Name: a porcine corneal endothelial organ culture model using split corneal buttons
Uploaded: 2019-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons at JoVE.com

Создание представленной исследовательской модели было поддержано КМУ-инноваторив (ФКЗ: 13GW0037F) федерального министерства образования и научных исследований Германии.

Этот протокол соответствует этическим принципам нашего учреждения. В соответствии с уставом комитета по этике нашего учреждения до начала экспериментов не должно было быть получено никакого этического утверждения, так как все свиные роговицы были получены с местной скотобойни.
<p cla...

<ol>
	<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking.">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li><li>Roy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro.">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).</li><li>Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+density+in+porcine+corneas+after+exposure+to+hypotonic+solutions.">Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).</li><li>Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+temporary+hypothermia+on+corneal+endothelial+cell+density+during+organ+culture+preservation.">Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).</li><li>Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+temporary+hyperthermia+on+corneal+endothelial+cell+survival+during+organ+culture+preservation.">Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).</li><li>Kunzmann, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+Of+A+Porcine+Corneal+Endothelial+Organ+Culture+Model+For+Research+Purposes.">Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes.</a> Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).</li><li>Redbrake, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histochemical+study+of+the+distribution+of+dextran+500+in+human+corneas+during+organ+culture.">A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture.</a> Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamines+for+Deswelling+of+Organ-Cultured+Corneas.">Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas.</a> Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).</li><li>Filev, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-quantitative+assessments+of+dextran+toxicity+on+corneal+endothelium:+conceptual+design+of+a+predictive+algorithm.">Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).</li><li>Pels, E., Schuchard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-culture+preservation+of+human+corneas.">Organ-culture preservation of human corneas.</a> Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).</li><li>Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology,+Histology+and+Ultrastructure+of+Human+C31+Organ-Cultured+Corneas.">Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas.</a> Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).</li><li>Linke, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+cornea+cultivation:+long-term+experience+in+a+single+eye+bank.">Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank.</a> Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).</li><li>Schroeter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbeitsrichtlinien+-+Gute+Fachliche+Praxis+f&#252;r+Hornhautbanken+[Procedural+guidelines.+Good+tissue+practice+for+cornea+banks].">Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis f&#252;r Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks].</a> Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).</li><li>Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+swelling+pressure+of+the+corneal+stroma.">The swelling pressure of the corneal stroma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 1, 158-162 (1962).</li><li>Xuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+corneal+stroma:+importance+in+visual+function.">Proteins of the corneal stroma: importance in visual function.</a> Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).</li><li>Sperling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Corneal+Endothelium+in+Organ+Culture+-+The+Influence+of+Temperature+and+Medium+of+Incubation.">Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation.</a> Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).</li><li>Schroeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Evaluation+in+the+Cornea+Bank.">Endothelial Evaluation in the Cornea Bank.</a> Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).</li><li>Pels, E., Schuchard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+High+Molecular+Weight+dextran+on+the+Presevation+of+Human+Corneas.">The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas.</a> Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).</li><li>van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopy+of+Cultured+Human+Corneas+Osmotic+Hydration+and+the+Use+of+dextran+Fraction+(dextran+T+500)+in+Organ+Culture.">Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture.</a> Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).</li><li>Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+compound-free+medium+and+poloxamer+for+human+corneal+organ+culture+and+Deswelling.">Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).</li><li>Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+endothelial+cells+does+not+change+the+result+of+cell+density.">Staining of endothelial cells does not change the result of cell density.</a> Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).</li><li>Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+perfluorobutylpentane+(F4H5)+on+corneal+endothelial+cells.">Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells.</a> Current Eye Research. , (2019).</li><li>Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sand&#248;e, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+principle+-+mind+the+ethical+gap!.">The 3Rs principle - mind the ethical gap!.</a> ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).</li><li>Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parameters+of+the+porcine+eyeball.">The parameters of the porcine eyeball.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).</li><li>Kim, M. K., Hara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+corneal+xenotransplantation.">Current status of corneal xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Proliferative+Capacity+of+Genetically-Engineered+Pig+and+Human.">Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human.</a> Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).</li></ol>

Этот протокол предоставляет метод для подготовки свиной сплит роговицы кнопки, которая представляет собой стандартизированные и недорогие ex vivo роговицы эндотелиальной модели культуры органов для исследовательскихцелей 6. Свиной раскол роговицы кнопки показали снижение...

