Name: a porcine corneal endothelial organ culture model using split corneal buttons
Uploaded: 2019-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons at JoVE.com

L'istituzione del modello di ricerca presentato è stata sostenuta da KMU-innovativ (13GW0037F) del Ministero federale dell'istruzione e della ricerca Germania.

Questo protocollo segue gli orientamenti etici della nostra istituzione. Conformemente agli statuti del comitato di revisione etica del nostro istituto non è stato necessario ottenere alcuna approvazione etica prima degli esperimenti, poiché tutte le cornee di suine sono state ottenute dal macello locale.
1. Cultura dell'organo
<ol><li>Preparare gli occhi di maiale.<ol>
<li>Dal macello locale, ottenere gli occhi di maiale che sono stati rimossi poco dopo la morte ma prima del trattamento t...

<ol>
	<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking.">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li><li>Roy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro.">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).</li><li>Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+density+in+porcine+corneas+after+exposure+to+hypotonic+solutions.">Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).</li><li>Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+temporary+hypothermia+on+corneal+endothelial+cell+density+during+organ+culture+preservation.">Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).</li><li>Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+temporary+hyperthermia+on+corneal+endothelial+cell+survival+during+organ+culture+preservation.">Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).</li><li>Kunzmann, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+Of+A+Porcine+Corneal+Endothelial+Organ+Culture+Model+For+Research+Purposes.">Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes.</a> Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).</li><li>Redbrake, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histochemical+study+of+the+distribution+of+dextran+500+in+human+corneas+during+organ+culture.">A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture.</a> Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamines+for+Deswelling+of+Organ-Cultured+Corneas.">Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas.</a> Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).</li><li>Filev, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-quantitative+assessments+of+dextran+toxicity+on+corneal+endothelium:+conceptual+design+of+a+predictive+algorithm.">Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).</li><li>Pels, E., Schuchard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-culture+preservation+of+human+corneas.">Organ-culture preservation of human corneas.</a> Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).</li><li>Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology,+Histology+and+Ultrastructure+of+Human+C31+Organ-Cultured+Corneas.">Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas.</a> Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).</li><li>Linke, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+cornea+cultivation:+long-term+experience+in+a+single+eye+bank.">Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank.</a> Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).</li><li>Schroeter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbeitsrichtlinien+-+Gute+Fachliche+Praxis+f&#252;r+Hornhautbanken+[Procedural+guidelines.+Good+tissue+practice+for+cornea+banks].">Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis f&#252;r Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks].</a> Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).</li><li>Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+swelling+pressure+of+the+corneal+stroma.">The swelling pressure of the corneal stroma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 1, 158-162 (1962).</li><li>Xuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+corneal+stroma:+importance+in+visual+function.">Proteins of the corneal stroma: importance in visual function.</a> Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).</li><li>Sperling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Corneal+Endothelium+in+Organ+Culture+-+The+Influence+of+Temperature+and+Medium+of+Incubation.">Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation.</a> Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).</li><li>Schroeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Evaluation+in+the+Cornea+Bank.">Endothelial Evaluation in the Cornea Bank.</a> Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).</li><li>Pels, E., Schuchard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+High+Molecular+Weight+dextran+on+the+Presevation+of+Human+Corneas.">The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas.</a> Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).</li><li>van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopy+of+Cultured+Human+Corneas+Osmotic+Hydration+and+the+Use+of+dextran+Fraction+(dextran+T+500)+in+Organ+Culture.">Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture.</a> Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).</li><li>Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+compound-free+medium+and+poloxamer+for+human+corneal+organ+culture+and+Deswelling.">Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).</li><li>Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+endothelial+cells+does+not+change+the+result+of+cell+density.">Staining of endothelial cells does not change the result of cell density.</a> Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).</li><li>Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+perfluorobutylpentane+(F4H5)+on+corneal+endothelial+cells.">Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells.</a> Current Eye Research. , (2019).</li><li>Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sand&#248;e, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+principle+-+mind+the+ethical+gap!.">The 3Rs principle - mind the ethical gap!.</a> ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).</li><li>Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parameters+of+the+porcine+eyeball.">The parameters of the porcine eyeball.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).</li><li>Kim, M. K., Hara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+corneal+xenotransplantation.">Current status of corneal xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Proliferative+Capacity+of+Genetically-Engineered+Pig+and+Human.">Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human.</a> Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).</li></ol>

