Name: a porcine corneal endothelial organ culture model using split corneal buttons
Uploaded: 2019-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons at JoVE.com

제시 된 연구 모델의 설립은 교육 및 연구 독일의 연방 정부의 KMU-innovativ (FKZ : 13GW0037F)에 의해 지원되었다.

이 프로토콜은 우리 기관의 윤리적 지침을 따릅니다. 우리 기관의 윤리 검토 위원회의 법령에 따라 모든 돼지 각막이 지역 도축장에서 얻어졌기 때문에 실험 전에 윤리적 승인을 받아야했습니다.
1. 장기 문화
<ol><li>돼지 눈을 준비합니다.<ol>
<li>지역 도축장에서, 곧 사후 하지만 열 처리 하기 전에 제거 된 돼지 눈을 얻을. 실험실로 눈을 운반하고 몇 시간 이내에 처리합니다....

<ol>
	<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking.">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li><li>Roy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro.">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).</li><li>Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+density+in+porcine+corneas+after+exposure+to+hypotonic+solutions.">Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).</li><li>Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+temporary+hypothermia+on+corneal+endothelial+cell+density+during+organ+culture+preservation.">Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).</li><li>Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+temporary+hyperthermia+on+corneal+endothelial+cell+survival+during+organ+culture+preservation.">Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).</li><li>Kunzmann, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+Of+A+Porcine+Corneal+Endothelial+Organ+Culture+Model+For+Research+Purposes.">Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes.</a> Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).</li><li>Redbrake, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histochemical+study+of+the+distribution+of+dextran+500+in+human+corneas+during+organ+culture.">A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture.</a> Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamines+for+Deswelling+of+Organ-Cultured+Corneas.">Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas.</a> Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).</li><li>Filev, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-quantitative+assessments+of+dextran+toxicity+on+corneal+endothelium:+conceptual+design+of+a+predictive+algorithm.">Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).</li><li>Pels, E., Schuchard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-culture+preservation+of+human+corneas.">Organ-culture preservation of human corneas.</a> Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).</li><li>Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology,+Histology+and+Ultrastructure+of+Human+C31+Organ-Cultured+Corneas.">Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas.</a> Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).</li><li>Linke, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+cornea+cultivation:+long-term+experience+in+a+single+eye+bank.">Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank.</a> Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).</li><li>Schroeter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbeitsrichtlinien+-+Gute+Fachliche+Praxis+f&#252;r+Hornhautbanken+[Procedural+guidelines.+Good+tissue+practice+for+cornea+banks].">Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis f&#252;r Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks].</a> Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).</li><li>Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+swelling+pressure+of+the+corneal+stroma.">The swelling pressure of the corneal stroma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 1, 158-162 (1962).</li><li>Xuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+corneal+stroma:+importance+in+visual+function.">Proteins of the corneal stroma: importance in visual function.</a> Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).</li><li>Sperling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Corneal+Endothelium+in+Organ+Culture+-+The+Influence+of+Temperature+and+Medium+of+Incubation.">Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation.</a> Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).</li><li>Schroeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Evaluation+in+the+Cornea+Bank.">Endothelial Evaluation in the Cornea Bank.</a> Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).</li><li>Pels, E., Schuchard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+High+Molecular+Weight+dextran+on+the+Presevation+of+Human+Corneas.">The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas.</a> Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).</li><li>van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopy+of+Cultured+Human+Corneas+Osmotic+Hydration+and+the+Use+of+dextran+Fraction+(dextran+T+500)+in+Organ+Culture.">Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture.</a> Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).</li><li>Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+compound-free+medium+and+poloxamer+for+human+corneal+organ+culture+and+Deswelling.">Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).</li><li>Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+endothelial+cells+does+not+change+the+result+of+cell+density.">Staining of endothelial cells does not change the result of cell density.</a> Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).</li><li>Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+perfluorobutylpentane+(F4H5)+on+corneal+endothelial+cells.">Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells.</a> Current Eye Research. , (2019).</li><li>Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sand&#248;e, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+principle+-+mind+the+ethical+gap!.">The 3Rs principle - mind the ethical gap!.</a> ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).</li><li>Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parameters+of+the+porcine+eyeball.">The parameters of the porcine eyeball.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).</li><li>Kim, M. K., Hara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+corneal+xenotransplantation.">Current status of corneal xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Proliferative+Capacity+of+Genetically-Engineered+Pig+and+Human.">Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human.</a> Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).</li></ol>

이 프로토콜은 연구 목적을 위해 표준화되고 저렴한 비용의 생체 내막 내피 내피 내피 모델을 나타내는 돼지 분할 각막 버튼을 제조하는 방법을 제공한다6. 돼지 분할 각막 버튼은 2 주 기간동안눈 은행에서 재배 된 인간 기증자 각막에서 관찰 된 내피 세포 손실에 필적하는 내피 세포 밀도의 감소를 보였다6,10,11,<...

