Name: a porcine corneal endothelial organ culture model using split corneal buttons
Uploaded: 2019-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons at JoVE.com

הקמת מודל המחקר המוצג נתמך על ידי KMU-חדשנות (FKZ: 13GW0037F) של המשרד הפדרלי לחינוך ומחקר גרמניה.

פרוטוקול זה מלווה את ההנחיות האתיות של המוסד שלנו. בהתאם לחוקים של ועדת הביקורת האתית של המוסד שלנו לא היה צריך לקבל אישור מוסרי לפני הניסויים, כמו כל הקרניות שהתקבלו מהמטבחיים המקומי.
1. התרבות העוגב
<ol><li>. הכן את עיני החזיר<ol>
<li>מתוך המטבחיים המקומי, להשיג עיניים חזיר שהוסר?...

<ol>
	<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking.">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li><li>Roy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro.">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).</li><li>Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+density+in+porcine+corneas+after+exposure+to+hypotonic+solutions.">Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).</li><li>Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+temporary+hypothermia+on+corneal+endothelial+cell+density+during+organ+culture+preservation.">Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).</li><li>Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+temporary+hyperthermia+on+corneal+endothelial+cell+survival+during+organ+culture+preservation.">Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).</li><li>Kunzmann, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+Of+A+Porcine+Corneal+Endothelial+Organ+Culture+Model+For+Research+Purposes.">Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes.</a> Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).</li><li>Redbrake, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histochemical+study+of+the+distribution+of+dextran+500+in+human+corneas+during+organ+culture.">A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture.</a> Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamines+for+Deswelling+of+Organ-Cultured+Corneas.">Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas.</a> Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).</li><li>Filev, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-quantitative+assessments+of+dextran+toxicity+on+corneal+endothelium:+conceptual+design+of+a+predictive+algorithm.">Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).</li><li>Pels, E., Schuchard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-culture+preservation+of+human+corneas.">Organ-culture preservation of human corneas.</a> Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).</li><li>Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology,+Histology+and+Ultrastructure+of+Human+C31+Organ-Cultured+Corneas.">Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas.</a> Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).</li><li>Linke, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+cornea+cultivation:+long-term+experience+in+a+single+eye+bank.">Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank.</a> Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).</li><li>Schroeter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbeitsrichtlinien+-+Gute+Fachliche+Praxis+f&#252;r+Hornhautbanken+[Procedural+guidelines.+Good+tissue+practice+for+cornea+banks].">Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis f&#252;r Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks].</a> Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).</li><li>Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+swelling+pressure+of+the+corneal+stroma.">The swelling pressure of the corneal stroma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 1, 158-162 (1962).</li><li>Xuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+corneal+stroma:+importance+in+visual+function.">Proteins of the corneal stroma: importance in visual function.</a> Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).</li><li>Sperling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Corneal+Endothelium+in+Organ+Culture+-+The+Influence+of+Temperature+and+Medium+of+Incubation.">Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation.</a> Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).</li><li>Schroeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Evaluation+in+the+Cornea+Bank.">Endothelial Evaluation in the Cornea Bank.</a> Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).</li><li>Pels, E., Schuchard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+High+Molecular+Weight+dextran+on+the+Presevation+of+Human+Corneas.">The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas.</a> Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).</li><li>van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopy+of+Cultured+Human+Corneas+Osmotic+Hydration+and+the+Use+of+dextran+Fraction+(dextran+T+500)+in+Organ+Culture.">Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture.</a> Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).</li><li>Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+compound-free+medium+and+poloxamer+for+human+corneal+organ+culture+and+Deswelling.">Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).</li><li>Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+endothelial+cells+does+not+change+the+result+of+cell+density.">Staining of endothelial cells does not change the result of cell density.</a> Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).</li><li>Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+perfluorobutylpentane+(F4H5)+on+corneal+endothelial+cells.">Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells.</a> Current Eye Research. , (2019).</li><li>Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sand&#248;e, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+principle+-+mind+the+ethical+gap!.">The 3Rs principle - mind the ethical gap!.</a> ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).</li><li>Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parameters+of+the+porcine+eyeball.">The parameters of the porcine eyeball.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).</li><li>Kim, M. K., Hara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+corneal+xenotransplantation.">Current status of corneal xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Proliferative+Capacity+of+Genetically-Engineered+Pig+and+Human.">Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human.</a> Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).</li></ol>