Questo protocollo fornisce un metodo per la preparazione di pulsanti corneali divisi su vitello, che rappresenta un modello standardizzato e a basso costo di coltura endoteliale endoteliale per scopi di ricerca6. I bottoni corneali porcini divisi hanno mostrato una diminuzione della densità delle cellule endoteliali paragonabile alle perdite di cellule endoteliali osservate nelle cornee dei donatori umani coltivate nelle banche oculari per un periodo di due settimane6...

Le procedure di trapianto di cornea sono tra le trapianti più comunemente eseguite in tutto il mondo1. Poiché vi è una grave carenza di cornee dei donatori umani, la ricerca sperimentale che si occupa delle cellule endoteliali corneali nelle cornee umane è difficile da eseguire1. Tuttavia, l'introduzione di soluzioni di irrigazione e altre sostanze utilizzate all'interno dell'occhio, dispositivi viscolicici oftalmici, così come strumenti e tecniche chirurgiche (ad esempio, strumenti e tecniche di facoemulsificazione, energia ecografica) richiede valide ed estese indagini riguardanti i loro effetti sull'endotelio corneo prima dell'uso clinico.
Esistono poche alternative alle cornee dei donatori umani per la ricerca. I modelli di ricerca sugli animali sono molto preziosi, ma allo stesso tempo molto dispendiosi in termini di risorse e sempre più in discussione eticamente. Uno dei principali inconvenienti delle colture di cellule in vitro è la loro limitata traduzione all'occhio umano. I risultati ottenuti dalle colture cellulari possono essere incongrui in condizioni in vivo, perché le cellule possono subire una transizione mesenchymica endoteliale (EMT), con conseguente morfologia fibroblasta-come causata dalla perdita di polarità cellulare e cambiamenti nella forma cellulare e gene l'espressione2.
Mentre i precedenti modelli ex vivo riportavano periodi di coltivazione fino a 120 h, è stata recentementeintrodotta una nuova tecnica di preparazione per stabilire un modello di coltura endoteliale endoteliale del porcellino, coltiva cornee di maiale fresco per almeno 15 giorni ,4,5,6. Se l'epitelio corneale e parti dello stroma vengono rimossi (circa 300 m in totale) dalla cornea prima della coltivazione, il gonfiore dello stroma viene ridotto in pulsanti corneali divisi con conseguente perdita di cellule meno endoteliali e un endoteliale ben mantenuto strato mastrose dopo fino a 15 giorni, mentre i pulsanti corneali non divisi mostrano una significativa perdita di cellule endoteliali a causa di gonfiore stromale irregolare irregolare e formazione delle pieghe di Descemet. I banchi oculari di solito usano agenti di deswelling osmotici come dextran per ridurre il gonfiore delle cornee prima del trapianto. Tuttavia, questi agenti hanno dimostrato di indurre una maggiore perdita di cellule endoteliali7,8,9.
Questo articolo ha lo scopo di visualizzare questo modello di ricerca ex vivo standardizzato in un protocollo dettagliato passo-passo al fine di consentire ai futuri ricercatori di eseguire ricerche sull'endotelio cornealeutilizzando utilizzando pulsanti corneali divisi. Questo modello rappresenta un metodo semplice per testare le sostanze e le tecniche utilizzate all'interno dell'occhio, come i dispositivi viscolicici oftalmici, le soluzioni di irrigazione e l'energia ad ultrasuoni o altre procedure in cui l'endotelio corneale è di interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Subject</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pig eyes</td>
			<td>local abbatoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substances</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium 1, #F9016</td>
			<td>Biochrom GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Biochrom GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypotonic balanced salt solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td>per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidon iodine 7.5%, Braunol</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl) 0.9%</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH) solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials &#38; Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu-jet pro</td>
			<td>Brand GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker Glass 50 mL</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt cannula incl. Filter (5 &#181;m) 18G</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate (12 well)</td>
			<td>Corning Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette</td>
			<td>Eppendorf AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Bulb Holder</td>
			<td>L. Klein, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded Filter &#248; 185 mm</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hockey knife</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MillexGV Filter (5 &#181;m)</td>
			<td>Merck Millopore Ltd., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needler holder</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR International, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel (single use), triangular blade</td>
			<td>Aesculap AG &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cups</td>
			<td>Greiner Bio-One, &#214;sterreich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td>Paul Hartmann AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical drape</td>
			<td>Paul Hartmann AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stitch scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6</td>
			<td>Ethicon Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (5 mL)</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trephine &#248; 7.5 mm</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tying forceps</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment &#38; Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular surgical microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera mounted on microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Entry (software)</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold-light source</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Olympus GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer with heating function</td>
			<td>IKA-Werke GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter pHenomenal</td>
			<td>VWR International, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS2</td>
			<td>Adobe Systems, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Ohaus Europe GmbH, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a porcine corneal endothelial organ culture model using split corneal buttons

