Name: in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells
Uploaded: 2019-09-02T15:00:00
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NBN wird durch einen speziellen Recruitment Grant der Monash University Faculty of Medicine Nursing and Health Sciences mit Finanzieller Unterstützung der Regierung von Victoria und der australischen Regierung unterstützt. Wir danken Bernd Bukau (ZMBH, Universität Heidelberg, Deutschland) und Harm H. Kampinga (Abteilung für Biomedizinische Wissenschaften von Zellen & Systemen, Universität Groningen, Niederlande) für ihre unschätzbare Unterstützung und den Austausch von Reagenzien, Holger Lorenz (ZMBH Imaging Facility, Universität Heidelberg, Deutschland) für seine Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie und Bildverarbeitung und Claire Hirst (ARMI, Monash University, Australien) für die kritische Lektüre des Manuskripts.

1. Hela Zellvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie folgende Materialien vor: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4), pH 7.4; DMEM, ergänzt durch 10% FCS und 1% Pen-Strep; 4% Paraformaldehyd in PBS; 0,5% Triton-X100 in PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,05% Tween), pH 7,4; 0,0001% sterile Poly-L-Lysin-Lösung; 10-Well-Diagnose-Dias; eine feuchte Kammer; Tissuepapier; und Coplin-Dia-Färbegläser. HINWEIS: Um eine optimale Fixationseffiz...

<ol>
	<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+structural+and+mechanistic+aspects+of+Hsp70+molecular+chaperones.">Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).</li><li>Kampinga, H. H., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HSP70+chaperone+machinery:+J+proteins+as+drivers+of+functional+specificity.">The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).</li><li>Nillegoda, N. B., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+Hsp70-based+protein+disaggregases:+emergence+and+mechanisms.">Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Bracher, A., Verghese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+exchange+factors+of+Hsp70+molecular+chaperones.">The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+HSP70+co-chaperone+complex+unlocks+metazoan+protein+disaggregation.">Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation.</a> Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+an+intricate+J-protein+network+driving+protein+disaggregation+in+eukaryotes.">Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Kirstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+properties+of+the+disaggregase+function+of+J-proteins+and+Hsc70+in+Caenorhabditis+elegans+stress+and+aging.">In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging.</a> Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).</li><li>Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Disaggregation+in+multicellular+organisms.">Protein Disaggregation in multicellular organisms.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).</li><li>Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CbpA,+a+DnaJ+homolog,+is+a+DnaK+co-chaperone,+and+its+activity+is+modulated+by+CbpM.">CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).</li><li>Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+J-domain-Triggered+ATP+Hydrolysis+by+Hsp70+Chaperones.">Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones.</a> Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Benschop, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+of+core+protein+complex+compositions+for+Saccharomyces+cerevisiae.">A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).</li><li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+RNA-protein+interactions+in+situ+using+modified-MTRIPs+and+proximity+ligation.">Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).</li><li>Mocanu, M. M., V&#225;radi, T., Sz&#246;llosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+proximity+ligation+assay+(PLA).">Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA).</a> Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).</li><li>Sekar, R. B., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+microscopy+imaging+of+live+cell+protein+localizations.">Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations.</a> Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).</li><li>Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).</li><li>Nagy, P., Sz&#246;llosi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+or+no+proximity:+that+is+the+question+&#8211;+but+the+answer+is+more+complex.">Proximity or no proximity: that is the question &#8211; but the answer is more complex.</a> Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).</li><li>Hoetelmans, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acetone,+methanol,+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure,+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+fixation+protocol+for+proteome-wide+immunofluorescence+localization+studies.">A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies.</a> Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).</li><li>Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+for+immunofluorescence+suppresses+localization+of+some+integral+membrane+proteins.">Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).</li><li>Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+liberates+the+membrane+modelling+protein+Pex11beta+from+peroxisomal+membranes.">Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes.</a> Histochemistry &amp; Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).</li><li>Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+antibody+localization+of+alpha2-macroglobulin+in+membrane-limited+vesicles+in+cultured+cells.">Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).</li><li>Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+yeast+cell+wall+composition+and+structure+in+response+to+growth+conditions+and+mode+of+cultivation.">A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation.</a> Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).</li><li>Romaniuk, J. A., Cegelski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+wall+composition+and+the+influence+of+antibiotics+by+cell-wall+and+whole-cell+NMR.">Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).</li><li>Salazar, O., Asenjo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+lysis+of+microbial+cells.">Enzymatic lysis of microbial cells.</a> Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).</li><li>Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+stationary+phase+induced+by+low+oxygen+tension:+cell+wall+thickening+and+localization+of+the+16-kilodalton+alpha-crystallin+homolog.">Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog.</a> Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).</li><li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).</li></ol>

Co-Immunpräzipitation und co-localization basierte Ansätze wurden als langjährige Methoden zur Charakterisierung von Protein-Assembls verwendet. Der Nachweis von transient gebildeten spezifischen Chaperonkomplexen stellt bei solchen konventionellen Methoden eine große Herausforderung dar, so dass sich frühere Erkenntnisse weitgehend auf qualitative Interpretationen beschränken. Die Zelllyse-basierten Co-Immunpräzipitierstit-Techniken erfordern oft eine Vernetzung, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu stabilisier...