각막 이식 절차는 전 세계적으로 가장 일반적으로 수행 이식 중 하나입니다1. 인간 기증자 각막의 심각한 부족이 있기 때문에, 인간 각막에서 각막 내피 세포를 다루는 실험 연구는 수행하기 어렵다1. 그러나, 눈, 안과 점탄성 장치, 수술 기구 및 기술 (예를 들어, phacoemulsification 기기 및 기술, 초음파 에너지)에서 사용되는 관개 용액 및 기타 물질의 도입은 필요합니다. 임상 사용 전에 각막 내피에 미치는 영향에 관한 유효하고 광범위한 조사.
인간 기증자 각막에 대한 몇 가지 대안은 연구를 위해 존재합니다. 동물 연구 모델은 매우 귀중하지만 동시에 매우 자원 소비와 점점 윤리적으로 의문을 제기. 시험관 내 세포 배양의 주요 단점은 인간의 눈에 그들의 제한 된 번역. 세포 배양에서 얻은 결과는 세포가 내피 중간엽 전이 (EMT)를 겪을 수 있기 때문에 세포 극성의 손실과 세포 모양 및 유전자의 변화로 인한 섬유아세포 와 같은 형태학을 겪을 수 있기 때문에 생체 내 조건에 부합할 수 있습니다. 표현식2.
이전 생체 내 외 모델은 최대 120 h의 재배 기간을보고한 반면, 돼지 각막 내피 내피 장기 배양 모델을 확립하기 위한 새로운 준비 기법은 신선한 돼지 각막을 적어도 15 일 동안 배양하여 최근에 도입되었다3 ,4,5,6. 각막 상피와 기질의 일부가 재배 하기 전에 각막에서 제거 하는 경우 (약 300 전체에서 약 300 μm) 각막의 붓기는 덜 내 피 세포 손실 및 잘 유지 내 피 세포 손실의 결과로 분할 각막 버튼에서 감소 비 분할 각막 단추는 Descemet의 주름의 고르지 않은 기질 팽윤 그리고 대형 때문에 중요한 내피 세포 손실을 보여주기 때문에 15 일까지 후에 세포 층. 눈 은행은 일반적으로 이식 하기 전에 각 막의 붓기를 줄이기 위해 dextran 같은 삼 투 성 팽창 에이전트를 사용. 그러나, 이들 제제는 증가된 내피 세포 손실을 유도하는 것으로 나타났다7,8,9.
이 문서는 분할 각막 단추를 사용하여 각막 내피에 대한 연구를 수행 할 미래의 조사자가 할 수 있도록하기 위해 상세한 단계별 프로토콜에서이 표준화 된 생체 내 비보 연구 모델을 시각화하는 것을 목표로합니다. 이 모형은 안과 점탄성 장치, 관개 해결책 및 초음파 에너지, 또는 각막 내피가 관심있는 그밖 절차와 같은 눈 내의 이용된 물질 그리고 기술을 시험하는 간단한 방법을 나타냅니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Subject</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pig eyes</td>
			<td>local abbatoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substances</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium 1, #F9016</td>
			<td>Biochrom GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Biochrom GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypotonic balanced salt solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td>per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidon iodine 7.5%, Braunol</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl) 0.9%</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH) solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials &#38; Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu-jet pro</td>
			<td>Brand GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker Glass 50 mL</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt cannula incl. Filter (5 &#181;m) 18G</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate (12 well)</td>
			<td>Corning Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette</td>
			<td>Eppendorf AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Bulb Holder</td>
			<td>L. Klein, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded Filter &#248; 185 mm</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hockey knife</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MillexGV Filter (5 &#181;m)</td>
			<td>Merck Millopore Ltd., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needler holder</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR International, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel (single use), triangular blade</td>
			<td>Aesculap AG &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cups</td>
			<td>Greiner Bio-One, &#214;sterreich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td>Paul Hartmann AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical drape</td>
			<td>Paul Hartmann AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stitch scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6</td>
			<td>Ethicon Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (5 mL)</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trephine &#248; 7.5 mm</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tying forceps</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment &#38; Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular surgical microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera mounted on microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Entry (software)</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold-light source</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Olympus GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer with heating function</td>
			<td>IKA-Werke GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter pHenomenal</td>
			<td>VWR International, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS2</td>
			<td>Adobe Systems, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Ohaus Europe GmbH, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a porcine corneal endothelial organ culture model using split corneal buttons

