Name: a porcine corneal endothelial organ culture model using split corneal buttons
Uploaded: 2019-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons at JoVE.com

Die Erstellung des vorgestellten Forschungsmodells wurde von KMU-innovativ (FKZ: 13GW0037F) des Bundesministeriums für Bildung und Forschung Deutschland unterstützt.

Dieses Protokoll folgt den ethischen Richtlinien unserer Institution. Gemäß den Statuten des Ethikprüfungsausschusses unserer Institution musste vor den Experimenten keine ethische Genehmigung eingeholt werden, da alle Schweinehornhäuschen vom örtlichen Schlachthof bezogen wurden.
1. Orgelkultur
<ol><li>Bereiten Sie Schweineaugen vor.<ol>
<li>Vom örtlichen Schlachthof erhalten Sie Schweineaugen, die kurz nach dem Mortem, aber vor der thermischen Behandlung entfernt wurden. Transportier...

<ol>
	<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking.">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li><li>Roy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro.">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).</li><li>Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+density+in+porcine+corneas+after+exposure+to+hypotonic+solutions.">Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).</li><li>Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+temporary+hypothermia+on+corneal+endothelial+cell+density+during+organ+culture+preservation.">Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).</li><li>Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+temporary+hyperthermia+on+corneal+endothelial+cell+survival+during+organ+culture+preservation.">Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).</li><li>Kunzmann, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+Of+A+Porcine+Corneal+Endothelial+Organ+Culture+Model+For+Research+Purposes.">Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes.</a> Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).</li><li>Redbrake, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histochemical+study+of+the+distribution+of+dextran+500+in+human+corneas+during+organ+culture.">A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture.</a> Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamines+for+Deswelling+of+Organ-Cultured+Corneas.">Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas.</a> Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).</li><li>Filev, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-quantitative+assessments+of+dextran+toxicity+on+corneal+endothelium:+conceptual+design+of+a+predictive+algorithm.">Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).</li><li>Pels, E., Schuchard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-culture+preservation+of+human+corneas.">Organ-culture preservation of human corneas.</a> Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).</li><li>Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology,+Histology+and+Ultrastructure+of+Human+C31+Organ-Cultured+Corneas.">Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas.</a> Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).</li><li>Linke, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+cornea+cultivation:+long-term+experience+in+a+single+eye+bank.">Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank.</a> Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).</li><li>Schroeter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbeitsrichtlinien+-+Gute+Fachliche+Praxis+f&#252;r+Hornhautbanken+[Procedural+guidelines.+Good+tissue+practice+for+cornea+banks].">Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis f&#252;r Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks].</a> Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).</li><li>Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+swelling+pressure+of+the+corneal+stroma.">The swelling pressure of the corneal stroma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 1, 158-162 (1962).</li><li>Xuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+corneal+stroma:+importance+in+visual+function.">Proteins of the corneal stroma: importance in visual function.</a> Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).</li><li>Sperling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Corneal+Endothelium+in+Organ+Culture+-+The+Influence+of+Temperature+and+Medium+of+Incubation.">Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation.</a> Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).</li><li>Schroeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Evaluation+in+the+Cornea+Bank.">Endothelial Evaluation in the Cornea Bank.</a> Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).</li><li>Pels, E., Schuchard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+High+Molecular+Weight+dextran+on+the+Presevation+of+Human+Corneas.">The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas.</a> Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).</li><li>van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopy+of+Cultured+Human+Corneas+Osmotic+Hydration+and+the+Use+of+dextran+Fraction+(dextran+T+500)+in+Organ+Culture.">Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture.</a> Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).</li><li>Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+compound-free+medium+and+poloxamer+for+human+corneal+organ+culture+and+Deswelling.">Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).</li><li>Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+endothelial+cells+does+not+change+the+result+of+cell+density.">Staining of endothelial cells does not change the result of cell density.</a> Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).</li><li>Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+perfluorobutylpentane+(F4H5)+on+corneal+endothelial+cells.">Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells.</a> Current Eye Research. , (2019).</li><li>Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sand&#248;e, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+principle+-+mind+the+ethical+gap!.">The 3Rs principle - mind the ethical gap!.</a> ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).</li><li>Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parameters+of+the+porcine+eyeball.">The parameters of the porcine eyeball.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).</li><li>Kim, M. K., Hara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+corneal+xenotransplantation.">Current status of corneal xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Proliferative+Capacity+of+Genetically-Engineered+Pig+and+Human.">Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human.</a> Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).</li></ol>