Процедуры трансплантации корневой трансплантации являются одними из наиболее часто выполняемых трансплантаций во всем мире1. Как существует острая нехватка человеческих доноров роговицы, экспериментальные исследования решения роговицы эндотелиальных клеток в роговицы человека трудно выполнить1. Однако внедрение оросительных растворов и других веществ, используемых в глазу, офтальмологических вязкоупругих устройств, а также хирургических инструментов и методов (например, инструменты и методы факоэмульсификации, ультразвуковая энергия) требует действительные и обширные исследования относительно их воздействия на эндотелий роговицы перед клиническим использованием.
Немногие альтернативы донорской роговицы человека существуют для исследований. Модели исследований на животных очень ценны, но в то же время очень ресурсоемкие и все более под сомнение этически. Основным недостатком культур клеток in vitro является их ограниченный перевод человеческому глазу. Результаты, полученные из клеточных культур может быть несовместимы с условиями in vivo, потому что клетки могут претерпеть эндотелиальный мезенхимальный переход (EMT), в результате чего фибробластоподобная морфология вызвана потерей клеточной полярности и изменениями в форме клеток и гене выражение2.
В то время как предыдущие модели ex vivo сообщили периоды выращивания до всего 120 ч, новый метод подготовки к созданию свиной роговицы эндотелиальной модели культуры органов путем культивирования свежей свиной роговицы, по крайней мере 15 дней был недавно введен3 ,4,5,6. Если эпителий роговицы и части стромы удаляются (всего около 300 мкм) из роговицы до культивирования, отек стромы уменьшается в разделенных кнопках роговицы, что приводит к меньшей эндотелиальной потере клеток и ухоженной эндотелиальной клеточный слой после 15 дней, в то время как не расщепленные кнопки роговицы показывают значительную эндотелиальную потерю клеток из-за неравномерного стромального отека и образования складок Десцемета. Глаз банки обычно используют осмотические деоретные агенты, такие как декек, чтобы уменьшить отек роговицы до трансплантации. Тем не менее, эти агенты были показаны, чтобы вызвать увеличение эндотелиальной потери клеток7,8,9.
Эта статья направлена на визуализацию этой стандартизированной модели исследования ex vivo в подробном пошаговом протоколе, чтобы позволить будущим следователям проводить исследования по эндотелию роговицы с помощью сплит-кнопок роговицы. Эта модель представляет собой простой метод для тестирования веществ и методов, используемых в глазу, таких как офтальмологические вязкоупругие устройства, оросительные растворы, и ультразвуковой энергии, или другие процедуры, где эндотелий роговицы представляет интерес.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Subject</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pig eyes</td>
			<td>local abbatoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substances</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium 1, #F9016</td>
			<td>Biochrom GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Biochrom GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypotonic balanced salt solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td>per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidon iodine 7.5%, Braunol</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl) 0.9%</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH) solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials &#38; Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu-jet pro</td>
			<td>Brand GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker Glass 50 mL</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt cannula incl. Filter (5 &#181;m) 18G</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate (12 well)</td>
			<td>Corning Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette</td>
			<td>Eppendorf AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Bulb Holder</td>
			<td>L. Klein, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded Filter &#248; 185 mm</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hockey knife</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MillexGV Filter (5 &#181;m)</td>
			<td>Merck Millopore Ltd., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needler holder</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR International, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel (single use), triangular blade</td>
			<td>Aesculap AG &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cups</td>
			<td>Greiner Bio-One, &#214;sterreich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td>Paul Hartmann AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical drape</td>
			<td>Paul Hartmann AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stitch scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6</td>
			<td>Ethicon Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (5 mL)</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trephine &#248; 7.5 mm</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tying forceps</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment &#38; Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular surgical microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera mounted on microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Entry (software)</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold-light source</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Olympus GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer with heating function</td>
			<td>IKA-Werke GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter pHenomenal</td>
			<td>VWR International, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS2</td>
			<td>Adobe Systems, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Ohaus Europe GmbH, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a porcine corneal endothelial organ culture model using split corneal buttons

