Name: a porcine corneal endothelial organ culture model using split corneal buttons
Uploaded: 2019-10-06T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons at JoVE.com

Sunulan araştırma modelinin kurulması, Almanya Eğitim ve Araştırma Bakanlığı'nın KMU-innovativ (FKZ: 13GW0037F) tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol kurumumuzun etik kurallarına uygundur. Kurumumuzun etik inceleme komitesi tüzüğüne uygun olarak, tüm domuz korneaları yerel mezbahadan alındığı için deneylerden önce etik onay alınmak zorunda değildir.
1. Organ kültürü
<ol><li>Domuz gözlerini hazırlayın.<ol>
<li>Yerel mezbahadan, kısa bir süre sonra ölümden sonra kaldırıldı domuz gözleri elde ama termal tedavi den önce. Gözleri laboratuara götürün ve birkaç saat içinde işleyin. Taşıma sıras...

<ol>
	<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking.">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li><li>Roy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro.">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).</li><li>Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+density+in+porcine+corneas+after+exposure+to+hypotonic+solutions.">Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).</li><li>Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+temporary+hypothermia+on+corneal+endothelial+cell+density+during+organ+culture+preservation.">Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).</li><li>Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+temporary+hyperthermia+on+corneal+endothelial+cell+survival+during+organ+culture+preservation.">Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).</li><li>Kunzmann, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+Of+A+Porcine+Corneal+Endothelial+Organ+Culture+Model+For+Research+Purposes.">Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes.</a> Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).</li><li>Redbrake, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+histochemical+study+of+the+distribution+of+dextran+500+in+human+corneas+during+organ+culture.">A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture.</a> Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poloxamines+for+Deswelling+of+Organ-Cultured+Corneas.">Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas.</a> Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).</li><li>Filev, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-quantitative+assessments+of+dextran+toxicity+on+corneal+endothelium:+conceptual+design+of+a+predictive+algorithm.">Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm.</a> Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).</li><li>Pels, E., Schuchard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-culture+preservation+of+human+corneas.">Organ-culture preservation of human corneas.</a> Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).</li><li>Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology,+Histology+and+Ultrastructure+of+Human+C31+Organ-Cultured+Corneas.">Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas.</a> Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).</li><li>Linke, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+cornea+cultivation:+long-term+experience+in+a+single+eye+bank.">Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank.</a> Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).</li><li>Schroeter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arbeitsrichtlinien+-+Gute+Fachliche+Praxis+f&#252;r+Hornhautbanken+[Procedural+guidelines.+Good+tissue+practice+for+cornea+banks].">Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis f&#252;r Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks].</a> Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).</li><li>Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+swelling+pressure+of+the+corneal+stroma.">The swelling pressure of the corneal stroma.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 1, 158-162 (1962).</li><li>Xuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+corneal+stroma:+importance+in+visual+function.">Proteins of the corneal stroma: importance in visual function.</a> Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).</li><li>Sperling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Corneal+Endothelium+in+Organ+Culture+-+The+Influence+of+Temperature+and+Medium+of+Incubation.">Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation.</a> Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).</li><li>Schroeter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Evaluation+in+the+Cornea+Bank.">Endothelial Evaluation in the Cornea Bank.</a> Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).</li><li>Pels, E., Schuchard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Effects+of+High+Molecular+Weight+dextran+on+the+Presevation+of+Human+Corneas.">The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas.</a> Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).</li><li>van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Microscopy+of+Cultured+Human+Corneas+Osmotic+Hydration+and+the+Use+of+dextran+Fraction+(dextran+T+500)+in+Organ+Culture.">Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture.</a> Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).</li><li>Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+compound-free+medium+and+poloxamer+for+human+corneal+organ+culture+and+Deswelling.">Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).</li><li>Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+endothelial+cells+does+not+change+the+result+of+cell+density.">Staining of endothelial cells does not change the result of cell density.</a> Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).</li><li>Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+perfluorobutylpentane+(F4H5)+on+corneal+endothelial+cells.">Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells.</a> Current Eye Research. , (2019).</li><li>Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sand&#248;e, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3Rs+principle+-+mind+the+ethical+gap!.">The 3Rs principle - mind the ethical gap!.</a> ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).</li><li>Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parameters+of+the+porcine+eyeball.">The parameters of the porcine eyeball.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).</li><li>Kim, M. K., Hara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+corneal+xenotransplantation.">Current status of corneal xenotransplantation.</a> International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Proliferative+Capacity+of+Genetically-Engineered+Pig+and+Human.">Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human.</a> Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).</li></ol>

