van het hoornvlies vóór de teelt, zwelling van de stroma wordt verlaagd in gesplitste corneale knoppen resulterend in minder endotheel celverlies en een goed onderhouden endotheliale cellaag na maximaal 15 dagen, terwijl niet-gesplitste corneale knoppen significant endotheel celverlies vertonen als gevolg van ongelijke stromale zwelling en vorming van de plooien van Descemet. Oogbanken gebruiken meestal osmotische dezwelling agenten zoals dextran om zwelling van cornea's te verminderen voorafgaand aan transplantatie. Echter, deze agenten werden aangetoond voor het opwekken van verhoogde endotheel celverlies7,8,9.
Dit artikel is bedoeld om dit gestandaardiseerde ex vivo onderzoeksmodel in een gedetailleerd stap-voor-stap protocol te visualiseren om toekomstige onderzoekers in staat te stellen onderzoek te doen naar het corneale endotheel met behulp van gesplitste corneale knoppen. Dit model is een eenvoudige methode om stoffen en technieken te testen die in het oog worden gebruikt, zoals oftalmische viscoelastische apparaten, irrigatie oplossingen en ultrasone energie, of andere procedures waarbij het corneale endotheel van belang is.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Subject</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pig eyes</td>
			<td>local abbatoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substances</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium 1, #F9016</td>
			<td>Biochrom GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Biochrom GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypotonic balanced salt solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td>per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidon iodine 7.5%, Braunol</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl) 0.9%</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH) solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials &#38; Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu-jet pro</td>
			<td>Brand GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker Glass 50 mL</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt cannula incl. Filter (5 &#181;m) 18G</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate (12 well)</td>
			<td>Corning Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette</td>
			<td>Eppendorf AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Bulb Holder</td>
			<td>L. Klein, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded Filter &#248; 185 mm</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hockey knife</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MillexGV Filter (5 &#181;m)</td>
			<td>Merck Millopore Ltd., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needler holder</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR International, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel (single use), triangular blade</td>
			<td>Aesculap AG &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cups</td>
			<td>Greiner Bio-One, &#214;sterreich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td>Paul Hartmann AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical drape</td>
			<td>Paul Hartmann AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stitch scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6</td>
			<td>Ethicon Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (5 mL)</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trephine &#248; 7.5 mm</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tying forceps</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment &#38; Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular surgical microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera mounted on microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Entry (software)</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold-light source</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Olympus GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer with heating function</td>
			<td>IKA-Werke GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter pHenomenal</td>
			<td>VWR International, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS2</td>
			<td>Adobe Systems, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Ohaus Europe GmbH, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a porcine corneal endothelial organ culture model using split corneal buttons

Experimenteel onderzoek naar corneale endotheliale cellen wordt geassocieerd met verschillende moeilijkheden. Menselijke donor cornea's zijn schaars en zelden beschikbaar voor experimentele onderzoeken, omdat ze normaalgesproken nodig zijn voor transplantatie. Endotheliale celculturen vertalen vaak niet goed naar in vivo situaties. Vanwege de biostructurele kenmerken van niet-menselijke cornea's induceert stromale zwelling tijdens de teelt substantieel verlies van corneale endotheliale cellen, waardoor het moeilijk is om de teelt voor een langere periode uit te voeren. Dezwelling agenten zoals dextran worden gebruikt om deze reactie tegen te gaan. Echter, ze veroorzaken ook aanzienlijke endotheel celverlies. Daarom is een ex vivo-orgel cultuur model vastgesteld dat geen dezwelling middelen nodig heeft. Varkens ogen van een plaatselijk slachthuis werden gebruikt om gesplitste corneale knoppen voor te bereiden. Na gedeeltelijke corneale trephination werden de buitenste lagen van het hoornvlies (epitheel, Bowman-laag, delen van de stroma) verwijderd. Dit vermindert aanzienlijk het corneale endotheelcelverlies geïnduceerd door massale stromale zwelling en het membraan van Descemet in langere teelt periodes en verbetert het algemene behoud van de endotheliale cellaag. Daaropvolgende volledige corneale trephination werd gevolgd door het verwijderen van de gesplitste corneale knop van de resterende oogbol en de teelt. De endotheliale celdichtheid werd beoordeeld bij follow-uptijden van maximaal 15 dagen na de bereiding (d.w.z. dagen 1, 8, 15) met behulp van lichte microscopie. De bereidingstechniek zorgt voor een beter behoud van de endotheliale cellaag die wordt ingeschakeld door minder stromale weefsel zwelling, wat resulteert in langzame en lineaire afname percentages in gesplitste corneale knoppen vergelijkbaar met menselijke donor cornea's. Aangezien dit gestandaardiseerde organo-typisch gecultiveerde onderzoeksmodel voor de eerste keer een stabiele teelt mogelijk maakt gedurende ten minste twee weken, is het een waardevol alternatief voor menselijke donor cornea's voor toekomstig onderzoek naar verschillende externe factoren met betrekking tot hun effecten op het corneale endotheel.

