Name: in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells
Uploaded: 2019-09-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells at JoVE.com

ويتلقى البرنامج دعما من منحة توظيف خاصة من كلية الطب في جامعة موناش للتمريض والعلوم الصحية بتمويل من حكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الأسترالية. نشكر بيرند بوكو (ZMBH، جامعة هايدلبرغ، ألمانيا) وهارم ه. كامبينجا (قسم العلوم الطبية الحيوية للخلايا والنظم، جامعة خرونينغين، هولندا) على دعمهما ومشاركة الكواشف التي لا تقدر بثمن، هولغر لورنز (ZMBH) مرفق التصوير، جامعة هايدلبرغ، ألمانيا) لدعمه في الفحص المجهري البؤري ومعالجة الصور، وكلير هيرست (ARMI، جامعة موناش، أستراليا) للقراءة النقدية للمخطوطة.

1. إعداد خلية هيلا
<ol><li>إعداد المواد التالية: PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 m Na2HPO4,1.8 m KH2PO4),pH 7.4; DMEM، تستكمل مع 10٪ FCS و 1٪ القلم العقدية؛ 4% بارافورمالدهايد في PBS; 0.5% تريتون-X100 في PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0.05% Tween), pH 7.4; 0.0001٪ معقمة بولي-L-يسين الحل؛ 10 جيدا الشرائح التشخيصية؛ غرفة رطبة ، و المناد...

<ol>
	<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+structural+and+mechanistic+aspects+of+Hsp70+molecular+chaperones.">Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).</li><li>Kampinga, H. H., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HSP70+chaperone+machinery:+J+proteins+as+drivers+of+functional+specificity.">The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).</li><li>Nillegoda, N. B., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+Hsp70-based+protein+disaggregases:+emergence+and+mechanisms.">Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Bracher, A., Verghese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+exchange+factors+of+Hsp70+molecular+chaperones.">The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+HSP70+co-chaperone+complex+unlocks+metazoan+protein+disaggregation.">Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation.</a> Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+an+intricate+J-protein+network+driving+protein+disaggregation+in+eukaryotes.">Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Kirstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+properties+of+the+disaggregase+function+of+J-proteins+and+Hsc70+in+Caenorhabditis+elegans+stress+and+aging.">In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging.</a> Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).</li><li>Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Disaggregation+in+multicellular+organisms.">Protein Disaggregation in multicellular organisms.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).</li><li>Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CbpA,+a+DnaJ+homolog,+is+a+DnaK+co-chaperone,+and+its+activity+is+modulated+by+CbpM.">CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).</li><li>Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+J-domain-Triggered+ATP+Hydrolysis+by+Hsp70+Chaperones.">Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones.</a> Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Benschop, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+of+core+protein+complex+compositions+for+Saccharomyces+cerevisiae.">A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).</li><li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+RNA-protein+interactions+in+situ+using+modified-MTRIPs+and+proximity+ligation.">Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).</li><li>Mocanu, M. M., V&#225;radi, T., Sz&#246;llosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+proximity+ligation+assay+(PLA).">Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA).</a> Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).</li><li>Sekar, R. B., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+microscopy+imaging+of+live+cell+protein+localizations.">Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations.</a> Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).</li><li>Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).</li><li>Nagy, P., Sz&#246;llosi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+or+no+proximity:+that+is+the+question+&#8211;+but+the+answer+is+more+complex.">Proximity or no proximity: that is the question &#8211; but the answer is more complex.</a> Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).</li><li>Hoetelmans, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acetone,+methanol,+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure,+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+fixation+protocol+for+proteome-wide+immunofluorescence+localization+studies.">A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies.</a> Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).</li><li>Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+for+immunofluorescence+suppresses+localization+of+some+integral+membrane+proteins.">Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).</li><li>Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+liberates+the+membrane+modelling+protein+Pex11beta+from+peroxisomal+membranes.">Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes.</a> Histochemistry &amp; Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).</li><li>Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+antibody+localization+of+alpha2-macroglobulin+in+membrane-limited+vesicles+in+cultured+cells.">Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).</li><li>Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+yeast+cell+wall+composition+and+structure+in+response+to+growth+conditions+and+mode+of+cultivation.">A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation.</a> Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).</li><li>Romaniuk, J. A., Cegelski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+wall+composition+and+the+influence+of+antibiotics+by+cell-wall+and+whole-cell+NMR.">Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).</li><li>Salazar, O., Asenjo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+lysis+of+microbial+cells.">Enzymatic lysis of microbial cells.</a> Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).</li><li>Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+stationary+phase+induced+by+low+oxygen+tension:+cell+wall+thickening+and+localization+of+the+16-kilodalton+alpha-crystallin+homolog.">Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog.</a> Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).</li><li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).</li></ol>