각막 내피 세포에 대한 실험 연구는 여러 가지 어려움과 관련이 있습니다. 인간 기증자 각막은 부족하고 일반적으로 이식을 위해 필요로 하기 때문에 실험적인 조사를 위해 드물게 유효합니다. 내피 세포 배양은 종종 생체 내 상황에 잘 번역되지 않습니다. 비 인간 각막의 생체 구조 특성으로 인해 재배 중 기질 부종은 상당한 각막 내피 세포 손실을 유발하여 장기간 재배를 수행하기가 어렵습니다. dextran과 같은 팽창 에이전트는 이 응답을 중화하는 데 사용됩니다. 그러나, 그(것)들은 또한 중요한 내피 세포 손실을 일으키는 원인이 됩니다. 따라서, 분해에이전트를 필요로 하지 않는 생체본 장기 배양 모델이 확립되었다. 지역 도축장에서 돼지 눈은 분할 각막 버튼을 준비하는 데 사용되었다. 부분 각막 trephination 후, 각막의 외부 층 (상피, 보만 층, 기질의 부분)을 제거하였다. 이것은 크게 대규모 기질 붓기에 의해 유도 된 각막 내피 세포 손실을 감소시키고 더 긴 재배 기간 동안 Descemet의 막 접는 내피 세포 층의 일반적인 보존을 향상. 후속 완전한 각막 담음은 나머지 눈 전구 및 재배에서 분할 각막 버튼의 제거에 의해 뒤따랐다. 내피 세포 밀도는 경현미경을 사용하여 제제 후 최대 15일(즉, 1일, 8일, 15일)의 후속 시간에 평가하였다. 사용된 준비 기술은 인간 기증자 각막에 필적하는 분할 각막 단추에 있는 느리고 선형 쇠퇴 비율 귀착되는 더 적은 기질 조직 팽윤에 의해 가능하게 된 내피 세포 층의 더 나은 보존을 허용합니다. 이 표준화된 유기학-전형적으로 재배된 연구 모델은 적어도 2주 동안 안정적인 재배를 가능하게 하기 때문에, 인간 기증자 각막에 대한 귀중한 대안으로, 향후 다양한 외부 요인에 대한 조사를 위한 귀중한 대안이 될 수 있습니다. 각막 내피에 미치는 영향.

제시된 해부 기술은 기질 조직의 부분적인 제거를 의미하며, 이로 인해 각막 샘플이 얇아지고 기질 이붓기가줄어듭니다(그림 1 및 그림 2). 적은 기질 팽윤은 각막 내피에 부정적인 충격이 있는 더 적은 전단 및 핀치 힘을 유도합니다, 따라서 더 낮은 내피 세포 손실 비율을 일으키는 원인이되는 6. 분할 각막 단...

Watch this Scientific Journal Video about A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons at JoVE.com

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

여기서, 돼지 분할 각막 버튼의 제조 및 재배를 위한 단계별 프로토콜이 제시된다. 이 오르가노-전형적으로 재배된 장기 배양 모델은 인간 기증자 각막에 필적하는 15일 이내에 세포 사망률을 나타내므로, 독성 덱젠을 첨가하지 않고 비인간 각막의 장기 재배를 허용하는 첫 번째 모델을 나타낸다.