Eine große Menge an genomischen Informationen bleibt aufgrund unseres unvollständigen Verständnisses von zellulären Interomen nicht interpretierbar. Herkömmliche Methoden zur Erkennung von Protein-Protein-Wechselwirkungen wie Protein-Co-Immunpräzipitation mit/ohne chemischer Vernetzung und Protein-Co-Lokalisierung stellen, obwohl weit verbreitet, eine Reihe von Nachteilen dar. Zu den Hauptnachteilen zählen eine schlechte Quantifizierung der Wechselwirkungen und die mögliche Einführung nicht nativer Bindungsereignisse. Im Vergleich dazu bieten neu entstehende, auf DerNähe basierende Techniken eine Alternative und einen leistungsstarken Ansatz zur Erfassung von Proteininteraktionen in Zellen. Der Proximity Ligation Assay (PLA)1, der jetzt als proprietäres Kit erhältlich ist, verwendet Antikörper, um speziell auf Proteinkomplexe zu zielen, die auf der Nähe der interagierenden Untereinheiten basieren.
PLA wird durch die Bildung eines Gerüstes initiiert, das aus primären und sekundären Antikörpern mit kleinen DNA-Tags (PLA-Sonden) auf der Oberfläche des Zielproteinkomplexes besteht (Abbildung 1, Schritte 1-3). Als nächstes wird, bestimmt durch die Nähe der DNA-Tags, ein kreisförmiges DNA-Molekül durch Hybridisierung mit Konnekleotiden erzeugt (Abbildung1, Schritt 4). Die Bildung der kreisförmigen DNA wird durch einen DNA-Ligationsschritt abgeschlossen. Das neu gebildete kreisförmige DNA-Stück dient als Vorlage für die anschließende Rolling Circle Amplification (RCA)-basierte Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die durch eine der konjugierten Oligonukleotid-Tags grundiert ist. Dadurch entsteht ein einsträngiges konsoterisches DNA-Molekül, das über das Antikörpergerüst am Proteinkomplex befestigt ist (Abbildung1, Schritt 6). Das konthetomere DNA-Molekül wird mit fluoreszierend markierten Oligonukleotiden visualisiert, die zu mehreren einzigartigen Sequenzen hybridisieren, die über die verstärkte DNA verstreut sind (Abbildung 1, Schritt 7)2. Das erzeugte PLA-Signal, das als fluoreszierender Punkt erscheint (Abbildung1, Schritt 7), entspricht der Position des Zielproteinkomplexes in der Zelle. Dadurch konnte der Assay Proteinkomplexe mit hoher räumlicher Genauigkeit erkennen. Die Technik beschränkt sich nicht nur auf die einfache Erfassung von Protein-Wechselwirkungen, sondern könnte auch verwendet werden, um einzelne Moleküle oder Proteinmodifikationen an Proteinen mit hoher Empfindlichkeit zu erkennen1,2.
Hsp70 bildet ein äußerst vielseitiges Chaperonsystem, das für die Aufrechterhaltung der zellulären Proteinhomöostase von grundlegender Bedeutung ist, indem es an einer Reihe von Haushaltsführung und stressassoziierten Funktionen teilnimmt. Zu den Housekeeping-Aktivitäten des Hsp70-Chaperon-Systems gehören de novo Proteinfaltung, Proteintranslokation über Zellmembranen, Montage und Demontage von Proteinkomplexen, Regulierung der Proteinaktivität und Verknüpfung verschiedener Proteinfaltung/ Qualitätskontrollmaschinen3. Das gleiche Chaperonsystem faltet auch falsch gefaltete/entfaltete Proteine neu, verhindert die Proteinaggregation, fördert die Proteindisaggregation und kooperiert mit zellulären Proteasen, um endlos falsch gefaltete/geschädigte Proteine zu degradieren, um die Zellreparatur nach proteotoxische Belastungen4,5. Um diese funktionale Vielfalt zu erreichen, setzt der Hsp70-Chaperon auf Partner-Chaperones der JDP-Familie und Nukleotid-Austauschfaktoren (NEFs), die die ATP-abhängige allosterische Kontrolle der Substratbindung und -freisetzung3, 6. Darüber hinaus spielen die JDP-Chaperones eine entscheidende Rolle bei der Auswahl von Substraten für dieses vielseitige Chaperon-System. Die Mitglieder dieser Familie sind in drei Klassen (A, B und C) unterteilt, basierend auf ihrer strukturellen Homologie zum Prototyp JDP, dem E. coli DnaJ. JDPs der Klasse A enthalten eine N-Terminal-J-Domäne, die mit Hsp70 interagiert, einer glyin-phenylalaninreichen Region, einer Substratbindungsregion, die aus einer Zinkfinger-ähnlichen Region (ZFLR) und zwei -barrel-Domänen besteht, und einer C-Terminal-Dimerisierungsdomäne. JDPs mit einer N-terminalen J-Domäne und einer glycin-phenylalaninreichen Region, aber ohne ZFLR, fallen in die Klasse B. Im Allgemeinen sind die Mitglieder dieser beiden Klassen an der Begleitung von Funktionen beteiligt. Mitglieder, die unter die Catchall-Klasse C fallen, die JDPs enthält, die nur die J-Domain4gemeinsam nutzen, rekrutieren Hsp70s, um eine Vielzahl von Nicht-Chaperoning-Funktionen auszuführen. Die wichtige Rolle von JDPs als austauschbare Substraterkennungs-"Adaptoren" des Hsp70-Systems spiegelt sich in einer Erweiterung der Familienmitglieder während der Evolution wider. Zum Beispiel haben Menschen über 42 verschiedene JDP-Mitglieder4. Diese JDPs fungieren als Monomere, Homodimere und/oder Homo/Hetero-Oligomere4,5. Kürzlich eine funktionale Zusammenarbeit durch vorübergehende komplexe Bildung zwischen Klasse A (z.B. H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) und Klasse B (z. B. H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) eukaryotische JDPs wurde berichtet, um eine effiziente Erkennung von amorphen Proteinaggregaten in vitro zu fördern7,8. Diese JDP-Komplexe der gemischten Klasse versammeln sich vermutlich auf der Oberfläche aggregierter Proteine, um die Bildung von Hsp70- und Hsp70+Hsp100-basierten Protein-Disaggregasen7,8,9, 10. Die kritischen Beweise für die Existenz dieser vorübergehend gebildeten JDP-Komplexe der gemischten Klasse in eukaryotischen Zellen wurden mit PLA8geliefert.
PLA wird zunehmend zur Bewertung von Proteinwechselwirkungen in Metazoen, vor allem in Säugetierzellen, eingesetzt. Hier berichten wir über die erfolgreiche Erweiterung dieser Technik zur Überwachung vorübergehend gebildeter Chaperonkomplexe in eukaryotischen und prokaryotischen einzelligen Organismen wie der angehenden Hefe S. cerevisiae und dem Bakterium E. coli. Wichtig ist, dass diese Erweiterung den potenziellen Einsatz von PLA bei der Erkennung und Analyse von Mikroben hervorhebt, die menschliche und tierische Zellen infizieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJA2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJB1 Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-SPA-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DnaK antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mCherry antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sis1 Antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Corp</td>
			<td>COP-080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ydj1 antibody</td>
			<td>StressMarq Biosciences</td>
			<td>&#160;SMC-150,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-YFP antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin slide-staining jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnostic slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>1216530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Detection Reagents Orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P47-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>25300096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase 100T / / Lyticase</td>
			<td>United States Biological</td>
			<td>Z1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells

J-Domain-Proteine (JDPs) bilden die größte und vielfältigste Co-Chaperone-Familie in eukaryotischen Zellen. Jüngste Ergebnisse zeigen, dass bestimmte Mitglieder der JDP-Familie vorübergehende Heterokomplexe in Eukaryoten bilden könnten, um die Substratauswahl für das 70 kDa-Wärmeschockprotein (Hsp70) auf Chaperon-Basis zu optimieren. Die JDP-Komplexe zielen auf akute/chronische stressinduzierte aggregierte Proteine ab und helfen vermutlich, die Disaggregasen zusammenzusetzen, indem sie mehrere Hsp70s an die Oberfläche von Proteinaggregaten rekrutieren. Das Ausmaß des Proteinqualitätskontrollnetzwerks (PQC), das durch diese physikalisch interagierenden JDPs gebildet wird, bleibt in vivo weitgehend uncharakterisiert. Hier beschreiben wir einen mikroskopiebasierten In-situ-Protein-Interaktionstest namens Proximity Ligation Assay (PLA), der in der Lage ist, diese transient gebildeten Chaperonkomplexe in verschiedenen zellulären Kompartimenten eukaryotischer Zellen robust einzufangen. Unsere Arbeit erweitert den Einsatz von PLA von menschlichen Zellen auf Hefe (Saccharomyces cerevisiae) und Bakterien (Escherichia coli), wodurch ein wichtiges Werkzeug zur Überwachung der Dynamik von transient gebildeten Protein-Baugruppen in beiden prokaryotischen und eukaryotischen Zellen.