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Herstellung von Schweinesplit-Hornhautknöpfen, die ein standardisiertes und kostengünstiges ex vivo korneales endotheliales Organkulturmodell für Forschungszwecke darstellt6. Porcin Split Hornhautknöpfe zeigten eine Abnahme der Endothelzelldichte vergleichbar mit Endothelzellverlusten, die in menschlichen Spenderhornhäuten beobachtet wurden, die in Augenbänken über einen Zeitraum von zwei Wochen kultiviert wurden6,<...

Hornhauttransplantationsverfahren gehören zu den am häufigsten durchgeführten Transplantationen weltweit1. Da es einen schweren Mangel an menschlichen Spender Hornhäuten gibt, ist experimentelle Forschung zur Bekämpfung von Hornhautendothelzellen in menschlichen Hornhäuten schwierig,1durchzuführen. Die Einführung von Bewässerungslösungen und anderen im Auge verwendeten Substanzen, ophthalmologischen viskoelastischen Geräten sowie chirurgischen Instrumenten und Techniken (z. B. Phakoemulsifikationsinstrumente und -techniken, Ultraschallenergie) valide und umfangreiche Untersuchungen über ihre Auswirkungen auf das Hornhautendothel vor der klinischen Anwendung.
Für die Forschung gibt es nur wenige Alternativen zu menschlichen Spenderhornhäuten. Tierforschungsmodelle sind sehr wertvoll, aber gleichzeitig sehr ressourcenverbrauchend und zunehmend ethisch hinterfragt. Ein großer Nachteil der In-vitro-Zellkulturen ist ihre begrenzte Übersetzung in das menschliche Auge. Die Ergebnisse aus Zellkulturen können unpassend zu In-vivo-Bedingungen sein, da Zellen einen endotheliaalen mesenchymalen Übergang (EMT) durchlaufen können, was zu einer fibroblastenähnlichen Morphologie führt, die durch den Verlust der Zellpolarität und Veränderungen der Zellform und des Gens verursacht wird. Ausdruck2.
Während frühere Ex-vivo-Modelle Anbauzeiten von bis zu 120 h meldeten, wurde vor kurzem eine neuartige Zubereitungstechnik eingeführt, um ein Porenhorn-Endothel-Organkulturmodell zu etablieren, indem frische Schweinehornhäasen für mindestens 15 Tage kultiviert wurden3 ,4,5,6. Wenn das Hornhautepithel und Teile des Stroma vor der Kultivierung aus der Hornhaut entfernt werden (insgesamt ca. 300 m), wird die Schwellung des Stroma in gespaltenen Hornhautknöpfen reduziert, was zu einem geringeren Endothelzellverlust und einem gepflegten Endothel Zellschicht nach bis zu 15 Tagen, während nicht-gespaltene Hornhautknöpfe einen signifikanten Endothelzellverlust aufgrund ungleichmäßiger stromaler Schwellungen und der Bildung von Descemets Falten aufweisen. Augenbänke verwenden in der Regel osmotische Entschwellende Mittel wie Dextran, um die Schwellung von Hornhäuten vor der Transplantation zu reduzieren. Jedoch, Diese Agenten wurden gezeigt, dass erhöhte Endothelzellverlust7,8,9induzieren.
Dieser Artikel zielt darauf ab, dieses standardisierte Ex-vivo-Forschungsmodell in einem detaillierten Schritt-für-Schritt-Protokoll zu visualisieren, um zukünftigen Forschern die Durchführung von Forschungen am Hornhautendothel mit gespaltenen Hornhautknöpfen zu ermöglichen. Dieses Modell stellt eine einfache Methode dar, um Substanzen und Techniken zu testen, die im Auge verwendet werden, wie ophthalmologische viskoelastische Geräte, Bewässerungslösungen und Ultraschallenergie oder andere Verfahren, bei denen das Hornhautendothel von Interesse ist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Subject</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pig eyes</td>
			<td>local abbatoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substances</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium 1, #F9016</td>
			<td>Biochrom GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Biochrom GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypotonic balanced salt solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td>per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidon iodine 7.5%, Braunol</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl) 0.9%</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH) solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials &#38; Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu-jet pro</td>
			<td>Brand GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker Glass 50 mL</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt cannula incl. Filter (5 &#181;m) 18G</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate (12 well)</td>
			<td>Corning Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette</td>
			<td>Eppendorf AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Bulb Holder</td>
			<td>L. Klein, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded Filter &#248; 185 mm</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hockey knife</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MillexGV Filter (5 &#181;m)</td>
			<td>Merck Millopore Ltd., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needler holder</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR International, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel (single use), triangular blade</td>
			<td>Aesculap AG &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cups</td>
			<td>Greiner Bio-One, &#214;sterreich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td>Paul Hartmann AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical drape</td>
			<td>Paul Hartmann AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stitch scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6</td>
			<td>Ethicon Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (5 mL)</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trephine &#248; 7.5 mm</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tying forceps</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment &#38; Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular surgical microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera mounted on microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Entry (software)</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold-light source</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Olympus GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer with heating function</td>
			<td>IKA-Werke GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter pHenomenal</td>
			<td>VWR International, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS2</td>
			<td>Adobe Systems, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Ohaus Europe GmbH, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a porcine corneal endothelial organ culture model using split corneal buttons