La ricerca sperimentale sulle cellule endoteliali corneali è associata a diverse difficoltà. Le cornee dei donatori umani sono scarse e raramente disponibili per le indagini sperimentali, in quanto sono normalmente necessarie per il trapianto. Le colture di cellule endoteliali spesso non si traducono bene in situazioni in vivo. A causa delle caratteristiche biostrutturali delle cornee non umane, il gonfiore stromale durante la coltivazione induce una sostanziale perdita di cellule endoteliali corneali, che rende difficile eseguire la coltivazione per un lungo periodo di tempo. Gli agenti di deswelling come dextran vengono utilizzati per contrastare questa risposta. Tuttavia, causano anche una significativa perdita di cellule endoteliali. Pertanto, è stato istituito un modello di coltura di organi ex vivo che non richiede agenti di deswelling. Occhi di maiale da un macello locale sono stati utilizzati per preparare i pulsanti corneali divisi. Dopo una parziale trefinazione corneale, gli strati esterni della cornea (epitelio, strato di arco, parti dello stroma) sono stati rimossi. Questo riduce significativamente la perdita di cellule endoteliali indotte da un massiccio gonfiore stromale e dal ripiegamento della membrana di Descemet durante i periodi di coltivazione più lunghi e migliora la conservazione generale dello strato di cellule endoteliali. La successiva trefinazione corneale completa fu seguita dalla rimozione del pulsante corneale diviso dal bulbo oculare rimanente e dalla coltivazione. La densità delle cellule endoteliali è stata valutata nei periodi di follow-up fino a 15 giorni dopo la preparazione (cioè i giorni 1, 8, 15) utilizzando la microscopia leggera. La tecnica di preparazione utilizzata consente una migliore conservazione dello strato di cellule endoteliali, resa possibile da un rallentamento del tessuto stromale, che si traduce in tassi di declino lenti e lineari nei bottoni corneali divisi paragonabili alle cornee dei donatori umani. Poiché questo modello di ricerca standardizzato coltivato organo-tipicamente consente per la prima volta una coltivazione stabile per almeno due settimane, è una valida alternativa alle cornee dei donatori umani per future indagini su vari fattori esterni effetti sull'endotelio corneale.

La tecnica di dissezione presentata implica la rimozione parziale del tessuto stromale, con conseguente un campione di cornea più sottile e quindi un gonfiore meno stromale (Figura 1 e Figura 2). Il gonfiore meno stromale induce meno forze di taglio e pizzico che hanno un impatto negativo sull'endotelio corneale, causando così una minore perdita di cellule endoteliali6. I pulsanti corneali divisi mostran...

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A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

Qui, viene presentato un protocollo passo-passo per la preparazione e la coltivazione di bottoni corneali divisi su porcini. Poiché questo modello di coltura organo-tipicamente coltivata mostra i tassi di mortalità cellulare entro 15 giorni, paragonabili alle cornee dei donatori umani, rappresenta il primo modello che consente la coltivazione a lungo termine di cornee non umane senza aggiungere dextran tossico.