وقد استخدمت النُهُج القائمة على التسيب المناعي المشترك والتوطين المشترك كأساليب طويلة الأمد لتوصيف تجميع البروتين. ويشكل الكشف عن مجمعات مرافقة محددة مشكلة بصورة عابرة تحديا رئيسيا بهذه الأساليب التقليدية، ونتيجة لذلك، فإن النتائج السابقة تقتصر إلى حد كبير على التفسيرات النوعية. غالبا...

كمية هائلة من المعلومات الجينية لا تزال غير قابلة للتفسير بسبب فهمنا غير الكامل للinteractomes الخلوية. إن منهجيات الكشف عن التفاعل التقليدي بين البروتين والبروتين، مثل الهطول المناعي المشترك للبروتين مع/بدون الربط بين المواد الكيميائية وتوطين البروتين المشترك، على الرغم من استخدامه على نطاق واسع، تشكل مجموعة من العيوب. وتشمل بعض المساوئ الرئيسية ضعف التحديد الكمي للتفاعلات وإمكانية إدخال أحداث ملزمة غير أصلية. وبالمقارنة، توفر التقنيات الناشئة القائمة على القرب نهجاً بديلاً وقوياً لالتقاط تفاعلات البروتين في الخلايا. اختبار الربط القرب (جيش التحرير الشعبى الصينى)1، والمتاحة الآن كمجموعة الملكية ، ويستخدم الأجسام المضادة لاستهداف على وجه التحديد مجمعات البروتين على أساس القرب من الوحدات الفرعية المتفاعلة.
بدأ جيش التحرير الشعبى الصينى من خلال تشكيل سقالة تتكون من الأجسام المضادة الأولية والثانوية مع علامات الحمض النووي الصغيرة (تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى) على سطح مجمع البروتين المستهدف (الشكل 1، الخطوات 1-3). بعد ذلك، التي يحددها القرب من علامات الحمض النووي، يتم إنشاء جزيء الحمض النوويالدائري عن طريق التهجين مع موصل oligonucleotides (الشكل 1، الخطوة 4). يتم الانتهاء من تشكيل الحمض النووي الدائري عن طريق خطوة ربط الحمض النووي. القطعة الدائرية التي تم تشكيلها حديثا من الحمض النووي بمثابة قالب لتضخيم دائرة المتداول اللاحقة (RCA) القائم على تفاعل سلسلة بوليميراز (PCR) تستعد من قبل واحدة من العلامات oligonucleotide المترافقة. وهذا يولد جزيء الحمض النووي المقعر الذي تقطعت به السبل واحد تعلقعلى مجمع البروتين عن طريق سقالة الأجسام المضادة (الشكل 1، الخطوة 6). يتم تصور جزيء الحمض النووي المتسلسل باستخدام oligonucleotides المسمى بشكل فلورسنت التي تهجينإلى تسلسل فريد ة متعددة متناثرة عبر الحمض النووي تضخيم (الشكل 1، الخطوة 7)2. تتوافق إشارة PLA التي تم إنشاؤها، والتي تظهر كنقطة فلورسنت (الشكل1، الخطوة 7)، مع موقع مجمع البروتين المستهدف في الخلية. ونتيجة لذلك، يمكن للتحليل الكشف عن مجمعات البروتين بدقة مكانية عالية. هذه التقنية لا تقتصر على مجرد التقاط تفاعلات البروتين، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم للكشف عن جزيئات واحدة أو تعديلات البروتين على البروتينات ذات الحساسية العالية1،2.
Hsp70 يشكل نظام مرافق ة متعدد الاستخدامات للغاية مهم بشكل أساسي للحفاظ على التوازن البروتين الخلوي من خلال المشاركة في مجموعة من التدبير المنزلي والوظائف المرتبطة بالإجهاد. وتشمل أنشطة التدبير المنزلي لنظام مرافقة Hsp70 دي نوفو طي البروتين، ونقل البروتين عبر الأغشية الخلوية، وتجميع وتفكيك مجمعات البروتين، وتنظيم نشاط البروتين وربط مختلف البروتين للطي / آلات مراقبةالجودة 3. نفس نظام الchaperone أيضا refolds misfolded /unfolded البروتينات، ويمنع تجميع البروتين، ويعزز تصنيف البروتين ويتعاون مع البروتياز الخلوية لتحلل البروتينات التي لا نهاية لها مطوية / التالفة لتسهيل إصلاح الخلوية بعد بروتيوسالاجهاد4,5. ولتحقيق هذا التنوع الوظيفي، يعتمد مرافق Hsp70 على الشراكة المشتركة بين الشركاء في عائلة JDP وعوامل التبادل النيوكليوتيد (NEFs) التي تقوم بصقل التحكم في اللوستريك المعتمد على ATP 70 من ربط الركيزة والإصدار3، 6. وعلاوة على