Name: in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells
Uploaded: 2019-09-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells at JoVE.com

NBN wordt ondersteund door een speciale rekruterings beurs van de Monash University faculteit geneeskunde verpleging en Gezondheidswetenschappen met financiering van de overheid van Victoria en de Australische overheid. Wij danken Bernd Bukau (ZMBH, Universiteit van Heidelberg, Duitsland) en Harm H. Kampinga (departement Biomedische Wetenschappen van cellen & systemen, Rijksuniversiteit Groningen, Nederland) voor hun onschatbare ondersteuning en het delen van reagentia, Holger Lorenz (ZMBH Imaging Facility, Universiteit van Heidelberg, Duitsland) voor zijn ondersteuning met confocale microscopie en beeldverwerking, en Claire Hirst (ARMI, Monash University, Australië) voor kritische lezing van het manuscript.

1. voorbereiding van de HeLa-cel
<ol><li>Bereid de volgende materialen voor: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM na2HPO4, 1,8 mm KH2po4), pH 7,4; DMEM, aangevuld met 10% FCS en 1% pen-Strep; 4% Paraformaldehyde in PBS; 0,5% Triton-X100 in PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,05% tween), pH 7,4; 0,0001% steriele poly-L-lysine oplossing; 10-well diagnostische dia's; een vochtige kamer; papieren zakdoekje; en Coplin glij-kleurings potten. Opmerking: Om een ...

<ol>
	<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+structural+and+mechanistic+aspects+of+Hsp70+molecular+chaperones.">Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).</li><li>Kampinga, H. H., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HSP70+chaperone+machinery:+J+proteins+as+drivers+of+functional+specificity.">The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).</li><li>Nillegoda, N. B., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+Hsp70-based+protein+disaggregases:+emergence+and+mechanisms.">Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Bracher, A., Verghese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+exchange+factors+of+Hsp70+molecular+chaperones.">The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+HSP70+co-chaperone+complex+unlocks+metazoan+protein+disaggregation.">Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation.</a> Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+an+intricate+J-protein+network+driving+protein+disaggregation+in+eukaryotes.">Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Kirstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+properties+of+the+disaggregase+function+of+J-proteins+and+Hsc70+in+Caenorhabditis+elegans+stress+and+aging.">In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging.</a> Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).</li><li>Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Disaggregation+in+multicellular+organisms.">Protein Disaggregation in multicellular organisms.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).</li><li>Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CbpA,+a+DnaJ+homolog,+is+a+DnaK+co-chaperone,+and+its+activity+is+modulated+by+CbpM.">CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).</li><li>Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+J-domain-Triggered+ATP+Hydrolysis+by+Hsp70+Chaperones.">Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones.</a> Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Benschop, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+of+core+protein+complex+compositions+for+Saccharomyces+cerevisiae.">A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).</li><li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+RNA-protein+interactions+in+situ+using+modified-MTRIPs+and+proximity+ligation.">Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).</li><li>Mocanu, M. M., V&#225;radi, T., Sz&#246;llosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+proximity+ligation+assay+(PLA).">Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA).</a> Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).</li><li>Sekar, R. B., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+microscopy+imaging+of+live+cell+protein+localizations.">Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations.</a> Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).</li><li>Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).</li><li>Nagy, P., Sz&#246;llosi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+or+no+proximity:+that+is+the+question+&#8211;+but+the+answer+is+more+complex.">Proximity or no proximity: that is the question &#8211; but the answer is more complex.</a> Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).</li><li>Hoetelmans, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acetone,+methanol,+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure,+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+fixation+protocol+for+proteome-wide+immunofluorescence+localization+studies.">A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies.</a> Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).</li><li>Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+for+immunofluorescence+suppresses+localization+of+some+integral+membrane+proteins.">Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).</li><li>Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+liberates+the+membrane+modelling+protein+Pex11beta+from+peroxisomal+membranes.">Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes.</a> Histochemistry &amp; Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).</li><li>Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+antibody+localization+of+alpha2-macroglobulin+in+membrane-limited+vesicles+in+cultured+cells.">Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).</li><li>Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+yeast+cell+wall+composition+and+structure+in+response+to+growth+conditions+and+mode+of+cultivation.">A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation.</a> Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).</li><li>Romaniuk, J. A., Cegelski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+wall+composition+and+the+influence+of+antibiotics+by+cell-wall+and+whole-cell+NMR.">Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).</li><li>Salazar, O., Asenjo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+lysis+of+microbial+cells.">Enzymatic lysis of microbial cells.</a> Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).</li><li>Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+stationary+phase+induced+by+low+oxygen+tension:+cell+wall+thickening+and+localization+of+the+16-kilodalton+alpha-crystallin+homolog.">Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog.</a> Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).</li><li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).</li></ol>

