Name: in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells
Uploaded: 2019-09-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells at JoVE.com

NBN er understøttet af en særlig rekruttering tilskud fra Monash University Faculty of Medicine Nursing and Health Sciences med støtte fra staten regeringen i Victoria og den australske regering. Vi takker Bernd Bukau (ZMBH, Heidelberg Universitet, Tyskland) og harm H. Kampinga (Institut for biomedicinsk videnskab i celler & systemer, universitetet i Groningen, Nederlandene) for deres uvurderlige støtte og deling af reagenser, Holger Lorenz (ZMBH Imaging Facility, Heidelberg Universitet, Tyskland) for hans støtte med confokal mikroskopi og billedbehandling, og Claire Hirst (ARMI, Monash University, Australien) til kritisk læsning af manuskriptet.

1. HeLa-celle præparat
<ol><li>Forbered følgende materialer: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM na2HPO4, 1,8 mm KH2po4), pH 7,4; DMEM suppleret med 10% FCS og 1% pen-STREP; 4% PARAFORMALDEHYD i PBS; 0,5% Triton-X100 i PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,05% Tween), pH 7,4; 0,0001% steril poly-L-lysin opløsning; 10-brønd diagnostiske slides; et fugtigt kammer silkepapir; og Coplin slide-farvning krukker. Bemærk: For at sikre optimal fikserings effe...

<ol>
	<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+structural+and+mechanistic+aspects+of+Hsp70+molecular+chaperones.">Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).</li><li>Kampinga, H. H., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HSP70+chaperone+machinery:+J+proteins+as+drivers+of+functional+specificity.">The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).</li><li>Nillegoda, N. B., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+Hsp70-based+protein+disaggregases:+emergence+and+mechanisms.">Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Bracher, A., Verghese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+exchange+factors+of+Hsp70+molecular+chaperones.">The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+HSP70+co-chaperone+complex+unlocks+metazoan+protein+disaggregation.">Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation.</a> Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+an+intricate+J-protein+network+driving+protein+disaggregation+in+eukaryotes.">Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Kirstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+properties+of+the+disaggregase+function+of+J-proteins+and+Hsc70+in+Caenorhabditis+elegans+stress+and+aging.">In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging.</a> Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).</li><li>Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Disaggregation+in+multicellular+organisms.">Protein Disaggregation in multicellular organisms.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).</li><li>Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CbpA,+a+DnaJ+homolog,+is+a+DnaK+co-chaperone,+and+its+activity+is+modulated+by+CbpM.">CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).</li><li>Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+J-domain-Triggered+ATP+Hydrolysis+by+Hsp70+Chaperones.">Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones.</a> Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Benschop, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+of+core+protein+complex+compositions+for+Saccharomyces+cerevisiae.">A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).</li><li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+RNA-protein+interactions+in+situ+using+modified-MTRIPs+and+proximity+ligation.">Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).</li><li>Mocanu, M. M., V&#225;radi, T., Sz&#246;llosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+proximity+ligation+assay+(PLA).">Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA).</a> Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).</li><li>Sekar, R. B., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+microscopy+imaging+of+live+cell+protein+localizations.">Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations.</a> Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).</li><li>Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).</li><li>Nagy, P., Sz&#246;llosi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+or+no+proximity:+that+is+the+question+&#8211;+but+the+answer+is+more+complex.">Proximity or no proximity: that is the question &#8211; but the answer is more complex.</a> Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).</li><li>Hoetelmans, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acetone,+methanol,+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure,+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+fixation+protocol+for+proteome-wide+immunofluorescence+localization+studies.">A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies.</a> Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).</li><li>Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+for+immunofluorescence+suppresses+localization+of+some+integral+membrane+proteins.">Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).</li><li>Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+liberates+the+membrane+modelling+protein+Pex11beta+from+peroxisomal+membranes.">Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes.</a> Histochemistry &amp; Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).</li><li>Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+antibody+localization+of+alpha2-macroglobulin+in+membrane-limited+vesicles+in+cultured+cells.">Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).</li><li>Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+yeast+cell+wall+composition+and+structure+in+response+to+growth+conditions+and+mode+of+cultivation.">A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation.</a> Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).</li><li>Romaniuk, J. A., Cegelski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+wall+composition+and+the+influence+of+antibiotics+by+cell-wall+and+whole-cell+NMR.">Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).</li><li>Salazar, O., Asenjo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+lysis+of+microbial+cells.">Enzymatic lysis of microbial cells.</a> Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).</li><li>Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+stationary+phase+induced+by+low+oxygen+tension:+cell+wall+thickening+and+localization+of+the+16-kilodalton+alpha-crystallin+homolog.">Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog.</a> Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).</li><li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).</li></ol>

Co-immunoprecipitation og samlokaliserings baserede tilgange er blevet brugt som langvarige metoder til at karakterisere protein assembler. Påvisning af transitivt dannede specifikke chaperone komplekser er en stor udfordring med sådanne konventionelle metoder, og som følge heraf er tidligere resultater i vid udstrækning begrænset til kvalitative fortolkninger. Den cellelyse-baserede Co-immunoprecipitation teknikker kræver ofte Cross-Linking for at stabilisere protein-protein interaktioner. Celle lysis øger risik...