Experimentelle Forschung an hornhauten Endothelzellen ist mit mehreren Schwierigkeiten verbunden. Menschliche Spenderhornhäuten sind knapp und selten für experimentelle Untersuchungen verfügbar, da sie normalerweise für eine Transplantation benötigt werden. Endothelzellkulturen übersetzen sich oft nicht gut in In-vivo-Situationen. Aufgrund der biostrukturellen Eigenschaften nichtmenschlicher Hornhäuten führt eine stromale Schwellung während der Kultivierung zu einem erheblichen Korneal-Endothelzellverlust, der die Kultivierung über einen längeren Zeitraum erschwert. Entschwellende Mittel wie Dextran werden verwendet, um dieser Reaktion entgegenzuwirken. Jedoch, Sie verursachen auch signifikanteen Endothelzellverlust. Daher wurde ein Ex-vivo-Organkulturmodell ohne Entschwellende Mittel etabliert. Schweineaugen aus einem örtlichen Schlachthof wurden verwendet, um gespaltene Hornhautknöpfe zuzubereiten. Nach partieller Hornhauttrephination wurden die äußeren Schichten der Hornhaut (Epithel, Bogenmannschicht, Teile der Stroma) entfernt. Dies reduziert signifikant den verlustfreien Hornhautzellverlust, der durch massive stromale Schwellungen und Descemets Membranfaltung über längere Kultivierungsperioden verursacht wird, und verbessert die allgemeine Erhaltung der Endothelzellschicht. Auf die anschließende vollständige Hornhauttrephination folgte die Entfernung des gespaltenen Hornhautknopfes aus der verbleibenden Augenzwiebel und der Kultivierung. Die Endothelzelldichte wurde in Folgezeiten von bis zu 15 Tagen nach der Zubereitung (d. h. tage 1, 8, 15) mittels Lichtmikroskopie bewertet. Die verwendete Zubereitungstechnik ermöglicht eine bessere Konservierung der Endothelzellschicht, die durch eine geringere stromale Gewebeschwellung ermöglicht wird, was zu langsamen und linearen Abnahmeraten in gespaltenen Hornhautknöpfen führt, die mit menschlichen Spenderhornhäuten vergleichbar sind. Da dieses standardisierte organotypisch kultivierte Forschungsmodell erstmals einen stabilen Anbau für mindestens zwei Wochen ermöglicht, ist es eine wertvolle Alternative zu menschlichen Spenderhornhäuten für zukünftige Untersuchungen verschiedener externer Faktoren in Bezug auf ihre Wirkungen auf das Hornhautendothel.