Co-immunoprecipitatie en co-lokalisatie gebaseerde benaderingen zijn gebruikt als langdurige methoden om te karakteriseren eiwit assembleert. De detectie van transitionele gevormde specifieke chaperonne-complexen is een grote uitdaging met dergelijke conventionele methoden, en als gevolg daarvan zijn eerdere bevindingen grotendeels beperkt tot kwalitatieve interpretaties. De Co-Immunoprecipitation-technieken op basis van cel lysis vereisen vaak cross-linking om eiwit-eiwit interacties te stabiliseren. Celllysis verhoogt...

Een enorme hoeveelheid genomische informatie blijft oninterpreteerbaar vanwege ons onvolledige begrip van cellulaire interactomes. Conventionele eiwit-eiwit interactie detectie methodieken zoals eiwit co-immunoprecipitatie met/zonder chemische cross-linking en eiwit co-lokalisatie, hoewel op grote schaal gebruikt, vormen een scala aan nadelen. Enkele van de belangrijkste nadelen zijn een slechte kwantificering van de interacties en de potentiële introductie van niet-inheemse bindende gebeurtenissen. Ter vergelijking, opkomende proximity-gebaseerde technieken bieden een alternatief en een krachtige aanpak voor het vastleggen van eiwit interacties in cellen. De Proximity ligatie test (PLA)1, nu beschikbaar als een gepatenteerde Kit, gebruikt antilichamen om specifiek te richten op eiwitcomplexen op basis van de nabijheid van de interagerende subeenheden.
PLA wordt geïnitieerd door de vorming van een steiger bestaande uit primaire en secundaire antilichamen met kleine DNA-Tags (PLA-sondes) op het oppervlak van het gerichte proteïne complex (Figuur 1, stappen 1-3). Vervolgens wordt, bepaald door de nabijheid van de DNA-Tags, een circulair DNA-molecuul gegenereerd via hybridisatie met connector oligonucleotiden (Figuur 1, stap 4). De vorming van het cirkelvormige DNA wordt aangevuld door een DNA-ligatie stap. Het nieuw gevormde cirkelvormige stukje DNA fungeert als een sjabloon voor de daaropvolgende Rolling Circle Amplification (RCA)-gebaseerde polymerase kettingreactie (PCR) geprimed door een van de geconjugeerde oligonucleotide-Tags. Dit genereert een enkel-streng concatemeric DNA-molecuul verbonden aan het eiwit complex via de antilichaam steiger (Figuur 1, stap 6). Het concatemeric DNA molecuul wordt gevisualiseerd met behulp van fluorescently gelabelde oligonucleotiden die hybridiseren tot meerdere unieke sequenties verspreid over het versterkte DNA (Figuur 1, stap 7)2. Het gegenereerde PLA-signaal, dat verschijnt als een fluorescerende stip (Figuur 1, stap 7), komt overeen met de locatie van het gerichte eiwit complex in de cel. Als gevolg hiervan zou de assay eiwitcomplexen met een hoge ruimtelijke nauwkeurigheid kunnen detecteren. De techniek is niet beperkt tot het simpelweg vastleggen van eiwit interacties, maar kan ook worden gebruikt om enkelvoudige moleculen of eiwit modificaties op eiwitten met hoge gevoeligheid1,2tedetecteren.
Hsp70 vormt een zeer veelzijdig chaperonne-systeem dat fundamenteel belangrijk is voor het behoud van cellulaire eiwit homeostase door deel te nemen aan een scala aan huishoudelijke en stress-geassocieerde functies. Huishoudelijke activiteiten van het Hsp70 chaperonne-systeem omvatten de Novo-eiwit vouwen, eiwit translocatie over cellulaire membranen, assemblage en demontage van eiwitcomplexen, regulering van de eiwit activiteit en het koppelen van verschillende eiwit vouwen/ machinerie voor kwaliteitscontrole3. Hetzelfde chaperonne-systeem revouwt ook verkeerd gevouwen/ongevouwen eiwitten, voorkomt eiwit aggregatie, bevordert eiwit uitsplitsing en werkt samen met cellulaire proteasen om terminaal misgevouwen/beschadigde eiwitten te degraderen om cellulaire reparatie te vergemakkelijken na proteotoxische spanningen4,5. Om deze functionele diversiteit te bereiken, vertrouwt de Hsp70 chaperonne op samenwerking tussen