En enorm mængde af genomisk information forbliver ufortoldelig på grund af vores ufuldstændige forståelse af cellulære interactomes. Konventionelle protein-protein interaktion påvisning metoder såsom protein Co-immunoprecipitation med/uden kemisk Cross-linking og protein Co-lokalisering, selv om udbredte, udgør en række ulemper. Nogle af de største ulemper omfatter dårlig kvantificering af samspillet og den potentielle indførelse af ikke-indfødte bindende begivenheder. Til sammenligning giver nye nærheds baserede teknikker et alternativ og en stærk tilgang til at opfange protein interaktioner i celler. Nærhed ligering assay (PLA)1, nu tilgængelig som en proprietær kit, beskæftiger antistoffer til specifikt målrette protein komplekser baseret på nærhed af de interagerende under enheder.
PLA initieres ved dannelsen af et stillads bestående af primære og sekundære antistoffer med små DNA-Tags (PLA-sonder) på overfladen af det målrettede protein kompleks (figur 1, trin 1-3). Dernæst, bestemt af nærheden af DNA-Tags, et cirkulært DNA-molekyle genereres via hybridisering med konnektor oligonukleotider (figur 1, trin 4). Dannelsen af det cirkulære DNA er afsluttet med et DNA-ligations trin. Det nyligt dannede cirkulære stykke DNA fungerer som en skabelon for den efterfølgende rullende cirkel amplifikation (RCA)-baseret polymerasekæde reaktion (PCR) primet af en af de konjugeret oligonukleotid Tags. Dette genererer et enkeltstrenget koncatemerisk DNA-molekyle, der er fastgjort til protein komplekset via antistof stilladset (figur 1, trin 6). Det concatemeriske DNA-molekyle visualiseres ved hjælp af fluorescently mærkede oligonukleotider, der hybridiserer til flere unikke sekvenser spredt over det forstærkede DNA (figur 1, trin 7)2. Det genererede PLA-signal, der vises som en fluorescerende prik (figur 1, trin 7), svarer til placeringen af det målrettede protein kompleks i cellen. Som et resultat, analysen kunne detektere protein komplekser med høj rumlig nøjagtighed. Teknikken er ikke begrænset til blot at opfange protein interaktioner, men kan også udnyttes til at detektere enkelte molekyler eller protein modifikationer på proteiner med høj følsomhed1,2.
Hsp70 danner et meget alsidigt chaperone system, der er fundamentalt vigtigt for at opretholde cellulær protein homøostase ved at deltage i en vifte af husholdning og stress-relaterede funktioner. Husholdnings aktiviteterne i Hsp70 chaperone-systemet omfatter de Novo proteinfoldning, protein translokation på tværs af cellemembraner, montage og demontering af protein komplekser, regulering af protein aktivitet og sammenkædning af forskellige proteinfoldning/ kvalitetskontrol machineries3. Det samme chaperone-system omfolder også sammenfoldet/udfoldet proteiner, forhindrer protein sammenlægning, fremmer protein opdeling og samarbejder med cellulære proteaser om at nedbryde terminalt misfoldede/beskadigede proteiner for at lette cellulær reparation efter proteotoksiske belastninger4,5. For at opnå denne funktionelle mangfoldighed, er Hsp70 chaperone afhængig af partnerskab Co-Chaperones af JDP familie og nucleotid Exchange faktorer (nefs) at finjustere Hsp70's ATP-afhængige allosterisk kontrol af substrat binding og Release3, 6. Desuden spiller JDP Co-Chaperones en afgørende rolle i udvælgelsen af substrater til dette alsidige chaperone system. Medlemmer af denne familie er inddelt i tre klasser (A, B og C) baseret på deres strukturelle homologi til prototypen JDP, E. coli dnaj. Klasse A jdps indeholder en N-terminal J-domæne, som interagerer med Hsp70, en glycin-phenylalanin rige region, en substrat binding region bestående af en zink finger-lignende region (zflr) og to β-tønde domæner, og en C-Terminal denne domæne. JDPs med en N-terminal J-domæne og en glycin-phenylalanin rige region, men mangler ZFLR, falder i klasse B. Generelt er medlemmer af disse to klasser involveret i chaperoning funktioner. Medlemmer falder ind under paraplywebadresse klasse C, som indeholder jdps, der kun deler J-domæne4, rekruttere Hsp70s til at udføre en række ikke-chaperoning funktioner. JDPs ' vigtige rolle som udskiftelige substrat anerkendelse "adaptorer" af Hsp70 system afspejles af en udvidelse af familiens medlemmer under Evolution. For eksempel, mennesker har over 42 forskellige JDP medlemmer4. Disse jdps fungerer som monomerer, homodimers og/eller homo/hetero oligomerer4,5. For nylig et funktionelt samarbejde via forbigående kompleksdannelse mellemklasse A (f. eks. H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) og klasse B (f. eks. H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) eukaryotiske jdps blev rapporteret til at fremme effektiv anerkendelse af amorfe protein aggregater in vitro7,8. Disse blandede klasse JDP-komplekser samles formentlig på overfladen af aggregerede proteiner for at lette dannelsen af Hsp70-og Hsp70 + Hsp100-baserede protein-disaggregaser7,8,9, 10. de kritiske beviser til støtte for eksistensen af disse transitivt dannede blandede klasse JDP komplekser i eukaryote celler blev forsynet med PLA8.
PLA er i stigende grad ansat til at vurdere protein interaktioner i metazoa, primært i pattedyrceller. Her rapporterer vi den vellykkede udvidelse af denne teknik til at overvåge transitivt dannede chaperone komplekser i eukaryote og prokaryote unicellulære organismer som den spirende gær S. cerevisiae og bakterien E. coli. Vigtigere, denne ekspansion fremhæver den potentielle brug af PLA i at opdage og analysere mikrober, der inficere menneskelige og animalske celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJA2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJB1 Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-SPA-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DnaK antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mCherry antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sis1 Antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Corp</td>
			<td>COP-080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ydj1 antibody</td>
			<td>StressMarq Biosciences</td>
			<td>&#160;SMC-150,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-YFP antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin slide-staining jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnostic slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>1216530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Detection Reagents Orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P47-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>25300096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase 100T / / Lyticase</td>
			<td>United States Biological</td>
			<td>Z1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells

J-Domain proteiner (jdps) udgør den største og mest forskelligartede Co-chaperone familie i eukaryote celler. Nylige resultater viser, at specifikke medlemmer af JDP-familien kunne danne forbigående heterokomplekser i eukaryoter for at finjustere substrat valget for 70 kDa Heat Shock protein (Hsp70) chaperone-baserede protein disaggregaser. JDP komplekser Target akut/kronisk stress induceret aggregerede proteiner og formentlig hjælpe med at samle disaggregases ved at rekruttere flere Hsp70s til overfladen af protein aggregater. Omfanget af PQC-netværket (protein Quality Control), som er dannet af disse fysisk interagerende JDPs, er stort set ukarakteriseret in vivo. Her beskriver vi en mikroskopi baseret in situ-protein interaktions analyse, der kaldes nærhed ligering assay (PLA), som er i stand til robust at fange disse transitivt dannede chaperone komplekser i særskilte cellulære rum af eukaryote celler. Vores arbejde udvider beskæftigelsen af PLA fra humane celler til gær (Saccharomyces cerevisiae) og bakterier (Escherichia coli), hvilket gør et vigtigt redskab til at overvåge dynamikken i transitivt dannede protein samlinger i både prokaryotiske og eukaryotiske celler.

Vores tidligere in vitro-undersøgelser med renset proteiner afslørede, at en delmængde af humane klasse A-og klasse B-Jp'er danner forbigående blandede klasse JDP-komplekser for effektivt at målrette en bred vifte af aggregerede proteiner og muligvis lette samlingen af Hsp70-baserede protein disaggregaser7. Vi har ansat PLA til at afgøre, om blandede klasse (A + B) JDP komplekser forekommer i humane cervixcancer celler (HeLa). Humane JDPs DNAJA2 (klasse A) og DNAJB1 (klasse B) var rettet mod...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells at JoVE.com

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

Cognate J-Domain proteiner samarbejder med Hsp70 chaperone for at hjælpe i et utal af biologiske processer, der spænder fra proteinfoldning til nedbrydning. Her beskriver vi en in situ nærheds ligationsanalyse, som tillader overvågning af disse transitivt dannede chaperone-maskiner i bakterie-, gær-og humane celler.