ذلك، فإن المشاركين في مرافقة JDP تلعب دورا حيويا في اختيار ركائز لهذا النظام مرافقة تنوعا. وينقسم أفراد هذه الأسرة إلى ثلاث فئات (A و B و C) على أساس الهولوجية الهيكلية الخاصة بهم إلى النموذج الأولي JDP، E. coli DnaJ. الفئة A JDPs تحتوي على N-محطة J-المجال، الذي يتفاعل مع Hsp70، وهي منطقة غنية بالجلايسين فينيلألانين، وهي منطقة ملزمة الركيزة تتكون من منطقة تشبه أصابع الزنك (ZFLR) واثنين من المجالات بيتا برميل، ومجال ديميريسي محطة C. JDPs مع N-محطة J-المجال ومنطقة غنية بالجلايسين فينيلألانين، ولكن تفتقر إلى ZFLR، تقع في الفئة B. وبصفة عامة، يشارك أفراد هاتين الفئتين في مهام مرافقة. الأعضاء الذين يندرجون تحت الفئة C، والتي تحتوي على JDPs التي تشترك فقط في J-المجال4، تجنيد Hsp70s لأداء مجموعة متنوعة من وظائف غير مرافقة. وينعكس الدور الهام للJDPs كـ "محولات" قابلة للتبديل في نظام Hsp70 من خلال توسع أفراد الأسرة أثناء التطور. على سبيل المثال، البشر لديهم أكثر من 42 أعضاء JDP متميزة4. هذه JDPs تعمل كمونومرات، homodimers و / أو homo/hetero oligomers4،5. في الآونة الأخيرة، تعاون وظيفي عن طريق تشكيل معقدة عابرة بين الفئة ألف (على سبيل المثال، H. sapiens DNAJA2؛ S. cerevisiae Ydj1) والفئة B (على سبيل المثال، H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) تم الإبلاغ عن JDPs eukaryotic لتعزيز الاعتراف الفعال لمجاميع البروتين غير متبلور في المختبر7،8. هذه المجمعات JDP فئة مختلطة يفترض تجميع على سطح البروتينات المجمعة لتسهيل تشكيل Hsp70- و Hsp70 + Hsp100 القائم على البروتين disaggregases7،8،9، 10.تم توفير الأدلة الحاسمة لدعم وجود هذه المجمعات من فئة مختلطة شكلت عابرة JDP في الخلايا eukaryotic مع جيش التحرير الشعبى الصينى8.
ويستخدم جيش التحرير الشعبي بشكل متزايد لتقييم تفاعلات البروتين في ميتازوا، في المقام الأول في خلايا الثدييات. هنا، نبلغ عن التوسع الناجح لهذه التقنية لرصد المجمعات مرافقة شكلت عابرة في الكائنات أحادية الخلية eukaryotic وprokaryotic مثل الخميرة الناشئة S. سيريفيسياي والبكتيريا E. القولونية. والأهم من ذلك، يسلط هذا التوسع الضوء على الاستخدام المحتمل لجيش التحرير الشعبي في الكشف عن الميكروبات التي تصيب الخلايا البشرية والحيوانية وتحليلها.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJA2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJB1 Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-SPA-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DnaK antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mCherry antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sis1 Antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Corp</td>
			<td>COP-080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ydj1 antibody</td>
			<td>StressMarq Biosciences</td>
			<td>&#160;SMC-150,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-YFP antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin slide-staining jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnostic slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>1216530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Detection Reagents Orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P47-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>25300096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase 100T / / Lyticase</td>
			<td>United States Biological</td>
			<td>Z1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells

البروتينات J-المجال (JDPs) تشكل أكبر وأكثر تنوعا الأسرة المشتركة في الخلايا eukaryotic. وتظهر النتائج الأخيرة أن أعضاء معينين من عائلة JDP يمكن أن تشكل المجمعات غير المتجانسة العابرة في eukaryotes لضبط اختيار الركيزة لضبط البروتين صدمة الحرارة 70 kDa (Hsp70) المثبطون القائم على البروتين المفككة. تستهدف مجمعات JDP البروتينات المجمعة الناجمة عن الإجهاد الحاد/المزمن، ويفترض أنها تساعد في تجميع التدرجات عن طريق توظيف عدة من Hsp70s على سطح مجاميع البروتين. مدى شبكة مراقبة جودة البروتين (PQC) التي شكلتها هذه JDPs التفاعل جسديا لا يزال إلى حد كبير غير مميزة في الجسم الحي. هنا، نقوم بوصف الفحص المجهري القائم على التفاعل البروتيني في الموقع المسمى الفحص ربط القرب (PLA)، والتي هي قادرة على التقاط بقوة هذه المجمعات مرافقة شكلت عابرة في مقصورات الخلوية متميزة من الخلايا eukaryotic. عملنا يوسع توظيف جيش التحرير الشعبى الصينى من الخلايا البشرية إلى الخميرة(Saccharomyces cerevisiae)والبكتيريا (الإشريكيةالقولونية) ، مما يجعل أداة هامة لرصد ديناميات جمعيات البروتين شكلت بشكل عابر في كل من الخلايا البروكاريوتيكية وeukaryotic.

كشفت دراساتنا السابقة في المختبر باستخدام البروتينات النقية أن مجموعة فرعية من الفئة البشرية A والفئة B JDPs تشكل مجمعات مختلطة عابرة من فئة JDP لاستهداف مجموعة واسعة من البروتينات المجمعة بكفاءة وربما تسهيل تجميع Hsp70 القائم على البروتين التجمّع7. وظفنا جيش التحرير الشعبي لتحديد...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells at JoVE.com

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

تتعاون بروتينات Cognate J-domain مع مرافق Hsp70 للمساعدة في عدد لا يحصى من العمليات البيولوجية التي تتراوح بين طي البروتين إلى التدهور. هنا، ونحن نصف دراسة الربط القرب في الموقع، والذي يسمح برصد هذه الآلات مرافقة شكلت عابرة في الخلايا البكتيرية والخميرة والبشرية.

الرصد في الموقع للجمعيات النكّيّازة الجزيئية المشكلة بشكل عابر في البكتيريا والخميرة والخلايا البشرية