co-chaperones van de JDP-familie en nucleotide-uitwisselings factoren (Nef's) die de Hsp70's ATP-afhankelijke allosterische controle van substraat binding en release3verfijnen, 6. Verder spelen de co-chaperonen van het JDP een cruciale rol bij het selecteren van substraten voor dit veelzijdige chaperonne-systeem. Leden van deze familie zijn onderverdeeld in drie klassen (A, B en C) op basis van hun structurele homologie aan het prototype JDP, de E. coli dnaJ. Klasse A jdps bevatten een N-Terminal J-domein, dat samenwerkt met Hsp70, een rijke Glycine-fenylalanine regio, een substraat bindende regio bestaande uit een zink vinger-achtige regio (zflr) en twee β-Barrel domeinen, en een C-terminale door dimerisatie domein. JDPs met een N-Terminal J-domein en een rijk Glycine-fenylalanine, maar zonder de ZFLR, vallen in klasse B. In het algemeen zijn de leden van deze twee klassen betrokken bij de chaperoning-functies. Leden die vallen onder de catchall klasse C, die JDPs bevat die alleen de J-domain4delen, rekruteren Hsp70s om een verscheidenheid aan niet-chaperoning-functies uit te voeren. De belangrijke rol van JDPs als verwisselbare substraat herkenning "adaptors" van het Hsp70 systeem wordt weerspiegeld door een uitbreiding van de familieleden tijdens de evolutie. Mensen hebben bijvoorbeeld meer dan 42 verschillende JDP-leden4. Deze jdps functioneren als monomeren, homodimers en/of homo/hetero oligomeren4,5. Onlangs een functionele samenwerking via tijdelijke complexe formatie tussen klasse A (bijv. H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) en klasse B (bijv. H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) eukaryotische jdps werd gemeld ter bevordering van de efficiënte herkenning van amorfe eiwit aggregaten in vitro7,8. Deze gemengde jdp-complexen worden vermoedelijk op het oppervlak van geaggregeerde eiwitten gemonteerd om de vorming van Hsp70-en Hsp70 + Hsp100-gebaseerde eiwit disaggregassen7,8,9, 10. het kritische bewijs ter ondersteuning van het bestaan van deze transitieve gevormde gemengde jdp-complexen in eukaryote cellen was voorzien van Pla8.
PLA wordt in toenemende mate gebruikt voor het beoordelen van eiwit interacties in Metazoa, voornamelijk in zoogdiercellen. Hier rapporteren we de succesvolle uitbreiding van deze techniek om transitieve gevormde chaperonne-complexen in eukaryotische en prokaryotische unicellulaire organismen te monitoren, zoals de ontluikende gist S. cerevisiae en de bacterie E. coli. Belangrijk is dat deze uitbreiding het potentiële gebruik van PLA benadrukt bij het opsporen en analyseren van microben die menselijke en dierlijke cellen besmetten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJA2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJB1 Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-SPA-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DnaK antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mCherry antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sis1 Antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Corp</td>
			<td>COP-080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ydj1 antibody</td>
			<td>StressMarq Biosciences</td>
			<td>&#160;SMC-150,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-YFP antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin slide-staining jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnostic slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>1216530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Detection Reagents Orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P47-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>25300096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase 100T / / Lyticase</td>
			<td>United States Biological</td>
			<td>Z1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells

J-Domain proteïnen (JDPs) vormen de grootste en meest diverse co-Chaperone familie in eukaryote cellen. Uit recente bevindingen blijkt dat specifieke leden van de JDP-familie voorbijgaande heterocomplexen in eukaryoten kunnen vormen om de substraat keuze voor de 70 kDa-warmteshock proteïne (Hsp70) chaperongebaseerde eiwit disaggregassen te verfijnen. De JDP-complexen richten op acute/chronische stress geïnduceerde geaggregeerde eiwitten en helpen vermoedelijk de disaggregassen samen te stellen door meerdere Hsp70s aan het oppervlak van eiwit aggregaten te rekruteren. De omvang van het door deze fysiek werkende JDPs gevormde netwerk van eiwit kwaliteitscontrole (PQC) blijft in vivo grotendeels onkarakteriseerd. Hier beschrijven we een microscopie gebaseerde in-situ proteïne-interactie test genaamd de Proximity ligatie assay (PLA), die in staat is om deze transitieve gevormde chaperonne-complexen robuust te vangen in verschillende cellulaire compartimenten van eukaryotische cellen. Ons werk breidt de tewerkstelling van Pla uit menselijke cellen naar gist (Saccharomyces cerevisiae) en bacteriën (Escherichia coli), waardoor een belangrijk instrument om de dynamiek van tijdelijk gevormde eiwit assemblages in beide prokaryotische en eukaryote cellen.

Uit onze eerdere in vitro studies met gezuiverde eiwitten bleek dat een subset van menselijke klasse A en klasse B JDPs tijdelijke gemengde JDP-complexen vormen om efficiënt een breed scala van geaggregeerde eiwitten te targeten en mogelijk de assemblage van Hsp70-gebaseerde eiwit disaggregassen7. We hebben PLA gebruikt om te bepalen of gemengde klasse (A + B) JDP-complexen voorkomen in menselijke baarmoederhalskanker cellen (HeLa). Human JDPs DNAJA2 (klasse A) en DNAJB1 (klasse B) waren gericht ...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells at JoVE.com

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

Cognate J-Domain eiwitten werken samen met de Hsp70 chaperonne om te helpen bij een groot aantal biologische processen, variërend van eiwit vouwen tot afbraak. Hier beschrijven we een in-situ proximity ligatie test, die het mogelijk maakt om deze transitieve gevormde chaperonne machinerie in bacteriële, gist en menselijke cellen te monitoren.

In situ monitoring van transitieve gevormde moleculaire Chaperone-assemblages in bacteriën, gist en menselijke cellen