분할 각막 단추를 사용하여 돼지 각막 내피 내피 기관 문화 모형

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

이 프로토콜은 분할 각막 버튼의 준비로 달성 각막 내피 세포의 장기 전형 장기 재배를 허용하는 첫 번째 연구 모델을 제시한다. 외부 각막 층을 부분적으로 제거함으로써 내피 세포 손실이 현저히 감소되어 적어도 15일 동안 각막 내피 세포의 재배를 허용합니다. 따라서, 이 모델은 각막 내시경에 관개 솔루션 또는 안과 점탄성 장치와 같은 관심있는 특정 물질 또는 기술의 효과를 조사하는 데 유용합니다.모템 직후 제거된 돼지 눈을 받은 후, 눈 가위와 대장균 집게를 사용하여 모든 궤도 사전을 제거합니다. 5~6개의 눈을 5% 요오드 PBS 용액에 넣고 총 5분 동안 눈 표면을 제대로 소독하고, 1분에 한 번주의 깊게 저어서 표면이 완전히 침수되어 완전한 소독을 달성합니다. 5분 후, 소독된 눈을 순수한 PBS 한 잔으로 옮기고, 조심스럽게 저어요오드 PBS 용액을 눈 표면에서 철저히 씻어냅니다.해부를 시작하기 전에 무딘 카테터를 사용하여 5 밀리리터 주사기를 5 밀리리터의 갓 해동한 태아 종아리 혈청 2밀리리터를 채우고 0.22 마이크로미터 필터를 통해 30밀리리터의 도민을 데센이 없는 배양 배지의 80밀리리터로 변형시니다. 혼합물을 부드럽게 교반하여 혈청의 균질 분포를 달성하고, 12웰 세포 배양판의 각 웰에 3밀리리터를 첨가한다. 플레이트가 준비되면 각막이 위향인 안과 수술 현미경으로 안구 홀더로 눈 전구를 옮기고, 0.9%의 염화나트륨으로 채워진 주사기를 사용하여 눈위에 약간의 흡입을 적용하여 눈을 고정시합니다.표준화된 인레이가 들어 있는 트레핀을 사용하여 중앙 각막으로 피상적으로 절단하고 300 마이크로미터 이하의 더 깊은 것을 방지하고, 삼각 블레이드가 있는 대장균 집게와 일회용 메스를 사용하여 각막의 부분적으로 트레핀화된 조각을 스트로마를 가로로 잘라내고 제거합니다. 표면적으로 10-0 봉합사를 스트로마에 배치하여 실험 중에 기질 측으로부터 내피의 분화를 허용하고, 각막 내피를 관통하지 않고, 전방 눈챔버에 도달할 때까지 트레핀 컷을 전체 깊이로 전진시키기 위해 인레이없이 트레핀을 사용합니다. 전방 눈 챔버에서 누출되는 저항과 유체의 뚜렷한 낙하는 각막의 완전한 침투 후에 인식될 수 있습니다.스트로마의 일부를 포함하는 획득한 분할 각막 버튼, 데스멧의 멤브레인, 각막 내막을 태그된 면이 아래로 향하여 12웰 플레이트의 한 우물에 놓습니다. 그런 다음 후속 조치 중 식별을 위해 모든 분할 각막 버튼에 대한 개별 번호로 문화 판에 각 우물에 레이블을 지정합니다. 각막 버튼이 모두 수집되면, 세포 배양 인큐베이터에 12웰 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 95%로 배치하여 7일 배양 기간을 초과하는 경우 8일째에 상퍼를 교체한다.스테인드 검사를 수행하기 위해, 12 웰 플레이트의 각 웰에 저혈압 균형 소금 용액의 3 밀리리터를 추가하고 각 웰에 단일 분할 각막 버튼을 신중하게 배치하여 각막 내피 세포의 붓기를 유도하고 계산을위한 세포의 가시성을 향상시킵니다. 1 내지 2분 후, 현미경 카메라를 사용하여 내피의 3개 영역의 적어도 3개의 이미지를 획득하여 각막 내피의 실제 상태를 대표하는 인상을 얻고, 나중에 분석을 위해 100 마이크로미터의 실제 길이로 스케일 바를 추가한다. 삼투압 손상을 방지하기 위해 분할 각막 버튼을 최대 5분 후에 용액에서 배양 매체로 다시 전송합니다.스테인드 검사를 수행하기 위해, 개별 페트리 접시에 분할 각막 버튼을 배치, 내피 측 위로, 천천히 0.25 %의 Trypam 블루 용액을 각 각막 내피에 드롭 표본 당 90 초. 다음으로, 피펫을 사용하기 전에 작은 유리 비커에 0.9%의 염화 나트륨으로 버튼을 세 번 조심스럽게 헹구고 0.2%의 알리자린 레드 S 용액을 내도벨리아에 90초 간 천천히 떨어뜨립니다. 그런 다음 방금 설명한 대로 샘플을 이미지화합니다.세포 밀도 및 형태 학적 평가를 위한 이미지를 준비하려면 적절한 그래픽 편집 소프트웨어 프로그램에서 이미지를 열고 이미지에 100 마이크로미터의 실제 측면 길이로 사각형을 투영합니다. 축척 막대를 자르려면 직사각형 선택 윤곽 도구를 사용하여 축척 막대와 경계를 맞정하고 편집 및 자르기를 선택합니다. 파일과 새 파일을 클릭하고 클립보드를 선택합니다.다른 사진에 대한 해당 픽셀을 기록하고 확인을 클릭합니다. 파일과 새 파일을 다시 클릭하고 스케일 표시줄의 길이에 따라 팝업 창의 픽셀에 카운팅 사각형의 너비와 길이를 삽입합니다. 흰색을 배경색으로 선택하고 확인을 클릭하여 모두 선택하고 선택한 이미지를 복사합니다. 각막 내막 의 이미지를 선택하고 각막 내막에 사각형을 붙여 넣습니다.정사각형 레이어를 선택하고 불투명도를 30%로 설정한 다음 확인을 클릭하고 100 마이크로미터의 실제 슬라이드 길이로 투영된 사각형으로 이미지를 저장합니다. 내피 세포 밀도를 평가하려면 ImageJ에서 투영 된 사각형으로 이미지를 열고 셀 카운터 플러그인을 엽니 다. 사각형 내의 셀을 계산하려면 초기화를 클릭하여 사각형의 양면에 내피 세포를 계산하고 결과를 기록합니다.형태학적 매개 변수를 평가하기 위해 셀 테두리당 적어도 4개의 세포의 관절 회의, 특징적인 로제트 모양, 및 투영된 사각형 내에서 Alizarin Red 영역을 계산합니다. 15일 동안 분할 각막 버튼은 내피 세포 밀도가 꾸준히 감소하는 것으로 나타났으며, 15일째에 내피 세포 층의 평균 주간 백분율 내피 세포 손실4.90%의 염색으로 각막 세포의 형태학적 분석을 허용하며, 약 7%의 암조 세포 면적을 차지하는 개혁 수치가 약 1제곱미터의 중간 체형을 구성할 수 있습니다. , 밀리미터 당 약 13 정시 세포 손실제곱. 여기서, 저혈압 균형 소금 용액에서 현미경 평가 시 각막 내피의 대표적인 이미지를 관찰하고, 트라이판 블루 및 알리자린 레드 S로 염색한 후, 관찰될 수 있다.분할 각막 버튼이 내피 측을 향하고 있는 것으로 재배되면 광범위한 내피 세포 손상이 예상됩니다. 비분할 각막 버튼은 기질 부종으로 인한 내피 세포 손실이 크게 증가하여 15일 동안 데세멧의 막이 접히는 반면, 분할 각막 버튼은 15일 간의 재배 후 크게 보존된 각막 내신생물을 나타내며, 이는 반소 천막 알리자린 레드-스테인드 부위에 의해 입증된 바와 같이 파괴되었다. 세포 손실을 최소화하기 위해 이 프로토콜의 모든 단계에서 각막 내신도를 만지지 않도록 주의를 기울여야 합니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