פרוטוקול זה מספק שיטה להכנת כפתורי הקרנית מפוצל חזירי, אשר מייצגת מודל סטנדרטית ובעלות נמוכה לשעבר הקרנית vivo הקרתל למטרות מחקר6. Porcine לחצני הקרנית לפצל הראה ירידה של צפיפות התא האנדותל הדומה הפסדים התאים האנדותל שנצפו בקרנית התורם האנושי שטיפח בבנקים העין במשך שבועיים<sup class="x...

השתלת הקרנית הליכים הם בין השתלות הנפוצות ביותר ברחבי העולם1. מאחר שקיים מחסור חמור בקרניות של תורמים אנושיים, מחקר ניסיוני מטפל בתאי הקרתל של הקרניות בקרנית אנושית קשה לביצוע1. עם זאת, המבוא של פתרונות השקיה וחומרים אחרים המשמשים בתוך העין, מכשירים למדידת התקשות אופטלמולוגית, כמו גם מכשירים כירורגיים וטכניקות (למשל, מכשירים וטכניקות phacoאמולסיה, אנרגיית אולטרסאונד) דורש חקירה חוקית ונרחבת בנוגע להשפעות שלהם על האנדותל הקרנית לפני שימוש קליני.
מעטים האלטרנטיבות לקרניות. התורמות של האדם למחקר מודלים מחקר בעלי חיים הם בעלי ערך רב, אבל באותו זמן מאוד משאבים רב והוא נחקר יותר ויותר מבחינה אתית. החיסרון העיקרי של תרביות תאים מבחנה הוא התרגום המוגבל שלהם לעין האנושית. התוצאות שהתקבלו מתרבויות התא יכול להיות לא מתאים בתנאים vivo, כי תאים עשויים לעבור מעבר אנדותל mesenchymal (האמבולנס), וכתוצאה מכך פיברוהפיצוץ כמו מורפולוגיה הנגרמת על ידי אובדן של קוטביות התאים ושינויים בצורת תא גן ביטוי2.
ואילו הדגמים הקודמים vivo ex דיווחו על תקופות הטיפוח של עד רק 120 h, טכניקת הכנה הרומן כדי להקים מודל הקרנית של הקרניות האנדותל של הגוף על ידי הקרנית החזיר טרי לפחות לאחר 15 ימים הוצג לאחרונה3 ,4,5,6. אם אפיתל הקרנית וחלקים של משתית מוסרים (כ 300 יקרומטר בסך הכל) מן הקרנית לפני הטיפוח, נפיחות של משתית מופחת לחצני הקרנית מפוצל וכתוצאה מכך אובדן התאים האנדותל ומתוחזק היטב שכבת התא לאחר עד 15 ימים, ואילו לחצני הקרנית לא מפוצל להראות הפסד משמעותי בתאי האנדותל בשל נפיחות סטרומה מחוספס היווצרות של קפלי האמת של. בנקים עין בדרך כלל להשתמש אוסמוטי deswelling סוכנים כגון תוספי כדי להפחית נפיחות של קרניות לפני ההשתלה. עם זאת, סוכנים אלה הוכחו לגרום לאובדן של התאיםהאנדותלמוגברת 7,8,9.
מאמר זה שואפת להמחיש מודל זה vivo ex סטנדרטית לשעבר בפרוטוקול צעד אחר צעד מפורט כדי לאפשר חוקרים עתידיים לבצע מחקר על אנדותל הקרנית באמצעות כפתורי הקרנית מפוצל. מודל זה מייצג שיטה ישירה לבדיקת חומרים וטכניקות המשמשים בתוך העין, כגון מכשירים אלסטיים, פתרונות השקיה, ואנרגיית אולטרסאונד, או הליכים אחרים שבהם מדובר באנדותל הקרנית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Subject</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pig eyes</td>
			<td>local abbatoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substances</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium 1, #F9016</td>
			<td>Biochrom GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Biochrom GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypotonic balanced salt solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td>per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidon iodine 7.5%, Braunol</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl) 0.9%</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH) solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials &#38; Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu-jet pro</td>
			<td>Brand GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker Glass 50 mL</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt cannula incl. Filter (5 &#181;m) 18G</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate (12 well)</td>
			<td>Corning Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette</td>
			<td>Eppendorf AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Bulb Holder</td>
			<td>L. Klein, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded Filter &#248; 185 mm</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hockey knife</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MillexGV Filter (5 &#181;m)</td>
			<td>Merck Millopore Ltd., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needler holder</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR International, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel (single use), triangular blade</td>
			<td>Aesculap AG &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cups</td>
			<td>Greiner Bio-One, &#214;sterreich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td>Paul Hartmann AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical drape</td>
			<td>Paul Hartmann AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stitch scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6</td>
			<td>Ethicon Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (5 mL)</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trephine &#248; 7.5 mm</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tying forceps</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment &#38; Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular surgical microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera mounted on microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Entry (software)</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold-light source</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Olympus GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer with heating function</td>
			<td>IKA-Werke GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter pHenomenal</td>
			<td>VWR International, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS2</td>
			<td>Adobe Systems, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Ohaus Europe GmbH, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a porcine corneal endothelial organ culture model using split corneal buttons