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Deze methode vangt voorbijgaande eiwit interacties in organismen zoals bacteriën en gist en in verschillende celtypes. Hier monitoren we tijdelijk gevormde specifieke chaperonnecomplexen die betrokken zijn bij cellulaire proteostase. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om informatie te genereren over dynamiek en subcellulaire lokalisatie van eiwitassemblages in prokaryotische en eukaryotische cellen.Aanpassingen van deze techniek in eencellige organismen zoals bacteriën en gist, stelt onderzoekers in staat om het te gebruiken als een krachtig hulpmiddel om ziekten in verband met microbiële infecties te onderzoeken. Deze techniek kan mogelijk worden gebruikt om eiwitinteracties in bijna alle organismen te analyseren door simpelweg de omstandigheden in de monsterbereidingsfase van het protocol te veranderen. Het is belangrijk om antilichamen van goede kwaliteit te selecteren die specifiek zijn en getest in immunohistochemie, immunofluorescentie, ELISA of immunoprecipitaties.Begin met het voorbehandelen van 10-goed diagnostische dia's met poly-L-Lysine. Voeg 100 microliter steriele en gefilterde 0,0001%poly-L-L-Lysine toe aan elke put en ontcubeer de glijbanen gedurende 30 minuten in een steriele laminaire stroomkap. Was vervolgens elke put met 50 microliter steriel water om overtollig poly-L-Lysine te verwijderen.Voeg ongeveer 15.000 cellen per put, afhankelijk van het celtype, en groeien de cellen in een steriele vochtige incubator op 37 graden Celsius met 5%kooldioxide tot een 60 tot 80%samenvloeiing. Na 24 uur, verwijder het groeimedium door het plaatsen van een tissue papier aan de rand van elke put, en was de cellen drie keer met 50 microliters van PBS. Bevestig vervolgens de cellen door 50 microliter vers bereide 4%-paraformaldehyde in PBS toe te voegen aan elke put en de glijbaan gedurende 10 minuten op kamertemperatuur uit te broeden.Na fixatie was je de glijbaan drie keer door de schuif in een schuifkleuringspot met PBS onder te dompelen. Om de membranen van de aangesloten cellen te doordrenken, dompelt u de dia onder in 100 milliliter van 0,5%Triton-X100 in PBS en ontcubeer de cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was dan de glijbanen drie keer in TBS-T.Verwijder na de laatste wasbeurt overtollige buffer met een tissuepapier. Groeien en verdunen S.cerevisiae cellen volgens manuscript richtingen, dan breng ze naar een 50-milliliter centrifuge buis en pellet door centrifugatie op 665 keer g gedurende drie minuten. Verwijder de supernatant en resuspend de cellen in vijf milliliter vers medium.Voeg vervolgens 550 microliter van 37% formaldehyde toe voor een uiteindelijke concentratie van 4%en broed de cultuur 15 minuten lang bij kamertemperatuur om de cellen te fixeren. Na de incubatie, pellet de cellen, verwijder de supernatant, en resuspend de pellet in een milliliter vers bereide 4%paraformaldehyde in wasbuffer. Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.Bereid ondertussen de diagnostische dia's voor door 100 microliters van 0,0001%poly-L-Lysine-oplossing toe te voegen aan elke put en de dia's 30 minuten bij kamertemperatuur uit te broeden. Was vervolgens de overtollige poly-L-Lysine weg met ultrazuiver water en laat de glijbanen luchtdrogen. Na de incubatiestap, was de cellen twee maal met een milliliter wasbuffer door centrifugatie.Verwijder de supernatant en resuspend de cellen in wasbuffer. Pellet de cellen na de laatste wasbeurt, en verwijder de supernatant en resuspend de cellen in een milliliter wasbuffer met 1,2 molar sorbitol. Om de celwand te verteren, pellet de cellen opnieuw en resuspend de cellen in 250 microliters van vers bereide Lyticase oplossing.Incubeer de cellen op 30 graden Celsius gedurende 15 minuten met zachte schudden. Na de spijsverteringsstap, was de cellen drie keer in wasbuffer en resuspend de cellen in 250 microliters van wasbuffer met 1.2 molar sorbitol. Voeg 20 microliter van opnieuw opgehangen cellen toe aan elke poly-L-Lysine-gecoate put en laat de vaste en permeabiliseerde cellen gedurende 30 minuten hechten.Was de putten drie keer met 50 microliters wasbuffer om niet-aanhangende cellen te verwijderen en ga verder met de nabijheid ligatie test. Start de nabijheid ligatie test, of PLA