각막 공촛점 현미경 : 주변 Neuropathies에 작은 광섬유 병리를 정할 소설 비침습 기술

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

연구

의학

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

내피 Keratoplasty을위한 각막 기증자 조직 준비

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

마우스의 각막 신생 혈관의 알칼리 화상 상해 모델

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

쥐의 각막 이식 : 고체 장기 이식의 가장 일반적인 형태를 연구하기위한 모델

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

데스 메막 내피 각막 이식을위한 각막 기증자의 조직 준비

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, ...

Technique of Porcine Liver Procurement and Orthotopic Transplantation using an Active Porto-Caval Shunt

활성 포르토 대정맥 션트를 사용하여 돼지 간 조달 및 동소 이식 이식의 기술

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

각 막에 대 한 모델로 눈 버와 각 막 상피 마모 상처 치유

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo 막 기관 문화 모델에 대 한 상처 치유 연구

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

각막 내피 세포 손실의 비 침습적, 레이저 보조 실험 모델의 개발

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Orthotopic Kidney Auto-Transplantation in a Porcine Model Using 24 Hours Organ Preservation And Continuous Telemetry

24시간 장기 보존 및 지속적인 원격 분석을 사용하여 돼지 모델에서 직소 신장 자동 이식

In the present era of organ transplantation with critical organ shortage, various strategies are employed to expand the pool of available allografts for ...