Экспериментальные исследования эндотелиальных клеток роговицы связаны с несколькими трудностями. Роговицы донора человека являются скудными и редко доступны для экспериментальных исследований, поскольку они обычно необходимы для трансплантации. Эндотелиальные клеточные культуры часто не очень хорошо переводятся в ситуации in vivo. Из-за биоструктурных характеристик нечеловеческих роговиц, стромальный отек во время выращивания вызывает значительную потерю эндотелиальных клеток роговицы, что затрудняет культивирование в течение длительного периода времени. Для противодействия этому ответу используются деозавуированные агенты, такие как декек. Тем не менее, они также вызывают значительную потерю эндотелиальных клеток. Таким образом, была создана модель культуры культуры ex vivo, не требующая деотечных агентов. Свиньи глаза из местной скотобойни были использованы для подготовки раскол роговицы кнопки. После частичного трефинации роговицы внешние слои роговицы (эпителий, слой лукмана, части стромы) были удалены. Это значительно снижает потери эндотелиальных клеток роговицы, вызванные массивным стромальным отеком и мембраной Десцемета, складывающейся в течение более длительных периодов культивирования, и улучшает общее сохранение эндотелиального клеточного слоя. Последующее полное трифинирование роговицы последовало удаление раскол апогея кнопки из оставшейся луковицы глаза и выращивания. Плотность эндотелиальных клеток оценивалась в период ы наблюдения до 15 дней после приготовления (т.е. дней 1, 8, 15) с помощью световой микроскопии. Используемый метод подготовки позволяет лучше сохранить эндотелиальный слой клеток, включенный менее стромальным отеком тканей, что приводит к медленному и линейному снижению в сплит-кнопках роговицы, сопоставимых с роговицами донора человека. Поскольку эта стандартизированная органо-типично культивируемая исследовательская модель впервые позволяет стабильно культивироваться в течение по крайней мере двух недель, она является ценной альтернативой кукурузе донора человека для будущих исследований различных внешних факторов в отношении их оказывает влияние на эндотелий роговицы.

Представленный метод вскрытия подразумевает частичное удаление стромальной ткани, в результате чего более тонкий образец роговицы и, таким образом, менее стромальный отек(рисунок 1 и рисунок 2). Менее стромальный отек вызывает меньше с?...

Watch this Scientific Journal Video about A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons at JoVE.com

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

Здесь представлен пошаговой протокол для приготовления и выращивания свиных роговицы. Поскольку эта органо-типично культивируемая модель культуры органов показывает показатели смертности клеток в течение 15 дней, сопоставимые с роговицами донора человека, она представляет собой первую модель, позволяющую долгосрочное культивирование нечеловеческих роговиц без добавления токсичных декрен.

Свиная Корнел Эндотелиальная модель органной культуры с использованием сплит-корневых кнопок