Bu protokol araştırma amaçlı standart ve düşük maliyetli ex vivo kornea endotel organ kültür modeli temsil domuz bölünmüş kornea düğmeleri, hazırlanması için bir yöntem sağlar6. Domuz bölünmüş kornea düğmeleri iki haftalık bir süre içinde göz bankalarında ekili insan donör korneagöz görülen endotel hücre kayıpları ile karşılaştırılabilir endotel hücre yoğunluğunda bir azalma gösterdi6,10,...

Kornea transplantasyon işlemleri dünya çapında en sık yapılan transplantasyonlar arasında dır1. İnsan donör kornea ciddi bir sıkıntısı olduğu gibi, insan kornea kornea kornea endotel hücrelerini ele deneysel araştırma1gerçekleştirmek zordur. Ancak, göz içinde kullanılan sulama solüsyonları ve diğer maddelerin, oftalmik viskoelastik cihazların yanı sıra cerrahi alet ve tekniklerin (örn. fakoemülsifikasyon aletleri ve teknikleri, ultrason enerjisi) tanıtılması, klinik kullanım dan önce kornea endotel üzerindeki etkileri ile ilgili geçerli ve kapsamlı araştırmalar.
Araştırma için insan donör kornealarına birkaç alternatif vardır. Hayvan araştırma modelleri çok değerli ama aynı zamanda çok kaynak tüketen ve giderek etik sorgulanan. In vitro hücre kültürlerinin önemli bir dezavantajı insan gözüne sınırlı çeviri olduğunu. Hücre kültürlerinden elde edilen sonuçlar in vivo koşullara uyumsuz olabilir, çünkü hücreler endotel mezenkimal geçiş (EMT) geçirebilir, bu da hücre polaritesinin kaybı ve hücre şekli ve gen değişikliklerinden kaynaklanan fibroblast benzeri morfolojiile sonuçlanabilir. ifade2.
Önceki ex vivo modelleri sadece 120 saate kadar ekim süreleri rapor ederken, en az 15 gün taze domuz korneaları kültüre getirerek bir domuz kornea endotel organ kültür modeli oluşturmak için yeni bir hazırlık tekniği son zamanlardatanıtıldı 3 3 ,4,5,6. Kornea epiteli ve stromanın parçaları ekimden önce korneadan çıkarılırsa (toplam 300 m) stromanın şişmesi bölünmüş kornea düğmelerinde azalır ve bu da daha az endotel hücre kaybına ve bakımlı endotel kaybına neden olur. hücre tabakası 15 güne kadar, bölünmemiş kornea düğmeleri ise düzensiz stromal şişlik ve Descemet kıvrımlarının oluşumuna bağlı olarak önemli endotel hücre kaybı gösterir. Göz bankaları genellikle transplantasyon öncesi kornea ların şişmesini azaltmak için dekstran gibi ozmotik deswelling ajanları kullanır. Ancak, bu ajanlar artmış endotel hücre kaybınedengösterilmiştir 7,8,9.
Bu makalede, gelecekteki araştırmacıların bölünmüş kornea düğmeleri kullanarak kornea endotel üzerinde araştırma yapmalarını sağlamak amacıyla bu standartlaştırılmış ex vivo araştırma modelini ayrıntılı bir adım adım protokolde görselleştirmeyi amaçlamaktadır. Bu model, göz içi viskoelastik cihazlar, sulama solüsyonları ve ultrason enerjisi veya kornea endotellerinin ilgi çekici olduğu diğer işlemler gibi göz içinde kullanılan maddeleri ve teknikleri test etmek için basit bir yöntemi temsil eder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Subject</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pig eyes</td>
			<td>local abbatoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substances</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin red S</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium 1, #F9016</td>
			<td>Biochrom GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS (1x)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Biochrom GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl) solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypotonic balanced salt solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td>per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidon iodine 7.5%, Braunol</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl) 0.9%</td>
			<td>B. Braun Melsungen AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH) solution</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials &#38; Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu-jet pro</td>
			<td>Brand GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker Glass 50 mL</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt cannula incl. Filter (5 &#181;m) 18G</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plate (12 well)</td>
			<td>Corning Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri forceps</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corneal scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf pipette</td>
			<td>Eppendorf AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Bulb Holder</td>
			<td>L. Klein, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folded Filter &#248; 185 mm</td>
			<td>Whatman, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hockey knife</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bar</td>
			<td>Carl Roth GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MillexGV Filter (5 &#181;m)</td>
			<td>Merck Millopore Ltd., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needler holder</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>VWR International, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel (single use), triangular blade</td>
			<td>Aesculap AG &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>Sarstedt AG &#38; Co., Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cups</td>
			<td>Greiner Bio-One, &#214;sterreich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td>Paul Hartmann AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical drape</td>
			<td>Paul Hartmann AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stitch scissors</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6</td>
			<td>Ethicon Inc., USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (5 mL)</td>
			<td>Becton Dickinson, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trephine &#248; 7.5 mm</td>
			<td>own production</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tying forceps</td>
			<td>Geuder AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing paper</td>
			<td>neoLab Migge GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment &#38; Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular surgical microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera mounted on microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Entry (software)</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold-light source</td>
			<td>Schott AG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Heraeus GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase contrast microscope</td>
			<td>Olympus GmbH, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer with heating function</td>
			<td>IKA-Werke GmbH &#38; Co. KG, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-meter pHenomenal</td>
			<td>VWR International, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS2</td>
			<td>Adobe Systems, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision scale</td>
			<td>Ohaus Europe GmbH, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a porcine corneal endothelial organ culture model using split corneal buttons