De gepresenteerde dissectie techniek impliceert gedeeltelijke verwijdering van stromale weefsel, resulterend in een dunner cornea monster en dus minder stromale zwelling (Figuur 1 en Figuur 2). Minder stromale zwelling induceert minder afschuiving en knijp krachten die een negatieve invloed hebben op het corneale endotheel, waardoor lagere endotheliale celverlies percentages6. Splitsen corneale knoppen ver...

Watch this Scientific Journal Video about A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons at JoVE.com

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

Hier wordt een stap-voor-stap protocol voor de bereiding en de teelt van de corneale knoppen van het varkens gesplitst. Aangezien dit organo-typisch gecultiveerde orgel cultuur model de celsterfte binnen 15 dagen weergeeft, vergelijkbaar met de menselijke donor cornea's, vertegenwoordigt het het eerste model dat langdurige teelt van niet-humane cornea's toestaat zonder toxische dextran toe te voegen.

Een porcine Corneale endotheliale orgel cultuur model met behulp van splitsen Corneale knoppen

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

Dit protocol presenteert het eerste onderzoeksmodel waardoor organotypische langetermijnteelt van hoornvliesendotheelcellen wordt bereikt met de voorbereiding van gespleten hoornvliesknoppen. Door de buitenste hoornvlieslagen gedeeltelijk te verwijderen, wordt het endotheelcelverlies aanzienlijk verminderd, waardoor de teelt van hoornvlies endotheelcellen gedurende ten minste 15 dagen mogelijk is. Daarom is dit model waardevol voor het onderzoeken van de effecten van specifieke stoffen of technieken van belang, zoals irrigatieoplossingen of oogheelkundige visco-elastische apparaten op het hoornvlies endotheel.Na ontvangst van varkensogen die kort na het mortem werden verwijderd, gebruik oogschaar en Colibri tang om alle orbitale adnexes te verwijderen. Plaats vijf tot zes ogen in vijf procent jodium PBS oplossing voor een totaal van vijf minuten om goed te desinfecteren de oogoppervlakken, met zorgvuldige roeren een keer per minuut om ervoor te zorgen dat de oppervlakken volledig zijn ondergedompeld om een volledige desinfectie te bereiken. Breng de gedesinfecteerde ogen na vijf minuten over op een kopje pure PBS en roer deze voorzichtig om de jodium PBS-oplossing grondig te wassen vanaf de oogoppervlakken.Gebruik voor het begin van de dissectie een stompe katheter om een spuit van vijf milliliter te vullen met twee milliliter vers ontdooid foetaal kalfsserum en zeef het serum door een filter van 0,22 micrometer in 80 milliliter vers kweekmedium. Roer het mengsel voorzichtig om een homogene verdeling van het serum te bereiken en voeg drie milliliter van het medium toe aan elke put van een celkweekplaat van 12 goed. Wanneer de plaat klaar is, breng een oogbol in een oogbol houder onder een oogheelkundige chirurgische microscoop met het hoornvlies naar boven, en gebruik een spuit gevuld met 0,9% natriumchloride om lichte zuigkracht toe te passen op het oog over de oogbol houder om het oog op zijn plaats te bevestigen.Gebruik een trephine met een gestandaardiseerde inleg om oppervlakkig te snijden in het centrale hoornvlies, niet dieper dan 300 micrometer, en gebruik Colibri tangen en een scalpel voor eenmalig gebruik met een driehoekig mes om het gedeeltelijk trephined fragment van het hoornvlies horizontaal door de stroma te snijden en te verwijderen. Plaats oppervlakkig een 10-0 hechting in de stroma om differentiatie van het endotheel van de stromale kant tijdens de experimenten mogelijk te maken, zonder het hoornvlies endotheel te penetreren, en gebruik een trephine zonder een inleg om de trephine te bevorderen die tot de volledige diepte wordt gesneden totdat de voorste oogkamer is bereikt. Een duidelijke daling van de weerstand en vloeistof lekken uit de voorste oogkamer kan worden waargenomen na volledige penetratie van het hoornvlies.Plaats de verkregen gesplitste hoornvliesknop met een deel van de stroma, het membraan van de Descemet en het hoornvlies endotheel in een put van de 12-put plaat met de getagde kant naar beneden gericht. Label vervolgens elke put op de kweekplaat met een individueel nummer voor elke gesplitste hoornvliesknop voor identificatie tijdens follow-ups. Wanneer alle hoornvliesknoppen zijn verzameld, plaatst u de 12-putplaat in een celkweek incubator op 37 graden Celsius, vijf procent kooldioxide en 95% vochtigheid, ter vervanging van de supernatant op dag acht als