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

Этот протокол представляет собой первую исследовательскую модель, позволяющую органотипное долгосрочное культивирование эндотелиальных клеток роговицы, достигнутые с подготовкой кнопок расщепляется роговицы. Частично удаляя внешние слои роговицы, эндотелиальная потеря клеток значительно уменьшается, что позволяет выращивать эндотелиальные клетки роговицы, по крайней мере 15 дней. Таким образом, эта модель является ценным для изучения воздействия конкретных веществ или методов, представляющих интерес, таких как оросительные растворы или офтальмологические вискоэлестические устройства на эндотелий роговицы.После получения свиных глаз, которые были удалены вскоре после смерти, использовать ножницы для глаз и Colibri типсы, чтобы удалить все орбитальные adnexes. Поместите пять-шесть глаз в пятипроцентный раствор йода PBS в общей сложности пять минут, чтобы должным образом дезинфицировать поверхности глаз, с тщательным перемешиванием один раз в минуту, чтобы убедиться, что поверхности полностью погружены для достижения полной дезинфекции. Через пять минут перенесите дезинфицированные глаза на чашку чистого PBS и тщательно перемешайте ее, чтобы тщательно вымыть раствор йода PBS с глазных поверхностей.Перед началом вскрытия используйте тупой катетер, чтобы заполнить пятими миллилитровый шприц двумя миллилитров свежеоттаянной сыворотки теленка плода, и процедить сыворотку через 0,22 микрометрового фильтра в 80 миллилитров декстран-свободной среды культуры. Аккуратно агитировать смесь для достижения однородного распределения сыворотки, и добавить три миллилитров среды к каждому хорошо 12-хорошо пластины клеточной культуры. Когда пластина будет готова, передача глазной лампы в глазник под офтальмологическим хирургическим микроскопом с роговицей лицом вверх, и использовать шприц заполнены 0,9% хлорида натрия применять небольшое всасывание в глаза над держатель лампочки, чтобы исправить глаз на месте.Используйте трефин, содержащий стандартизированный вставки, чтобы нарезать поверхностно в центральной роговицы, не глубже, чем 300 микрометров, и использовать Colibri типсов и одноразовый скальпель с треугольным лезвием, чтобы сократить и удалить частично трефинированный фрагмент роговицы горизонтально через строму. Поверхностно поместите 10-0 шва в строму, чтобы дифференциация эндотелиала от стромальной стороны во время экспериментов, не проникая в эндотелий роговицы, и использовать трефин без вставки для продвижения trephine вырезать на всю глубину, пока передняя камера глаза не будет достигнута. Явное падение резистентности и утечки жидкости из передней камеры глаза может быть воспринято после полного проникновения роговицы.Поместите полученную кнопку роговицы, содержащую часть стромы, мембрану Десемета и эндотелий роговицы в один колодец пластины из 12 колодец с помеченной стороной лицом вниз. Затем отметь каждый хорошо на пластине культуры с индивидуальным номером для каждой кнопки раскол роговицы для идентификации во время последующих мер. Когда все кнопки роговицы были собраны, поместите 12-хорошо пластины в инкубаторе клеточной культуры на 37 градусов по Цельсию, пять процентов углекислого газа, и 95% влажности, заменив супернатант на восьмой день, если семидневный инкубационный период превышен.Для выполнения неоплательянное обследование, добавить три миллилитров гипотонического сбалансированного соленого раствора для каждого хорошо 12-хорошо пластины, и тщательно поместите одну кнопку раскол роговицы в каждый хорошо, чтобы вызвать отек эндотелиальных клеток роговицы, и улучшить видимость клеток для подсчета. Через одну-две минуты используйте микроскопную камеру, чтобы получить по крайней мере три изображения трех различных областей эндотелия, чтобы получить репрезентативное впечатление о фактическом состоянии эндотелия роговицы, и добавить планку масштаба с реальной длиной 100 микрометров для более позднего анализа. Чтобы предотвратить осмотическое повреждение, перенесите кнопку расщепленного роговицы из раствора через максимум пять минут обратно в культурную среду.Для выполнения окрашенных экспертизы, место раскол роговицы кнопки в отдельных чашках Петри, эндотелиальной стороне вверх, и использовать пипетку медленно падение 0,25%Trypam синий раствор на каждый роговицы эндотелия в течение 90 секунд на образец. Далее, тщательно промыть кнопки три раза в 0,9% хлорида натрия в небольшой стакан перед использованием пипетки медленно падение 0,2%Alizarin Red S раствор на эндотелии в течение 90 секунд. Затем изображение образцов, как только что продемонстрировали.Чтобы подготовить изображения для оценки плотности клеток и морфологии, откройте изображения в соответствующей программе редактирования графики и проецируете квадрат с истинной длиной стороны 100 микрометров на изображении. Чтобы обрезать планку масштаба, используйте прямоугольный инструмент шатер, чтобы граничить с баром масштаба и выбрать редактировать и обрезать. Нажмите файл и новый, и выберите буфер обмена.Обратите внимание на соответствующие пиксели для других изображений и нажмите OK. Нажмите файл и новый снова, и вставьте ширину и длину квадрата подсчета пикселей в всплывающем окне в зависимости от длины полосы масштаба. Выберите белый цвет в качестве фонового цвета и нажмите OK, чтобы выбрать все и скопировать выбранное изображение. Выберите изображение эндотелия роговицы и вставьте квадрат на эндотелий роговицы.Выберите квадратный слой и установите непрозрачность до 30%, затем нажмите OK и сохраните изображение с прогнозируемым квадратом с истинной длиной слайда 100 микрометров. Чтобы оценить плотность эндотелиальных клеток, откройте изображения с проецируемыми квадратами в ImageJ и откройте плагин счетчика ячейки. Чтобы подсчитать ячейки в квадрате, нажмите инициализировать, чтобы подсчитать эндотелиальные ячейки с двух сторон квадрата и записать результат.Для оценки морфологических параметров подсчитайте совместное собрание не менее четырех клеток на клеточной границе, характерный вид розетки и красные области Ализарин в пределах прогнозируемых квадратов. В течение 15 дней, разделенные кнопки роговицы демонстрируют устойчивое снижение плотности эндотелиальных клеток, со средним еженедельным процентом эндотелиальной потери клеток 4,90% Окрашивание эндотелиального клеточного слоя на 15-й день позволяет морфологический анализ клеток роговицы, с показателями реформирования, что составляет около семи процентов от слияния границ клеток, медиана примерно одного образования розетки на миллиметр на образец , и около 13 пунктуальных потерь клеток на миллиметр в квадрате. Здесь можно наблюдать репрезентативные изображения эндотелия роговицы во время микроскопической оценки в гипотоническом сбалансированном соляном растворе, а после окрашивания трипан-синим и ализарином Red S.Если раскол роговицы кнопки культивируются с эндотелиальной стороны лицом вниз, обширные повреждения эндотелиальных клеток следует ожидать. Нераздвочные кнопки роговицы страдают значительно повышенной эндотелиальной потерей клеток из-за стромального отека, в результате чего мембрана Descemet складывается в течение 15 дней выращивания, в то время как разделенные кнопки роговицы демонстрируют в значительной степени сохранившийся эндотелий роговицы после 15 дней выращивания, о чем свидетельствует рассеянный пунктуальный Ализарин красно-окрашенных областях, что свидетельствует о одной разрушенной клетки. Чтобы свести к минимуму потерю клеток, следует позаботиться, чтобы не касаться эндотелия роговицы на протяжении всех этапов этого протокола.