protocol, door het toevoegen van een druppel van de blokkering buffer aan elke put en broeden de dia in een vochtige kamer gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius. Verwijder de blokkeerbuffer door een tissuepapier aan de rand van elke put te plaatsen en was de cellen twee keer in 100 milliliter wasbuffer A.Next, voeg 40 microliters van de primaire antilichaamoplossing toe aan elke put en ontcubeer de glijbaan gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius in een vochtige kamer.Verwijder de primaire antilichaamoplossing en was de glijbanen twee maal in wasbuffer A.Voeg na de was 40 microliter van de secundaire antilichaamoplossing toe aan elke put en broed de glijbaan gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius in een vochtige kamer. Verwijder vervolgens de oplossing en was de dia's twee keer in wasbuffer A.Voeg vervolgens 40 microliters van het DNA-ligatiemengsel toe dat de connector oligonucleotiden en DNA-ligase bevat, aan elke put, en broed de dia in de vochtige kamer gedurende 30 minuten uit. Na incubatie, verwijder de ligatie mengsel en was de dia's twee maal met wasbuffer A.Add 40 microliters van DNA-versterking mengsel dat de DNA polymerase en de fluorescerende gelabeld oligonucleotiden bevat om elk goed, en incubeer gedurende 100 minuten in de vochtige kamer op 37 graden Celsius.Verwijder het versterkingsmengsel en was de glijbanen in 100 milliliter wasbuffer B gedurende 10 minuten per wasbeurt. Was vervolgens de glijbanen in 100 milliliter wasbuffer B verdund een tot 100 in ultrazuiver water. Voeg 20 microliters dapi-bevattend montagemedium per put toe.Bedek de putten van de glijbaan met een deklip en sluit af met nagellak. Dit protocol werd met succes gebruikt om tijdelijke chaperonneassemblages te controleren die tussen verschillende J-domeinproteïnen en Hsp70 chaperonne en j-domeinproteïnen in hela, S.cerevisiae, en cellen E.coli worden gevormd. Menselijke klasse A en klasse B J-domein eiwitten waren gericht met zeer specifieke primaire antilichamen.Elk van de rode fluorescerende puncti vertegenwoordigt een eiwitcomplex gevormd tussen twee verschillende J-domein eiwitten in HeLa cellen. Soortgelijke gemengde klasse J-domein eiwit complexen worden ook waargenomen in de eencellige eukaryote S.cerevisiae, of bakkersgist. Sommige van de fluorescerende puncti gegenereerd uit PLA waren moeilijker op te lossen als individuele foci, als gevolg van de kleine cel grootte.Complexe vorming tussen klasse A en B J-domein eiwitten werden niet waargenomen in E.coli cellen, wat overeenkomt met biochemische studies uitgevoerd met gezuiverde eiwitten. Maar andere chaperonne assemblages waarbij J-domein eiwitten en de Hsp70 chaperonne werden gevangen met behulp van de PLA protocol. Technische controles ontbreekt een primaire antilichaam tegen een van de interagerende J-domein eiwitten of chaperonnes in de anders complete PLA reacties toonden weinig of geen fluorescentie puncti vorming in de cellen, wat wijst op een gebrek aan vals-positieve signaal versterking.Om betrouwbare resultaten te verkrijgen met behulp van de nabijheid ligatie test, controleer vooraf of de gebruikte antilichamen van voldoende kwaliteit zijn. Bovendien, neem voorzorgsmaatregelen bij het vermijden van oververtering van cellen met een celwand.

Research

JoVE Journal

Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Lange-termijn Lethal toxiciteit Test met de Schaal- Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

Herprogrammeren menselijke somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Met behulp van retrovirale vector met GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profilering Individuele menselijke embryonale stamcellen door kwantitatieve RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Spatiotemporele analyse van Cytokinetic Evenementen in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Een grafische gebruikersinterface voor software-assisted tracking van eiwitconcentratie in dynamische cellulaire protrusies

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

Een eenvoudige fluorescentie gebaseerde verslaggever Assay identificatie van cellulaire bestanddelen die nodig zijn voor ricine toxine een keten (RTA) handel in gist

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...