een zevendaagse incubatietijd wordt overschreden.Om een onbevlekt onderzoek uit te voeren, voeg drie milliliter hypotonische evenwichtige zoutoplossing toe aan elke put van een 12-bronplaat en plaats voorzichtig een enkele gespleten hoornvliesknop in elke put om zwelling van de hoornvlies endotheelcellen te induceren en om de zichtbaarheid van de cellen voor het tellen te verbeteren. Gebruik na één tot twee minuten een microscoopcamera om ten minste drie beelden van drie verschillende gebieden van het endotheel te verkrijgen om een representatieve indruk te krijgen van de werkelijke toestand van het hoornvliesdotheel en voeg een schaalbalk toe met de true-to-scale lengte van 100 micrometer voor latere analyse. Om osmotische schade te voorkomen, breng je de gespleten hoornvliesknop na maximaal vijf minuten terug naar het kweekmedium.Om een bevlekt onderzoek uit te voeren, plaatst u de gespleten hoornvliesknoppen in individuele petrischaaltjes, endotheelzijde omhoog, en gebruik een pipet om langzaam 0,25% Trypam-blauwe oplossing gedurende 90 seconden per exemplaar op elk hoornvlies endotheel te laten vallen. Spoel vervolgens voorzichtig de knoppen drie keer in 0,9% natriumchloride in een klein glazen bekerglas voordat u een pipet gebruikt om langzaam 0,2% Alizarin Red S-oplossing gedurende 90 seconden op de endothelia te laten vallen. Vervolgens beeld de monsters zoals net aangetoond.Als u de afbeeldingen wilt voorbereiden op de beoordeling van de celdichtheid en morfologie, opent u de afbeeldingen in een geschikt grafische bewerkingssoftwareprogramma en projecteert u een vierkant met een true-to-scale zijlengte van 100 micrometer op de afbeelding. Als u de schaalbalk wilt bijsnijden, gebruikt u het gereedschap Rechthoekig selectiekader om de schaalbalk te omcirkelen en bewerken en bijsnijden te selecteren. Klik op bestand en nieuw en selecteer klembord.Let op de bijbehorende pixels voor de andere afbeeldingen en klik op OK. Klik nogmaals op bestand en nieuw en voeg de breedte en lengte van het telvierkant in pixels in het pop-upvenster in op basis van de lengte van de schaalbalk. Selecteer wit als achtergrondkleur en klik op OK om alles te selecteren en kopieer de geselecteerde afbeelding. Selecteer de afbeelding van het hoornvlies endotheel en plak het vierkant op het hoornvlies endotheel.Selecteer de vierkante laag en stel de dekking in op 30%Klik vervolgens op OK en sla de afbeelding op met het geprojecteerde vierkant met de true-to-scale dialengte van 100 micrometer. Als u de endotheelceldichtheid wilt beoordelen, opent u de afbeeldingen met de geprojecteerde vierkanten in ImageJ en opent u de plug-in van de celteller. Als u de cellen binnen het vierkant wilt tellen, klikt u op initialiseren om de endotheelcellen aan twee zijden van het vierkant te tellen en het resultaat op te nemen.Om de morfologische parameters te beoordelen, telt u de gezamenlijke vergadering van ten minste vier cellen per celrand, het karakteristieke rozetvormige uiterlijk en de Roodgebieden van Alizarin binnen de geprojecteerde vierkanten. Over een periode van 15 dagen, split hoornvlies knoppen tonen een gestage daling van de endotheelceldichtheid, met een gemiddeld wekelijks percentage endotheelcelverlies van 4,90%Kleuring van de endotheliale cellaag op dag 15 maakt morfologische analyse van de hoornvliescellen, met hervormingscijfers die ongeveer zeven procent van de fuserende celgrenzen, een mediaan van ongeveer een rozetvorming per vierkante meter , en ongeveer 13 punctuele celverliezen per millimeter in het kwadraat. Hier kunnen representatieve afbeeldingen van het hoornvlies endotheel worden waargenomen tijdens microscopische evaluatie in hypotonische evenwichtige zoutoplossing, en na het bevlekken met Trypan blue en Alizarin Red S.Als de gespleten hoornvliesknoppen worden gecultiveerd met de endotheelzijde naar beneden gericht, is uitgebreide endotheelcelschade te verwachten. Niet-gespleten hoornvlies knoppen lijden aanzienlijk toegenomen endotheelcelverlies als gevolg van stromal zwelling, waardoor Descemet membraan vouwen meer dan 15 dagen van de teelt, terwijl gespleten hoornvlies knoppen vertonen een grotendeels bewaard hoornvlies endotheel na 15 dagen van de teelt, zoals blijkt uit verspreide punctuele Alizarin Rood-gekleurde gebieden, indicatief voor enkele vernietigde cellen. Om celverlies te minimaliseren, moet ervoor worden gezorgd dat het hoornvlies endotheel niet wordt aangeraakt tijdens alle stappen van dit protocol.