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

Роговицы конфокальной микроскопии: Роман неинвазивной техники количественно Малый Fibre патологии периферической нервной системы

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Подготовка ткани роговицы донора для эндотелиальных Кератопластика

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Щелочно-сжечь травмы Модель неоваскуляризации роговицы у мышей

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Мышиные Трансплантация роговицы: Модель по изучению наиболее распространенная форма твердого трансплантации органов

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

Роговицы донора Подготовка ткани для Десцемета мембраны эндотелиальных кератопластики

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, ...

Technique of Porcine Liver Procurement and Orthotopic Transplantation using an Active Porto-Caval Shunt

Методика свиной печени закупок и Ортотопическая трансплантации с использованием активного Порто-Caval шунт

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Роговицы эпителиальных истиранию с глазной заусенцев, как модель для роговицы заживление ран

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo роговицы орган культуры модель для заживления ран исследований

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Разработка неинвазивной, лазерной экспериментальной модели потери эндотелиальной клетки Корнела

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Orthotopic Kidney Auto-Transplantation in a Porcine Model Using 24 Hours Organ Preservation And Continuous Telemetry

Ортопедическая трансплантация почек в свиной модели с использованием 24 часов сохранения органов и непрерывной телеметрии

In the present era of organ transplantation with critical organ shortage, various strategies are employed to expand the pool of available allografts for ...