המחקרים הניסיוניים על תאי הקרנית. משויכים למספר קשיים קרניות של תורמים אנושיים נדירות ולעיתים רחוקות זמינות לחקירות נסיוניות כאשר הן נחוצות בדרך כלל להשתלה. תרביות תאים אנדותל לעתים קרובות לא לתרגם היטב במצבים vivo. בשל המאפיינים הביוקונסטרוקטיבי של הקרניות הבלתי-אנושיות, מסטרומה נפיחות במהלך הטיפוח-תרגול גורם לאובדן משמעותי של תאי הקרנית, מה שמקשה על הטיפוח-תרגול למשך זמן ממושך. סוכני deswelling כגון תוספי משמשים כדי לנטרל תגובה זו. עם זאת, הם גם גורמים לאיבוד משמעותי בתאי האנדותל. לכן, מודל תרבות vivo לשעבר האיברים אינו דורש הוקמה סוכנים. עיני חזיר מבית המטבחיים המקומי שימשו להכנת כפתורי הקרנית מפוצל. לאחר הסרת הקרנית חלקית, השכבות החיצוניות של הקרנית (אפיתל, שכבת באומן, חלקים של משתית) הוסרו. זה מפחית באופן משמעותי את האובדן של תא אנדותל הקרנית הנגרמת על ידי נפיחות מסיבית של הממברנה וקיפול הקרום של האמת לאורך תקופות הטיפוח הארוך יותר ומשפר את השימור הכללי של שכבת התא האנדותל. מעקב אחר הקרנית מלאה לאחר מכן ההסרה של כפתור הקרנית מפוצל מנורת העין הנותרים וטיפוח. צפיפות התא של האנדותל הוערך בשעות המעקב של עד 15 יום לאחר ההכנה (כלומר, ימים 1, 8, 15) במיקרוסקופ אור. טכניקת ההכנה המשמשת מאפשרת שימור טוב יותר של שכבת התא האנדותל, המופעלת על-ידי נפיחות ברקמות פחות מסטרומה, דבר הגורם לירידה איטית וליניארית בקצב הקרניות המפוצל בהשוואה לקרניות של תורמים אנושיים. כמו זה מודל אורגאנו-בדרך כלל מעובד מחקר בפעם הראשונה מאפשר טיפוח יציב לפחות שבועיים, זה חלופה רבת ערך לקרנית התורם האנושי לחקירות עתידיות של גורמים חיצוניים שונים לגבי השפעות. על האנדותל הקרנית

טכניקת החיתוך המוצג מרמז על הסרה חלקית של רקמת סטרומה, וכתוצאה מכך דגימת קרנית דק יותר ובכך מסטרומה פחות נפיחות (איור 1 ואיור 2). הנפיחות פחות מסטרומה גורמת פחות להטות ולצבוט כוחות שיש להם השפעה שלילית על אנדותל הקרנית, ובכך גורם נמוך יותר ה?...