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

هذه الطريقة يلتقط التفاعلات البروتينية العابرة في الكائنات الحية مثل البكتيريا والخميرة وفي أنواع الخلايا المختلفة. هنا نرصد بشكل عابر تشكيل مجمعات مرافق محددة التي تشارك في بروتيوستاسيس الخلوية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على توليد معلومات عن الديناميات وتوطين شبه الخلوية من جمعيات البروتين في الخلايا prokaryotic والخلايا eukaryotic.التكيف من هذه التقنية في الكائنات الحية أحادية الخلية مثل البكتيريا والخميرة، ويسمح للباحثين لاستخدامها كأداة قوية للتحقيق في الأمراض المتعلقة بالالتهابات الميكروبية. ويمكن استخدام هذه التقنية لتحليل تفاعلات البروتين في جميع الكائنات تقريباً عن طريق مجرد تغيير الظروف في مرحلة إعداد العينة من البروتوكول. من المهم اختيار أجسام مضادة ذات نوعية جيدة محددة ومختبرة في إما الكيمياء المناعية، والفلوروسكية المناعية، و ELISA، أو الاعوداد المناعية.تبدأ قبل علاج الشرائح التشخيص 10 جيدا مع بولي L-ليسين. إضافة 100 microliters من العقيمة وتصفية 0.0001 ٪ بولي - L - ليسين إلى كل بئر ، واحتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة في غطاء محرك تدفق لارينار العقيمة. ثم، يغسل كل بئر مع 50 ميكرولترات من الماء المعقم لإزالة الزائدة بولي-ل-ليسين.إضافة ما يقرب من 15،000 خلية في البئر اعتمادا على نوع الخلية، وتنمو الخلايا في حاضنة رطبة عقيمة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون إلى 60 إلى 80٪التقاء. بعد 24 ساعة، وإزالة متوسطة النمو عن طريق وضع ورقة الأنسجة على حافة كل بئر، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 50 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. ثم إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 50 ميكرولترات من الطازجة أعدت 4٪ شبهفورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لكل بئر وتحتضن الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.بعد التثبيت ، اغسل الشريحة ثلاث مرات عن طريق غمر الشريحة في جرة تلطيخ الشريحة مع برنامج تلفزيوني. ل Permeabilize أغشية الخلايا المرفقة، غمر الشريحة في 100 ملليلتر من 0.5٪ تريتون-X100 في برنامج تلفزيوني، واحتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل الشرائح ثلاث مرات في TBS-T.بعد الغسيل الأخير، قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد بورق منديل. قم بزراعة خلايا S.cerevisiae وتمييعها وفقًا لتوجيهات المخطوطات، ثم نقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلترًا و بيليه بالطرد المركزي بمعدل 665 مرة ز لمدة ثلاث دقائق. إزالة افراط و resuspend الخلايا في خمسة ملليلتر من المتوسطة الطازجة.ثم إضافة 550 ميكرولترات من 37٪ الفورمالديهايد لتركيز النهائي من 4٪، واحتضان الثقافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لإصلاح الخلايا. بعد الحضانة، بيليه الخلايا، وإزالة عظمى، وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من إعداد حديثا 4٪ paraformaldehyde في عازلة الغسيل. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.وفي الوقت نفسه، وإعداد الشرائح التشخيصية عن طريق إضافة 100 ميكرولترات من 0.0001٪ بولي-L-ليسين حل لكل بئر واحتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل الزائد بولي-L-ليسين مع الماء فائقة الخطورة والسماح للشرائح الهواء الجاف. بعد خطوة الحضانة، وغسل الخلايا مرتين مع ملليلتر واحد من عازلة غسل عن طريق الطرد المركزي.إزالة فائقة وإعادة تعليق الخلايا في مخزن الغسيل. بيليه الخلايا بعد الغسيل الماضي، وإزالة السوبر و resuspend الخلايا في ملليلتر واحد من عازلة غسل تحتوي على 1.2 سوربيتول المولى. لهضم جدار الخلية، بيليه الخلايا مرة أخرى وإعادة تثبيت الخلايا في 250 ميكرولترات من حل Lyticase أعدت حديثا.احتضان الخلايا في 30 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز لطيف. بعد خطوة الهضم، وغسل الخلايا ثلاث مرات في عازلة غسل وإعادة تعليق الخلايا في 250 ميكرولترات من عازلة غسل تحتوي على 1.2 سوربيتول المول. إضافة 20 ميكرولترات من الخلايا التي أعيد تعليقها إلى كل بولي-L-Lysine المغلفة جيدا, والسماح للخلايا الثابتة و permeabilized إرفاق لمدة 30 دقيقة.