Un modello di cultura dell'organo endoteliale porcina utilizzando i pulsanti corneali divisi

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

Questo protocollo presenta il primo modello di ricerca che consente la coltivazione organotipica a lungo termine di cellule endoteliali corneali ottenuta con la preparazione di bottoni corneali divisi. Rimuovendo parzialmente gli strati corneali esterni, la perdita di cellule endoteliali è significativamente ridotta, consentendo la coltivazione di cellule endoteliali corneali per almeno 15 giorni. Pertanto, questo modello è prezioso per studiare gli effetti di sostanze specifiche o tecniche di interesse come soluzioni di irrigazione o dispositivi viscoelastici oftalmici sull'endotelio corneale.Dopo aver ricevuto gli occhi di maiale che sono stati rimossi poco dopo la mortem, utilizzare forbici per gli occhi e forcep Colibri per rimuovere tutti gli adnex orbitali. Posizionare da cinque a sei occhi in una soluzione PBS di iodio al cinque per cento per un totale di cinque minuti per disinfettare correttamente le superfici oculari, con un'attenta agitazione una volta al minuto per garantire che le superfici siano completamente sommerse per ottenere una disinfezione completa. Dopo cinque minuti, trasferire gli occhi disinfettati su una tazza di PBS puro e mescolarlo accuratamente per lavare accuratamente la soluzione pbs di iodio dalle superfici oculari.Prima di iniziare la dissezione, utilizzare un catetere smussato per riempire una siringa da cinque millilitri con due millilitri di siero di vitello fetale appena scongelato e filtrare il siero attraverso un filtro da 0,22 micrometri in 80 millilitri di mezzo di coltura privo di dextran. Agitare delicatamente la miscela per ottenere una distribuzione omogenea del siero e aggiungere tre millilitri del mezzo ad ogni pozzo di una piastra di coltura cellulare da 12 pozzi. Quando la piastra è pronta, trasferire un bulbo oculare in un porta bulbo oculare al microscopio chirurgico oftalmico con la cornea rivolta verso l'alto e utilizzare una siringa riempita con cloruro di sodio allo 0,9% per applicare una leggera aspirazione all'occhio sul supporto del bulbo oculare per fissare l'occhio in posizione.Utilizzare una trefina contenente un intarsio standardizzato per tagliare superficialmente nella cornea centrale, non più profonda di 300 micrometri, e utilizzare le forcep Colibri e un bisturi mono impiego con una lama triangolare per tagliare e rimuovere il frammento parzialmente trephined della cornea orizzontalmente attraverso lo stroma. Posizionare superficialmente una sutura 10-0 nello stroma per consentire la differenziazione dell'endoteliale dal lato stromale durante gli esperimenti, senza penetrare l'endotelio corneale, e utilizzare una trefina senza intarsio per far avanzare la trefina tagliata a tutta profondità fino a raggiungere la camera oculare anteriore. Una netta caduta di resistenza e perdita di fluido dalla camera oculare anteriore può essere percepita dopo la completa penetrazione della cornea.Posizionare il pulsante corneale diviso ottenuto contenente parte dello stroma, la membrana del Descemet e l'endotelio corneale in un unico pozzo della piastra da 12 pozzetti con il lato taggato rivolto verso il basso. Quindi etichettare ogni bene sulla piastra di coltura con un numero individuale per ogni pulsante corneale diviso per l'identificazione durante i follow-up. Una volta raccolti tutti i pulsanti corneali, posizionare la piastra da 12 po' in un incubatore di coltura cellulare a 37 gradi celsius, anidride carbonica al 5% e umidità del 95%, sostituendo il supernatante il giorno otto se viene superato un periodo di incubazione di sette giorni.Per eseguire un esame non macchiato, aggiungere tre millilitri di soluzione salina bilanciata ipotonica ad ogni pozzo di una piastra da 12 po ', e posizionare con cura un singolo pulsante corneale diviso in ogni pozzo per indurre gonfiore delle cellule endoteliali corneali e migliorare la visibilità delle cellule per il conteggio. Dopo uno o due minuti, utilizzare una fotocamera al microscopio per acquisire almeno tre immagini di tre diverse aree dell'endotelio per ottenere un'impressione