Watch this Scientific Journal Video about A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons at JoVE.com

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

כאן, פרוטוקול צעד אחר צעד להכנה וטיפוח של כפתורי הקרנית מפוצל חזירי מוצג. כמו זה אורגאנו-מעובד בדרך כלל מודל תרבות האיברים מראה שיעורי מוות של תאים בתוך 15 ימים, המקבילה לקרנית התורם האנושי, הוא מייצג את המודל הראשון המאפשר טיפוח לטווח ארוך של קרניות לא אנושיות מבלי להוסיף דקטרן רעיל.

מודל של הקרנית של הקרניות הפותל באמצעות לחצני הקרנית מפוצלת

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

פרוטוקול זה מציג את מודל המחקר הראשון המאפשר טיפוח ארוך טווח אורגנוטיפי של תאי אנדותל הקרנית שהושגו עם הכנת כפתורי קרנית מפוצלים. על ידי הסרה חלקית של שכבות הקרנית החיצוניות, אובדן תאי ה אנדותל מצטמצם באופן משמעותי, ומאפשר טיפוח של תאי אנדותל הקרנית לפחות 15 ימים. לכן, מודל זה הוא בעל ערך עבור חקירת ההשפעות של חומרים ספציפיים או טכניקות של עניין כגון פתרונות השקיה או מכשירים viscoelastic עיניים על אנדותל הקרנית.לאחר קבלת עיני חזיר שהוסרו זמן קצר לאחר המוות, השתמש במספריים לעיניים ומדפים קוליברי כדי להסיר את כל adnexes מסלולית. מניחים חמש עד שש עיניים לתוך חמישה אחוזים יוד PBS פתרון במשך סך של חמש דקות כדי לחטא כראוי את משטחי העין, עם ערבוב זהיר פעם בדקה כדי להבטיח כי המשטחים שקועים לחלוטין כדי להשיג חיטוי מלא. לאחר חמש דקות, להעביר את העיניים חיטוי לתוך PBS טהור, בזהירות מערבבים אותו לשטוף ביסודיות את פתרון יוד PBS מפני העיניים.לפני תחילת הניתוח, השתמש בקטטר קהה כדי למלא מזרק חמישה מיליליטר עם שני מיליליטר של סרום עגל עוברי מופשר טרי, וסנן את הסרום באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר לתוך 80 מיליליטר של מדיום תרבות נטול דקסטרן. בעדינות להתסיס את התערובת כדי להשיג הפצה הומוגנית של הסרום, ולהוסיף שלושה מיליליטר של המדיום לכל באר של צלחת תרבות תאים 12 היטב. כאשר הצלחת מוכנה, להעביר נורת עיניים לתוך מחזיק נורת עיניים תחת מיקרוסקופ כירורגי עיניים עם הקרנית פונה כלפי מעלה, ולהשתמש מזרק מלא 0.9% נתרן כלורי להחיל יניקה קלה על העין על מחזיק הנורה כדי לתקן את העין במקום.השתמש trephine המכיל שיבוץ מתוקנן לחתוך באופן שטחי לתוך הקרנית המרכזית, לא עמוק יותר מ 300 מיקרומטר, ולהשתמש מדחסי קוליברי אזמל חד-שימוש עם להב משולש לחתוך ולהסיר את שבר trephined חלקית של הקרנית אופקית דרך סטרומה. באופן שטחי מניחים תפר 10-0 לתוך הסטרומה כדי לאפשר התבלות של ה אנדותל מהצד הסטרומאלי במהלך הניסויים, מבלי לחדור את אנדותל הקרנית, ולהשתמש בטרפין ללא שיבוץ כדי לקדם את חתך הטרפין לעומק מלא עד להגיע לתא העין קדמי. ירידה ברורה בהתנגדות ודליפת נוזלים מתא העין לפני הלידה יכולה להיתפס לאחר חדירה מוחלטת של הקרנית.מניחים את כפתור הקרנית המפוצל המתקבל המכיל חלק מהסטרומה, קרום הדשמט, ואת אנדותל הקרנית לתוך באר אחת של צלחת 12 באר עם הצד המתויג פונה כלפי מטה. ואז לתייג כל באר על צלחת התרבות עם מספר בודד עבור כל כפתור הקרנית מפוצל לזיהוי במהלך מעקב. כאשר נאספו כל כפתורי הקרנית, מניחים את צלחת 12 הבאר באינקובטור של תרבות התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוז פחמן דו חמצני ו-95% לחות, ומחליפים את העל-טבעי ביום השמיני אם חריגה מתמשך שבעה ימים של אינקובציה.