Die vorgestellte Seziertechnik impliziert eine teilweise Entfernung von Stromgewebe, was zu einer dünneren Hornhautprobe und damit zu einer geringeren stromalen Schwellung führt (Abbildung 1 und Abbildung 2). Weniger stromale Schwellungen induziert weniger Scher- und Prisenkräfte, die einen negativen Einfluss auf das Hornhautendothel haben, wodurch niedrigere Endothelzellverlustraten6verursacht werden. ...

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A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Herstellung und Kultivierung von Schweinespaltenhornknöpfen vorgestellt. Da dieses organotypisch kultivierte Organkulturmodell innerhalb von 15 Tagen Zellsterblichkeitsraten zeigt, vergleichbar mit menschlichen Spenderhornhäuten, stellt es das erste Modell dar, das eine langfristige Kultivierung nichtmenschlicher Hornhäuten ohne Zugabe von giftigem Dextran ermöglicht.

Ein Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Modell mit Split Corneal Buttons

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

Dieses Protokoll stellt das erste Forschungsmodell vor, das eine organotypische langfristige Kultivierung von hornförmigen Endothelzellen ermöglicht, die mit der Herstellung von gespaltenen Hornhautknöpfen erreicht werden. Durch teilweises Entfernen der äußeren Hornhautschichten wird der Verlust der Endothelzellverlorenen signifikant reduziert, so dass horneale Endothelzellen für mindestens 15 Tage kultiviert werden können. Daher ist dieses Modell wertvoll für die Untersuchung der Auswirkungen bestimmter Substanzen oder Techniken von Interesse wie Bewässerungslösungen oder ophthalmologische viskoelastische Geräte auf das Hornhautendothel.Nach Erhalt von Schweineaugen, die kurz nach dem Tod entfernt wurden, verwenden Sie Augenschere und Colibri Zangen, um alle Orbitaladnexe zu entfernen. Legen Sie fünf bis sechs Augen in fünf Prozent Jod-PBS-Lösung für insgesamt fünf Minuten, um die Augenoberflächen richtig zu desinfizieren, mit sorgfältigem Rühren einmal pro Minute, um sicherzustellen, dass die Oberflächen vollständig untergetaucht sind, um eine vollständige Desinfektion zu erreichen. Nach fünf Minuten die desinfizierten Augen auf eine Tasse reines PBS übertragen und vorsichtig rühren, um die Jod-PBS-Lösung gründlich von den Augenoberflächen zu waschen.Bevor Sie mit der Zerlegung beginnen, füllen Sie mit einem stumpfen Katheter eine Fünf-Milliliter-Spritze mit zwei Millilitern frisch aufgetautem fetalem Kalbsserum und sanzen Sie das Serum durch einen 0,22-Mikrometer-Filter in 80 Milliliter dextranfreies Kulturmedium. Rühren Sie die Mischung sanft, um eine homogene Verteilung des Serums zu erreichen, und fügen Sie drei Milliliter des Mediums zu jedem Brunnen einer 12-Well-Zellkulturplatte hinzu. Wenn die Platte fertig ist, übertragen Sie eine Glühbirne in einen Augenzwiebelhalter unter einem ophthalmologischen chirurgischen Mikroskop mit der Hornhaut nach oben, und verwenden Sie eine Spritze gefüllt mit 0,9% Natriumchlorid, um das Auge über den Augenlampenhalter leicht zu saugen, um das Auge an Ort und Stelle zu fixieren.Verwenden Sie ein Trephin mit einer standardisierten Inlay, um oberflächlich in die zentrale Hornhaut zu schneiden, nicht tiefer als 300 Mikrometer, und verwenden Sie Colibri Zangen und ein Einweg-Skalpell mit einer dreieckigen Klinge, um das teilweise trephinierte Fragment der Hornhaut horizontal durch die Stroma zu schneiden und zu entfernen. Oberflächlich