rappresentativa delle condizioni effettive dell'endotelio corneale e aggiungere una barra di scala con la lunghezza reale su scala di 100 micrometri per un'analisi successiva. Per evitare danni osmotici, trasferire il pulsante corneale diviso dalla soluzione dopo un massimo di cinque minuti di nuovo nel mezzo di coltura.Per eseguire un esame macchiato, posizionare i bottoni corneali divisi nelle singole piastre di Petri, lato endoteliale verso l'alto, e utilizzare una pipetta per far cadere lentamente la soluzione blu di Trypam dello 0,25% su ogni endotelio corneale per 90 secondi per campione. Successivamente, sciacquare accuratamente i pulsanti tre volte in cloruro di sodio allo 0,9% in un piccolo bicchiere di vetro prima di utilizzare una pipetta per far cadere lentamente la soluzione di Alizarin Red S sull'endotelia per 90 secondi. Quindi immagini i campioni come appena dimostrato.Per preparare le immagini per la densità cellulare e la valutazione morfologica, aprire le immagini in un appropriato programma software di editing grafico e proiettare un quadrato con una lunghezza laterale reale su larga scala di 100 micrometri sull'immagine. Per ritagliare la barra di ridimensionamento, usate lo strumento selezione rettangolare per confinare con la barra di scala e selezionare Modifica e ritaglia. Fare clic su file e nuovo e selezionare Appunti.Prendere nota dei pixel corrispondenti per le altre immagini e fare clic su OK. Fare di nuovo clic su file e nuovo e inserire la larghezza e la lunghezza del quadrato di conteggio in pixel nella finestra popup in base alla lunghezza della barra di scala. Selezionare il bianco come colore di sfondo e fare clic su OK per selezionare tutto e copiare l'immagine selezionata. Selezionare l'immagine dell'endotelio corneale e incollare il quadrato sull'endotelio corneale.Selezionare il livello quadrato e impostare l'opacità su 30%Quindi fare clic su OK e salvare l'immagine con il quadrato proiettato con la lunghezza della diapositiva true-to-scale di 100 micrometri. Per valutare la densità delle celle endoteliali, aprite le immagini con i quadrati proiettati in ImageJ e aprite il plug-in del contatore delle celle. Per contare le celle all'interno del quadrato, fare clic su inizializza per contare le celle endoteliali su due lati del quadrato e registrare il risultato.Per valutare i parametri morfologici, contare la riunione congiunta di almeno quattro celle per bordo cellulare, il caratteristico aspetto a forma di rosetta e le aree rosso alizarina all'interno dei quadrati proiettati. In un periodo di 15 giorni, i pulsanti corneali divisi dimostrano un costante declino della densità cellulare endoteliale, con una percentuale media settimanale di perdita di cellule endoteliali del 4,90% La colorazione dello strato cellulare endoteliale il giorno 15 consente l'analisi morfologica delle cellule corneali, con cifre di riforma che co rappresentano circa il sette% dei bordi cellulari che si fondono, una mediana di circa una formazione di rosetta per millimetro quadrato per campione , e circa 13 perdite puntuali di cellule per millimetro al quadrato. Qui, si possono osservare immagini rappresentative dell'endotelio corneale durante la valutazione microscopica in soluzione di sale bilanciato ipotonico e dopo la colorazione con Tripano blu e Alizarina Rossa S.Se i bottoni corneali divisi vengono coltivati con il lato endoteliale rivolto verso il basso, è previsto un ampio danno cellulare endoteliale. I bottoni corneali non divisi subiscono un aumento significativo della perdita cellulare endoteliale a causa del gonfiore stromale, causando la piegatura della membrana di Descemet per 15 giorni di coltivazione, mentre i bottoni corneali divisi mostrano un endotelio corneale ampiamente conservato dopo 15 giorni di coltivazione, come evidenziato da aree puntuali sparse macchiate di Alizarin Rosso, indicative di singole cellule distrutte. Per ridurre al minimo la perdita cellulare, è necessario fare attenzione a non toccare l'endotelio corneale in tutte le fasi di questo protocollo.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Medicina

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