Kornea endotel hücreleri üzerinde deneysel araştırma çeşitli zorluklarla ilişkilidir. İnsan donör kornealar nadirdir ve normalde transplantasyon için gerekli olduğu için deneysel araştırmalar için nadiren kullanılabilir. Endotel hücre kültürleri genellikle in vivo durumlara iyi tercüme etmez. İnsan olmayan korneaların biyoyapısal özellikleri nedeniyle, ekim sırasında stromal şişlik önemli kornea endotel hücre kaybına neden olur, bu da uzun bir süre için ekimi yapmak zor hale getirir. Bu yanıtı etkisiz hale getirmek için dextran gibi şişme ajanları kullanılır. Ancak, onlar da önemli endotel hücre kaybına neden olur. Bu nedenle şişme ajanlar gerektirmeyen bir ex vivo organ kültür modeli oluşturulmuştur. Yerel bir mezbahadan domuz gözleri bölünmüş kornea düğmeleri hazırlamak için kullanılmıştır. Kısmi kornea trehinasyonundan sonra korneanın dış katmanları (epitel, bowman tabakası, stromanın bazı kısımları) çıkarıldı. Bu önemli ölçüde büyük stromal şişme ve Descemet membran uzun ekim dönemleri boyunca katlama tarafından indüklenen kornea endotel hücre kaybını azaltır ve endotel hücre tabakasının genel korunmasını artırır. Sonraki tam kornea trehinasyonu kalan göz soğanı ve ekimi bölünmüş kornea düğmesinin kaldırılması izledi. Endotel hücre yoğunluğu, ışık mikroskobu kullanılarak hazırlıktan 15 gün sonraya kadar (örn. 1, 8, 15 gün) takip sürelerinde değerlendirildi. Kullanılan hazırlama tekniği daha az stromal doku şişmesi ile etkin endotel hücre tabakasının daha iyi korunmasını sağlar, hangi insan donör kornea karşılaştırılabilir bölünmüş kornea düğmelerinde yavaş ve doğrusal düşüş oranları ile sonuçlanır. İlk kez bu standart organo-tipik ekili araştırma modeli en az iki hafta istikrarlı bir ekimi sağlar gibi, onların açısından çeşitli dış faktörlerin gelecekteki araştırmalar için insan donör kornealar için değerli bir alternatiftir kornea endotel üzerindeki etkileri.