اغسل الآبار ثلاث مرات بـ 50 ميكرولترات من عازل الغسيل لإزالة الخلايا غير المنضمة، وامضي في فحص الربط القربي. بدء عملية فحص الربط القربي، أو بروتوكول جيش التحرير الشعبي، عن طريق إضافة قطرة من العازلة حظر إلى كل بئر واحتضان الشريحة في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. إزالة العازلة حظر عن طريق وضع ورقة منديل على حافة كل بئر، وغسل الخلايا مرتين في 100 ملليلتر من غسل العازلة A.Next، إضافة 40 ميكرولترات من الحل الأجسام المضادة الأولية لكل بئر، واحتضان الشريحة لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.إزالة الحل الأجسام المضادة الأولية وغسل الشرائح مرتين في غسل العازلة A.After غسل، إضافة 40 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة الثانوية لكل بئر واحتضان الشريحة لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة. ثم إزالة الحل وغسل الشرائح مرتين في غسل العازلة A.Then إضافة 40 ميكرولترات من خليط الحمض النووي الربط الذي يحتوي على موصل oligonucleotides وحامض نووي ligase، إلى كل بئر، وتحتضن الشريحة في غرفة رطبة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، وإزالة خليط الربط وغسل الشرائح مرتين مع غسل العازلة A.Add 40 ميكرولترات من خليط التضخيم الحمض النووي الذي يحتوي على بوليميراز الحمض النووي وligonucleotides المسمى فلورية لكل بئر، واحتضان لمدة 100 دقيقة في غرفة رطبة في 37 درجة مئوية.إزالة خليط التضخيم وغسل الشرائح في 100 ملليلتر من غسل العازلة B لمدة 10 دقائق لكل غسل. ثم غسل الشرائح في 100 ملليلتر من غسل العازلة B المخفف واحد إلى 100 في المياه فائقة الطهر. إضافة 20 ميكرولترات من DAPI التي تحتوي على تركيب المتوسطة في البئر.تغطية آبار الشريحة مع زلة الغطاء وختم مع طلاء الأظافر. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لرصد الجمعيات المرافقة العابرة التي تشكلت بين بروتينات J-domain المتميزة وHsp70 مرافق والبروتينات J-domain في HeLa و S.cerevisiae وخلايا الإشريكية القولونية. تم استهداف بروتينات المجال من الفئة البشرية A و B J مع أجسام مضادة أولية محددة للغاية.كل من الفلورسنت الأحمر puncti يمثل مجمع البروتين شكلت بين اثنين من البروتينات J المجال متميزة في خلايا هيلا. كما لوحظت مجمعات بروتينية من الفئة المختلطة من فئة J في أحادي الخلية eukaryote S.cerevisiae، أو خميرة بيكر. وكان بعض من puncti الفلورسنت ولدت من جيش التحرير الشعبي أكثر صعوبة في حل باعتبارها بؤر الفردية، وذلك بسبب حجم الخلية الصغيرة.لم يتم ملاحظة التكوين المعقد بين بروتينات المجال من الفئة A و B J في خلايا الإشريكية القولونية ، وهو ما يتفق مع الدراسات الكيميائية الحيوية التي أجريت مع البروتينات النقية. ولكن تم القبض على الجمعيات المرافقة الأخرى التي تنطوي على البروتينات J-المجال وHsp70 مرافق باستخدام بروتوكول جيش التحرير الشعبي. الضوابط التقنية التي تفتقر إلى الأجسام المضادة الأولية ضد واحد من البروتينات J-المجال التفاعل أو المرافقين في ردود فعل جيش التحرير الشعبي كاملة خلاف ذلك أظهرت القليل أو عدم وجود تشكيل puncti الفلوريس في الخلايا، مما يشير إلى عدم وجود تضخيم إشارة إيجابية كاذبة.للحصول على نتائج موثوقة باستخدام مقايسة ربط القرب، تحقق مسبقا من أن الأجسام المضادة المستخدمة ذات جودة كافية. وعلاوة على ذلك، اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب الإفراط في هضم الخلايا التي تحتوي على جدار الخلية.

Research

JoVE Journal

Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

والفحص المجهري لالإسفار Mitophagy الرصد في الخميرة السكيراء الجعوية

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

على المدى الطويل اختبار السمية المهلكة مع القشريات الأرتيميا franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

إعادة برمجة الخلايا الجسدية البشرية المستحثة إلى الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) استخدام ناقلات فيروسات الرجعية مع GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

تحليل الزمانية المكانية من Cytokinetic الأحداث في الخميرة الانشطار

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

مقايسة مراسل المستندة إلى الأسفار بسيطة لتحديد المكونات الخلوية اللازمة للريسين سلسلة (RTA) الاتجار بالخميرة

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...