In situ-monitorering af transitivt dannede molekylære Chaperone-samlinger i bakterier, gær og humane celler

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Denne metode opfanger forbigående proteininteraktioner i organismer som bakterier og gær og i forskellige celletyper. Her overvåger vi transiently dannet specifikke chaperone komplekser, der er involveret i cellulære proteostase. Den største fordel ved denne teknik er evnen til at generere oplysninger om dynamik og sub-cellulære lokalisering af protein forsamlinger i prokaryote og eukaryote celler.Tilpasninger af denne teknik i encellede organismer som bakterier og gær, giver forskerne mulighed for at bruge det som et effektivt redskab til at undersøge sygdomme relateret til mikrobielle infektioner. Denne teknik kan potentielt anvendes til at analysere proteininteraktioner i næsten alle organismer ved blot at ændre betingelserne i protokollens prøveforberedelsesfase. Det er vigtigt at vælge antistoffer af god kvalitet, der er specifikke og testet i enten immunhistrokemi, immunfluorescens, ELISA eller immunoprecipitationer.Begynd med at forbehandl 10-brønddiagnosticeringsdias med poly-L-lysin. Tilsæt 100 mikroliter steril og filtreret 0,0001% poly-L-lysin til hver brønd, og inkuber diasene i 30 minutter i en steril laminar flow hætte. Derefter vaskes hver brønd med 50 mikroliter sterilt vand for at fjerne overskydende poly-L-lysin.Tilføj ca. 15.000 celler pr. brønd afhængigt af celletypen, og dyrk cellerne i en steril fugtig inkubator ved 37 grader Celsius med 5 % kuldioxid til en 60 til 80%sammenløb. Efter 24 timer fjernes vækstmediet ved at placere et silkepapir på kanten af hver brønd, og cellerne vaskes tre gange med 50 mikroliter PBS. Derefter fastgør cellerne ved at tilføje 50 mikroliter frisklavet 4% paraformaldehyd i PBS til hver brønd og inkubere diaset ved stuetemperatur i 10 minutter.Efter fikseringen vaskes sliden tre gange ved at nedsænke rutsjebanen i en glidefarvningsglas med PBS. For at gennemtrænge membranerne i de tilknyttede celler nedsænkes diaset i 100 milliliter på 0,5% Triton-X100 i PBS, og inkubere cellerne i 10 minutter ved stuetemperatur. Vask derefter objektglassene tre gange i TBS-T.Efter den sidste vask fjernes overskydende buffer med et silkepapir. Vokse og fortynde S.cerevisiae celler i henhold til manuskript retninger, derefter overføre dem til en 50-milliliter centrifuge rør og pellet ved centrifugering ved 665 gange g i tre minutter. Fjern supernatanten og opsplitning af cellerne i fem milliliter frisk medium.Derefter tilsættes 550 mikroliter på 37% formaldehyd for en endelig koncentration på 4% og inkubere kulturen ved stuetemperatur i 15 minutter for at fastsætte cellerne. Efter inkubationen pellets cellerne, fjern supernatanten, og pellet i en milliliter frisklavet 4% paraformaldehyd i vaskebuffer. Inkuber cellerne ved stuetemperatur i 45 minutter.I mellemtiden forberede diagnostiske dias ved at tilføje 100 mikroliter af 0,0001% poly-L-lysin opløsning til hver brønd og inkubere dias i 30 minutter ved stuetemperatur. Vask derefter den overskydende poly-L-lysin væk med ultrarent vand og lad rutsjebanerne lufttørre. Efter inkubationstrinnet vaskes cellerne to gange med en milliliter vaskebuffer ved centrifugering.Fjern supernatanten, og opslæm cellerne i vaskebufferen igen. Pellet cellerne efter den sidste vask, og fjern supernatant og resuspend cellerne i en milliliter vask buffer indeholder 1,2 molar sorbitol. At fordøje cellevæggen, pellet cellerne igen og resuspend cellerne i 250 mikroliter af frisklavet Lyticase opløsning.Inkuber cellerne ved 30 grader Celsius i 15 minutter med let omrystning. Efter fordøjelsestrinnet vaskes cellerne tre gange i vaskebuffer og cellerne opslæven i 250 mikroliter vaskebuffer indeholdende 1,2 molar sorbitol. Tilsæt 20 mikroliter af re-suspenderet celler til hver poly-L-lysin-belagt godt, og lad de faste og permeabiliserede celler til at fastgøre i 30 minutter.Vask brøndene tre gange med 50 mikroliter af vaskebuffer for at fjerne ikke-klæbende celler, og fortsæt med nærhed ligation assay. Start nærhed ligation assay, eller PLA protokol, ved at tilføje en dråbe af blokering buffer til hver brønd og inkubere dias i et fugtigt kammer i 30 minutter ved 37 grader Celsius. Fjern blokering buffer ved at placere et silkepapir på kanten af hver brønd, og