Sunulan diseksiyon tekniği stromal dokunun kısmi olarak çıkarılması, daha ince kornea örneği ve dolayısıyla daha az stromal şişlik ile sonuçlanan anlamına gelir(Şekil 1 ve Şekil 2). Daha az stromal şişlik kornea endotel üzerinde olumsuz bir etkiye sahip daha az makas ve çimdik kuvvetleri neden olur, böylece daha düşük endotel hücre kaybı oranları neden6. Bölünmüş kornea düğ...

Watch this Scientific Journal Video about A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons at JoVE.com

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

Burada domuz eti bölünmüş kornea düğmelerinin hazırlanması ve yetiştirilmesi için adım adım bir protokol sunulmuştur. Bu organo-tipik ekili organ kültürü modeli 15 gün içinde hücre ölüm oranlarını gösterir gibi, insan donör kornea karşılaştırılabilir, toksik dekstran eklemeden insan dışı kornea uzun vadeli ekimi sağlayan ilk modeli temsil eder.

Split Korneal Düğmeleri Kullanarak Bir Domuz Korneal Endotel Organ Kültür Modeli

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

Bu protokol, bölünmüş kornea düğmelerinin hazırlanması ile elde edilen kornea endotel hücrelerinin organotipik uzun süreli ekimine olanak sağlayan ilk araştırma modelini sunmaktadır. Kısmen dış kornea tabakaları kaldırarak, endotel hücre kaybı önemli ölçüde azalır, kornea endotel hücrelerinin ekimi izin 15 gün. Bu nedenle, bu model kornea endotel üzerinde sulama çözümleri veya oftalmik viskoelastik cihazlar gibi ilgi belirli maddelerin veya tekniklerin etkilerini araştırmak için değerlidir.Kısa bir süre sonra ölümden sonra çıkarılan domuz gözleri aldıktan sonra, tüm orbital adnexes kaldırmak için göz makas ve Colibri forceps kullanın. Göz yüzeylerini düzgün bir şekilde dezenfekte etmek için yüzde beş iyot PBS çözeltisine beş ila altı göz yerleştirin, tam bir dezenfeksiyon elde etmek için yüzeylerin tamamen batırılmış olduğundan emin olmak için dakikada bir kez dikkatlice karıştırarak. Beş dakika sonra, dezenfekte edilmiş gözleri bir fincan saf PBS'ye aktarın ve iyot PBS çözeltisini göz yüzeylerinden iyice yıkamak için dikkatlice karıştırın.Diseksiyonun başlamasına başlamadan önce, beş mililitrelik bir şırıngayı iki mililitre taze çözülmüş fetal buzağı serumuyla doldurmak için künt bir kateter kullanın ve serumu 0,22 mikrometrelik bir filtreden 80 mililitre dekstran içermeyen kültür ortamına süzün. Yavaşça serum homojen bir dağıtım elde etmek için karışımı ajite, ve 12-iyi hücre kültür plaka her kuyuya orta üç mililitre ekleyin. Plaka hazır olduğunda, kornea bakan bir göz soğanı altında bir göz ampulü tutucu içine bir göz ampulü aktarın, ve yerinde göz düzeltmek için göz ampulü tutucu üzerinde göze hafif emme uygulamak için% 0.9 sodyum klorür ile dolu bir şırınga kullanın.Merkezi korneaiçine yüzeysel olarak kesmek için standart bir kayı içeren bir trephine kullanın, daha derin 300 mikrometre, ve kolibri forceps ve üçgen bıçak ile tek kullanımlık neşter kullanın kesmek ve stroma ile yatay korneanın kısmen trephined parçası kaldırmak için. Yüzeysel olarak, deneyler sırasında kornea endoteline girmeden, endotel'in stromal tarafından farklılaşmasını sağlamak için stroma10-0 dikiş yerleştirin ve ön göz odasına ulaşılıncaya kadar trephine kesimini tam derinliğe kadar ilerletmek için kalmaksızın bir trephine kullanın. Anterior göz odasından sızan direnç ve sıvıda belirgin bir düşüş korneanın tam penetrasyonundan sonra algılanabilir.Stromanın bir kısmını, Descemet zarını ve kornea endotellerini içeren bölünmüş kornea düğmesini 12 kuyulu plakanın bir kuyusuna yerleştirin. Daha sonra her bir iyi kültür plakası üzerinde her bölünmüş kornea düğmesi için ayrı bir numara ile etiket takipleri sırasında kimlik için. Kornea düğmelerinin tümü toplandığında, 12 kuyulu plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine 37 santigrat derece, %5 karbondioksit ve %95 nem oranıyla yerleştirin ve yedi günlük kuluçka süresi aşılırsa sekizinci gün süpernatantın