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

Corneale confocale microscopie: een nieuwe niet-invasieve techniek voor de Small Fibre Pathologie kwantificeren Perifere Neuropathieën

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Cornea donorweefsel Voorbereiding voor endothelial keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Een alkali-brandwonden Model van Cornea Neovascularisatie in de muis

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Muizen hoornvliestransplantatie: een model om de meest voorkomende vorm van een orgaantransplantatie Bestudeer

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

Hoornvlies donorweefsel Voorbereiding voor Descemet Endothelial Keratoplastie

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, ...

Technique of Porcine Liver Procurement and Orthotopic Transplantation using an Active Porto-Caval Shunt

Techniek van varkenslever Procurement en Orthotope transplantatie met behulp van een actieve Porto-Caval Shunt

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Hoornvlies epitheliale schuren met oogbeschadigingen en/of Burr als een Model voor hoornvlies wondgenezing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo wondgenezing hoornvlies orgel cultuur Model voor Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Ontwikkeling van een niet-invasieve, laser-assisted experimenteel model van hoornvlies endotheel celverlies

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Orthotopic Kidney Auto-Transplantation in a Porcine Model Using 24 Hours Organ Preservation And Continuous Telemetry

Orthotopische nier auto-transplantatie in een varkensmodel met behulp van 24 uur orgaanbehoud en continue telemetrie

In the present era of organ transplantation with critical organ shortage, various strategies are employed to expand the pool of available allografts for ...