eine 10-0-Naht in die Stroma legen, um eine Differenzierung des Endothels von der stromalen Seite während der Experimente zu ermöglichen, ohne das Hornhautendothel zu durchdringen, und verwenden Sie ein Trephin ohne Inlay, um den Trephinschnitt bis zur vollen Tiefe zu erreichen, bis die vordere Augenkammer erreicht ist. Ein deutlicher Rückgang des Widerstands und flüssigkeitsaustritt aus der vorderen Augenkammer kann nach vollständiger Penetration der Hornhaut wahrgenommen werden.Legen Sie den erhaltenen gespaltenen Hornhautknopf mit einem Teil des Stromas, der Descemet-Membran und des Hornhautendothels in einen Brunnen der 12-Well-Platte mit der getaggten Seite nach unten. Dann beschriften Sie jeden Brunnen auf der Kulturplatte mit einer individuellen Nummer für jeden geteilten Hornhautknopf zur Identifikation während der Nachuntersuchungen. Wenn alle Hornhautknöpfe gesammelt wurden, legen Sie die 12-Well-Platte in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius, fünf Prozent Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit und ersetzen Sie den Überstand am achten Tag, wenn eine siebentägige Inkubationszeit überschritten wird.Um eine unbefleckte Untersuchung durchzuführen, fügen Sie drei Milliliter hypotonisch ausgewogene Salzlösung zu jedem Brunnen einer 12-Well-Platte hinzu, und legen Sie sorgfältig einen einzigen gespaltenen Hornhautknopf in jeden Brunnen, um Schwellungen der hornförmigen Endothelzellen zu induzieren und die Sichtbarkeit der Zellen zum Zählen zu verbessern. Nach ein bis zwei Minuten können Sie mit einer Mikroskopkamera mindestens drei Bilder von drei verschiedenen Bereichen des Endothels erfassen, um einen repräsentativen Eindruck vom tatsächlichen Zustand des Hornhautendothel zu erhalten, und fügen Sie für eine spätere Analyse einen Maßstabsbalken mit der maßstabsgetreuen Länge von 100 Mikrometern hinzu. Um osmotische Schäden zu vermeiden, übertragen Sie den gespaltenen Hornhautknopf nach maximal fünf Minuten zurück in das Kulturmedium.Um eine gefärbte Untersuchung durchzuführen, legen Sie die gespaltenen Hornhautknöpfe in einzelne Petrischalen, endotheliale Seite nach oben, und verwenden Sie eine Pipette, um langsam 0,25%Trypam blaue Lösung auf jedes Hornhautendothel für 90 Sekunden pro Probe fallen. Als nächstes spülen Sie die Knöpfe dreimal in 0,9% Natriumchlorid in einem kleinen Glasbecher, bevor Sie eine Pipette verwenden, um langsam 0,2% Alizarin Red S Lösung auf die Endothelie für 90 Sekunden fallen. Dann stellen Sie die Proben, wie gerade gezeigt.Um die Bilder für die Bewertung der Zelldichte und Morphologie vorzubereiten, öffnen Sie die Bilder in einem geeigneten Grafikbearbeitungssoftwareprogramm und projizieren Sie ein Quadrat mit einer maßstabsgetreuen Seitenlänge von 100 Mikrometern auf das Bild. Um die Maßstabsleiste zuzuschneiden, verwenden Sie das rechteckige Festzeltwerkzeug, um die Maßstabsleiste einzugrenzen, und wählen Sie Bearbeiten und Zuschneiden aus. Klicken Sie auf Datei und Neu, und wählen Sie zwischendiebe aus.Notieren Sie sich die entsprechenden Pixel für die anderen Bilder, und klicken Sie auf OK. Klicken Sie erneut auf Datei und Neu, und fügen Sie die Breite und Länge des Zählquadrats in Pixel in Pixel nderpixeln entsprechend der Länge der Maßstabsleiste ein. Wählen Sie Weiß als Hintergrundfarbe aus, und klicken Sie auf OK, um alle auszuwählen, und kopieren Sie das ausgewählte Bild. Wählen Sie das Bild des Hornhautendotheles