yerini alın.Lekesiz bir muayene yapmak için, 12 kuyulu bir plaka her kuyuya hipotonik dengeli tuz çözeltisi üç mililitre ekleyin ve kornea endotel hücrelerinin şişmesine neden olmak için her kuyuya dikkatlice tek bir bölünmüş kornea düğmesi yerleştirin, ve saymak için hücrelerin görünürlüğünü artırmak için. 1-2 dakika sonra, kornea endotel gerçek durumu temsili bir izlenim elde etmek için endotel üç farklı alanlarda en az üç görüntü elde etmek için bir mikroskop kamera kullanın ve daha sonra analiz için 100 mikrometre gerçek-to-scale uzunluğu ile bir ölçek çubuğu ekleyin. Ozmotik hasarı önlemek için, solüsyondan bölünmüş kornea düğmesini en fazla beş dakika sonra kültür ortamına aktarın.Lekeli bir muayene yapmak için, ayrı Petri yemekleri bölünmüş kornea düğmeleri yerleştirin, endotel tarafı yukarı, ve yavaş yavaş her kornea endotel üzerine% 0.25 Trypam mavi çözüm damla bir pipet kullanın numune başına 90 saniye. Daha sonra, küçük bir cam kabın içinde %0,9 sodyum klorür içinde düğmeleri üç kez durulayın ve pipet kullanarak %0,2 Alizarin Red S çözeltisini endotel üzerine 90 saniye boyunca yavaşça düşürün. Sonra örnekleri az önce gösterildiği gibi hayal edin.Görüntüleri hücre yoğunluğu ve morfoloji değerlendirmesi için hazırlamak için, görüntüleri uygun bir grafik düzenleme yazılımı programında açın ve görüntü üzerinde 100 mikrometrelik gerçek ölçekte yan uzunluğu olan bir kare projelendirin. Ölçek çubuğunu kırpmak için, ölçek çubuğunu sınırlamak ve düzenleme ve kırpma seçmek için dikdörtgen çerçeve aracını kullanın. Dosya yı ve yeniyi tıklatın ve panoseçin.Diğer resimler için karşılık gelen pikselleri not edin ve Tamam'ı tıklatın. Dosyayı ve yeniyi yeniden tıklatın ve ölçek çubuğunun uzunluğuna göre açılan penceredeki piksellere sayım karesinin genişliğini ve uzunluğunu ekleyin. Arka plan rengi olarak beyaz'ı seçin ve tümünü seçmek için Tamam'ı tıklatın ve seçili resmi kopyalayın. Kornea endotel görüntüsünü seçin ve kornea endotel üzerinde kare yapıştırın.Kare katmanı seçin ve opaklığı %30'a ayarlayın Sonra Tamam'ı tıklatın ve 100 mikrometrelik gerçek ölçekte slayt uzunluğuyla yansıtılan kareyle görüntüyü kaydedin. Endotel hücre yoğunluğunu değerlendirmek için, Görüntüleri ImageJ'de öngörülen karelerle açın ve hücre sayacı eklentisini açın. Kare içindeki hücreleri saymak için, karenin iki tarafındaki endotel hücrelerini saymak ve sonucu kaydetmek için baş harfe döndür'ü tıklatın.Morfolojik parametreleri değerlendirmek için, hücre sınırı başına en az dört hücrenin ortak toplantısını, karakteristik rozet şeklindeki görünümü ve hedeflenen kareler içindeki Alizarin Kırmızı alanlarını sayın. 15 günlük bir süre içinde, bölünmüş kornea düğmeleri endotel hücre yoğunluğunda sürekli bir düşüş göstermektedir, ortalama haftalık yüzde endotel hücre kaybı ile 4.90%Gün 15 endotel hücre tabakasıboyama kornea hücrelerinin morolojik analizi sağlar, reformasyon rakamları ile birleşen hücre sınırlarının yaklaşık yüzde yedisini oluşturan, yaklaşık bir rozet örneklem başına milimetre başına bir median ve milimetre kare başına yaklaşık 13 dakik hücre kaybı. Burada hipotonik dengeli tuz çözeltisinde mikroskobik değerlendirme sırasında kornea endotellerinin temsili görüntüleri ve Trypan mavisi ve Alizarin Red S ile boyandıktan sonra görülebilir.Bölünmüş kornea düğmeleri endotel tarafı aşağı bakacak şekilde ekili ise, geniş endotel hücre hasarı beklenebilir. Bölünmemiş kornea düğmeleri stromal şişme nedeniyle önemli ölçüde artmış endotel hücre kaybı muzdarip, ekimi 15 gün boyunca Descemet membran katlama neden, bölünmüş kornea düğmeleri ekimi 15 gün sonra büyük ölçüde korunmuş kornea endotel sergi, dağınık noktasal Alizarin Kırmızı lekeli alanlarda kanıtlandığı gibi, tek tahrip hücrelerin göstergesi. Hücre kaybını en aza indirmek için, bu protokolün herhangi bir adımboyunca kornea endotel dokunmamaya dikkat edilmelidir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