vask cellerne to gange i 100 milliliter vask buffer A.Next, tilsæt 40 mikroliter af den primære antistofopløsning til hver brønd, og inkubere diaset i 60 minutter ved 37 grader Celsius i et fugtigt kammer.Fjern den primære antistofopløsning, og vask rutsjebanerne to gange i vaskepude A.Efter vasken tilsættes 40 mikroliter af den sekundære antistofopløsning til hver brønd, og rutsjebanen inkuberes i 60 minutter ved 37 grader Celsius i et fugtigt kammer. Fjern derefter opløsningen og vask diasene to gange i vaskebuffer A.Derefter tilsættes 40 mikroliter af DNA ligation blandingen, som indeholder stikket oligonucleotides og DNA ligase, til hver brønd, og inkubere dias i det fugtige kammer ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Efter inkubation fjernes ligationsblandingen og skylles rutsjebanerne to gange med vaskepude A.Add 40 mikroliter af DNA-forstærkningsblandingen, som indeholder DNA-polymerase og fluorescerende mærkede oligonukleotider til hver brønd, og inkubere i 100 minutter i det fugtige kammer ved 37 grader Celsius.Forstærkningsblandingen fjernes, og objektglassene vaskes i 100 milliliter vaskepude B i 10 minutter pr. vask. Derefter vaskes objektglassene i 100 milliliter vaskepude B fortyndet en til 100 i ultrarent vand. Der tilsættes 20 mikroliter DAPI-holdige monteringsmedium pr. brønd.Dæk brøndene på diaset med en dæksel slip og forsegle med neglelak. Denne protokol blev med succes brugt til at overvåge forbigående chaperon forsamlinger dannet mellem forskellige J-domæne proteiner og Hsp70 chaperone og J-domæne proteiner i HeLa, S.cerevisiae, og E.coli celler. Human klasse A og klasse B J-domæne proteiner blev målrettet med meget specifikke primære antistoffer.Hver af de røde fluorescerende punktformige repræsenterer et proteinkompleks dannet mellem to forskellige J-domæne proteiner i HeLa celler. Lignende blandet klasse J-domæne protein komplekser er også observeret i encellede eukaryote S.cerevisiae, eller bagergær. Nogle af de fluorescerende punktformet genereret fra PLA var vanskeligere at løse som individuelle foci, på grund af den lille celle størrelse.Kompleks dannelse mellem klasse A og B J-domæne proteiner blev ikke observeret i E.coli celler, hvilket er i overensstemmelse med biokemiske undersøgelser udført med rensede proteiner. Men andre chaperon forsamlinger involverer J-domæne proteiner og Hsp70 chaperone blev fanget ved hjælp af PLA-protokollen. Tekniske kontroller, der manglede et primært antistof mod et af de interagerende J-domæne proteiner eller chaperoner i de ellers komplette PLA-reaktioner, viste ringe eller ingen fluorescensformation i cellerne, hvilket indikerer mangel på falsk positiv signalforstærkning.For at opnå pålidelige resultater ved hjælp af nærhed ligation assay, kontrollere på forhånd, at de anvendte antistoffer er af tilstrækkelig kvalitet. Desuden tage forholdsregler i at undgå over-fordøjelse af celler, der indeholder en cellevæg.

Research

JoVE Journal

Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Langsigtet dødelige toksicitet Test med krebsdyr Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Omprogrammering humane somatiske celler i induceret pluripotente stamceller (IPSC&#39;er) under anvendelse af retroviral vektor med GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse af mRNA molekyler under anvendelse Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effektiv Generation Menneskelige induceret pluripotente stamceller fra humane somatiske celler med Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profilering Individuelle humane embryonale stamceller ved kvantitativ RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høj opløsning Time-lapse Imaging og Automatiseret analyse af mikrotubulusdynamik i levende menneske navlestrengsveneendotelceller

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Spatiotemporal Analyse af Cytokinetic Begivenheder i Fission Gær

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Et grafisk brugergrænseflade til softwareassisteret sporing af proteinkoncentration i dynamiske cellulære protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

En simpel fluorescens-baserede Reporter analyse til at identificere cellulære komponenter kræves for Ricin toksin en kæde (RTA) handel med gær

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...