und fügen Sie das Quadrat auf das Hornhautendothel ein.Wählen Sie die quadratische Ebene aus, und legen Sie die Deckkraft auf 30% fest, dann klicken Sie auf OK und speichern Sie das Bild mit dem projizierten Quadrat mit der maßstabsgetreuen Folienlänge von 100 Mikrometern. Um die Endothelzelldichte zu bewerten, öffnen Sie die Bilder mit den projizierten Quadraten in ImageJ, und öffnen Sie das Zellenzähler-Plugin. Um die Zellen innerhalb des Quadrats zu zählen, klicken Sie auf Initialisieren, um die Endothelzellen auf zwei Seiten des Quadrats zu zählen, und zeichnen Sie das Ergebnis auf.Um die morphologischen Parameter zu bewerten, zählen Sie das gemeinsame Treffen von mindestens vier Zellen pro Zellrand, das charakteristische Rosette-förmige Aussehen und die Alizarin-Rot-Bereiche innerhalb der projizierten Quadrate. Über einen Zeitraum von 15 Tagen zeigen gespaltene Hornhautknöpfe einen stetigen Rückgang der Endothelzelldichte, wobei ein durchschnittlicher wöchentlicher prozentualer prozentualer Endothelzellverlust von 4,90%die Färbung der Endothelzellschicht am 15. Tag eine morphologische Analyse der Hornhautzellen ermöglicht, wobei die Reformationszahlen etwa sieben Prozent der verschmelzenden Zellgrenzen ausmachen, ein Median von etwa einer Rosettebildung pro Millimeter quadratisch pro Millimeter und etwa 13 punktuelle Zellverluste pro Millimeter im Quadrat. Hierkönnen können repräsentative Bilder des Hornhautendotheles bei der mikroskopischen Auswertung in hypotonischer ausgewogener Salzlösung und nach der Färbung mit Trypan blue und Alizarin Red S beobachtet werden.Wenn die gespaltenen Hornhautknöpfe mit der endotheliale Seite nach unten kultiviert werden, ist mit umfangreichen Endothelzellschäden zu rechnen. Nicht gespaltene Hornhautknöpfe erleiden einen signifikant erhöhten Endothelzellverlust aufgrund von stromaler Schwellung, wodurch Sichcemets Membran über 15 Tage der Kultivierung faltet, während gespaltene Hornhautknöpfe nach 15 Tagen Kultivierung ein weitgehend erhaltenes Hornhautendothel aufweisen, wie die verstreuten punktuellen Alizarin-Rotfärbungsgebiete belegen, die auf einzelne zerstörte Zellen hinweisen. Um den Zellverlust zu minimieren, sollte darauf geachtet werden, das Hornhautendothel in allen Schritten dieses Protokolls nicht zu berühren.

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

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The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

Forschung

Medizin

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Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Eine Alkali-brennen Verletzungsmodell der Hornhaut Neovaskularisation bei der Maus

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Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Murine Hornhauttransplantation: Ein Modell, das die häufigste Form der Organtransplantation Studieren

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

Hornhautspendergewebe Vorbereitung für Descemetschen Membrane Endothelial Keratoplastik

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, ...

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The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Epitheliale Korneaabnutzung mit okulärer Burr als Modell für die Hornhaut Wundheilung

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Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

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