כדי לבצע בדיקה לא מזוהמת, להוסיף שלושה מיליליטר של תווי מלח מאוזנים היפוטוניים לכל באר של צלחת 12 באר, בזהירות למקם כפתור קרנית מפוצל אחד לתוך כל באר כדי לגרום לנפיחות של תאי אנדותל הקרנית, ולשפר את הראות של התאים לספירה. לאחר שעה עד שתי דקות, השתמש במצלמת מיקרוסקופ כדי לרכוש לפחות שלוש תמונות של שלושה אזורים שונים של ה אנדותל כדי לקבל רושם מייצג של המצב בפועל של אנדותל הקרנית, ולהוסיף סרגל קנה מידה עם אורך אמיתי בקנה מידה של 100 מיקרומטר לניתוח מאוחר יותר. כדי למנוע נזק אוסמוטי, להעביר את כפתור הקרנית מפוצל מהפתרון לאחר מקסימום של חמש דקות בחזרה לתוך מדיום התרבות.כדי לבצע בדיקה מוכתמת, מניחים את כפתורי הקרנית המפוצלים במנות פטרי בודדות, בצד ה אנדותל למעלה, ולהשתמש פיפטה לאט לרדת 0.25% פתרון כחול טריפם על כל אנדותל הקרנית במשך 90 שניות לכל דגימה. לאחר מכן, לשטוף בזהירות את הכפתורים שלוש פעמים ב 0.9% נתרן כלורי ב זכוכית קטנה לפני השימוש פיפטה לאט לרדת 0.2% Alizarin אדום S פתרון על אנדותליה במשך 90 שניות. לאחר מכן תדמיין את הדגימות כפי שהודגם זה בלבד.כדי להכין את התמונות להערכת צפיפות תאים ומורפולוגיה, פתח את התמונות בתוכנה מתאימה לעריכת גרפיקה והקרן ריבוע עם אורך צד של 100 מיקרומטרים על התמונה. לחיתוך סרגל קנה המידה, השתמשו בכלי כתובית מלבנית כדי להגבל את סרגל קנה המידה ולבחור עריכה וחיתוך. לחץ על קובץ וחדש ובחר לוח.שים לב לפיקסלים המתאימים עבור התמונות האחרות ולחץ על אישור. לחץ שוב על קובץ וחדש, והוסף את הרוחב והאורך של ריבוע הספירה בפיקסלים בחלון הנפתח בהתאם לאורך סרגל קנה המידה. בחרו 'לבן' כצבע רקע ולחצו על הלחצן 'אשר' לבחירת הכל, והעתיקו את התמונה שנבחרה. בחר את התמונה של אנדותל הקרנית ולהדביק את הריבוע על אנדותל הקרנית.בחרו בשכבה הריבועית והגדירו את האטימות ל-30%, לחצו על הלחצן 'אשר' וחסכו את התמונה עם הריבוע המוקרן עם אורך שקופית של 100 מיקרומטר. כדי להעריך את צפיפות התא ה אנדותל, פתח את התמונות עם הריבועים המוקרנים ב- ImageJ, ופתח את תוסף מונה התאים. כדי לספור את התאים בתוך הריבוע, לחץ על אתחול כדי לספור את תאי ה אנדותל משני צידי הריבוע ולתרשם את התוצאה.כדי להעריך את הפרמטרים המורפולוגיים, ספור את המפגש המשותף של לפחות ארבעה תאים לכל גבול תא, את המראה האופייני בצורת רוזטה ואת האזורים האדומים של Alizarin בתוך הריבועים המוקרנים. במשך תקופה של 15 ימים, כפתורי קרנית מפוצלים מדגימים ירידה מתמדת בצפיפות תאי ה אנדותל, עם אובדן תאי אנדותל באחוזים שבועיים ממוצעים של 4.90% כתמים של שכבת התא ה אנדותל ביום 15 מאפשר ניתוח מורפולוגי של תאי הקרנית, עם נתוני רפורמציה המהווים כשבעה אחוזים מגבולות התא המתמזג, חציון של היווצרות רוזט אחת בערך למילימטר מרובע וכ-13 הפסדי תאים דייקניים למילימטר בריבוע. כאן, תמונות מייצגות של אנדותל הקרנית במהלך הערכה מיקרוסקופית בתווית מלח היפוטונית מאוזנת, ולאחר כתמים עם כחול טריפאן ואליזרין אדום S, ניתן לראות.אם כפתורי הקרנית המפוצלים מעובדים כאשר הצד ה אנדותל פונה כלפי מטה, צפוי נזק נרחב לתאי ה אנדותל. כפתורי הקרנית שאינם מפוצלים סובלים מאובדן תאי אנדותל מוגבר באופן משמעותי עקב נפיחות סטרומה, מה שגורם לקיפול הקרום של Descemet במשך 15 ימים של טיפוח, ואילו כפתורי קרנית מפוצלים מציגים אנדותל קרנית שהשתמר במידה רבה לאחר 15 ימים של טיפוח, כפי שמעידים אזורים מפוזרים של אליעזר אדום מוכתם, המעידים על תאים בודדים שנהרסו. כדי למזער את אובדן התא, יש לדאוג לא לגעת אנדותל הקרנית לאורך כל השלבים של פרוטוקול זה.