Kornea Konfokal Mikroskop: Periferik Nöropatiler Küçük Fiber Patoloji belirlememize • Bir Roman Non-invaziv Tekniği

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Endotel Keratoplasti için Kornea Donör doku hazırlanması

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Fare Kornea Neovaskülarizasyonunun bir Alkali-yanık Yaralanma Modeli

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Sıçangiller Kornea Nakli: Katı Organ Nakli En Yaygın Formu Eğitim için Bir Model

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Corneal Donor Tissue Preparation for Descemet's Membrane Endothelial Keratoplasty

Descemet Membran endotelyal keratoplasti için Kornea Donör doku hazırlanması

Descemet&#8217;s Membrane Endothelial Keratoplasty (DMEK) is a form of corneal transplantation in which only a single cell layer, the corneal endothelium, ...

Technique of Porcine Liver Procurement and Orthotopic Transplantation using an Active Porto-Caval Shunt

Active Porto-Caval Shunt kullanarak Domuz Karaciğer Tedarik ve Ortotopik Nakli Tekniği

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Kornea epitel aşınma oküler Burr ile bir Model olarak kornea için yara iyileşme

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex vivo kornea Organ kültür modeli için yaranın çalışmaları

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Kornea Endotel Hücre Kaybının Noninvaziv, Lazer Destekli Deneysel Modelinin Geliştirilmesi

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

Orthotopic Kidney Auto-Transplantation in a Porcine Model Using 24 Hours Organ Preservation And Continuous Telemetry

24 Saat Organ Koruma Ve Sürekli Telemetri Kullanılarak Bir Domuz Modelinde Ortotopik Böbrek OtoTransplantasyonu

In the present era of organ transplantation with critical organ shortage, various strategies are employed to expand the pool of available allografts for ...