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

מיקרוסקופיה confocal קרנית: שיטה חדשנית לא פולשני לכמת סיב פתולוגיה קטנים neuropathies היקפיים

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

קרנית התורם רקמות הכנה Keratoplasty האנדותל

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

פגיעה דגם אלקלי לשרוף של הקרנית neovascularization בעכבר

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

השתלת קרנית עכברית: דגם לחקר הצורה נפוצה ביותר של Solid השתלות איברים

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

הכנת רקמות התורמות קרנית לממברנה האנדותל Keratoplasty של Descemet

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, ...

Technique of Porcine Liver Procurement and Orthotopic Transplantation using an Active Porto-Caval Shunt

טכניקה של רכש כבד בשר חזירים והשתלות Orthotopic באמצעות פורטו-caval אנט פעיל

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

אפיתל שחיקה הקרנית עם עינית Burr כמודל עבור קרנית ריפוי פצעים

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

פיתוח של מודל פולשני, בסיוע לייזר של הקרנית הפסד של תא אנדותל

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Orthotopic Kidney Auto-Transplantation in a Porcine Model Using 24 Hours Organ Preservation And Continuous Telemetry

השתלת כליה אורתוטופית במודל פורצין באמצעות 24 שעות שימור איברים וטלמטריה רציפה

In the present era of organ transplantation with critical organ shortage, various strategies are employed to expand the pool of available allografts for ...