Unsere früheren In-vitro-Studien mit gereinigten Proteinen zeigten, dass eine Teilmenge der JDPs der menschlichen Klasse A und B transiente JDP-Komplexe der gemischten Klasse bildet, um effizient auf eine breite Palette aggregierter Proteine zu zielen und möglicherweise die Montage von Hsp70-basierten Protein-Disaggregasen7. Wir verwendeten PLA, um festzustellen, ob JDP-Komplexe der gemischten Klasse (A+B) in menschlichen Gebärmutterhalskrebszellen (HeLa) vorkommen. Menschliche JDPs DNAJA2 (Kla...

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In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

Cognate J-Domain-Proteine arbeiten mit dem Hsp70-Chaperon zusammen, um eine Vielzahl biologischer Prozesse zu unterstützen, die von der Proteinfaltung bis zum Abbau reichen. Hier beschreiben wir einen in situ-Näheligationstest, der die Überwachung dieser vorübergehend gebildeten Chaperon-Maschinen in Bakterien-, Hefe- und menschlichen Zellen ermöglicht.

In Situ-Überwachung von transient gebildeten molekularen Chaperon-Baugruppen in Bakterien, Hefe und menschlichen Zellen

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Diese Methode erfasst transiente Proteinwechselwirkungen in Organismen wie Bakterien und Hefe und in verschiedenen Zelltypen. Hier überwachen wir vorübergehend gebildete spezifische Chaperonkomplexe, die an zellulärer Proteostase beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, Informationen über Dynamik und subzelluläre Lokalisierung von Proteinassemblys in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen zu generieren.Anpassungen dieser Technik in einzelligen Organismen wie Bakterien und Hefe, ermöglicht es Forschern, es als ein leistungsfähiges Werkzeug zu verwenden, um Krankheiten im Zusammenhang mit mikrobiellen Infektionen zu untersuchen. Diese Technik könnte möglicherweise verwendet werden, um Protein-Wechselwirkungen in fast allen Organismen zu analysieren, indem einfach die Bedingungen in der Probenvorbereitungsphase des Protokolls geändert werden. Es ist wichtig, qualitativ hochwertige Antikörper auszuwählen, die spezifisch sind und entweder in Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, ELISA oder Immunpräzipitänglichkeit getestet werden.Beginnen Sie mit der Vorbehandlung von 10-Well-Diagnosedias mit Poly-L-Lysin. Fügen Sie 100 Mikroliter sterilund gefiltert 0,0001%Poly-L-Lysin zu jedem Brunnen hinzu und bebrüten die Dias 30 Minuten lang in einer sterilen laminaren Durchflusshaube. Dann waschen Sie jeden Brunnen mit 50 Mikroliter sterilem Wasser, um überschüssiges Poly-L-Lysin zu entfernen.Fügen Sie je nach Zelltyp etwa 15 000 Zellen pro Brunnen hinzu und wachsen Sie die Zellen in einem sterilen Feuchtbrutschrank bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid zu einer Konfluenz von 60 bis 80 %. Nach 24 Stunden entfernen Sie das Wachstumsmedium, indem Sie ein Gewebepapier am Rand jedes Brunnens platzieren, und waschen Sie die Zellen dreimal mit 50 Mikroliter PBS. Dann fixieren Sie die Zellen, indem Sie 50 Mikroliter frisch zubereitetes 4%Paraformaldehyd in PBS zu jedem Brunnen hinzufügen und die Rutsche bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubieren.Waschen Sie die Folie nach der Fixierung dreimal, indem Sie die Folie in ein Schiebeglasmiten mit PBS eintauchen. Um die Membranen der angeschlossenen Zellen zu durchdringen, tauchen Sie das Dia in 100 Milliliter 0,5%Triton-X100 in PBS ein und inkubieren Sie die Zellen für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Dias dreimal in TBS-T.Nach der letzten Wäsche den überschüssigen Puffer mit einem Tissuepapier entfernen. S.cerevisiae-Zellen nach Manuskriptanweisungen wachsen und verdünnen, dann drei Minuten lang in ein 50-Milliliter-Zentrifugenrohr und Pellet durch Zentrifugation bei 665-fachm g übertragen. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in fünf Milliliter frischem Medium wieder aus.Dann 550 Mikroliter 37%Formaldehyd für eine Endkonzentration von 4% hinzufügen und die Kultur bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubieren, um die Zellen zu fixieren. Nach der Inkubation die Zellen pellet, den Überstand entfernen und das Pellet in einem Milliliter frisch zubereitetem 4%Paraformaldehyd im Waschpuffer wieder aufhängen. Inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 45 Minuten.Bereiten Sie die Diagnosefolien vor, indem Sie 100 Mikroliter 0,0001%Poly-L-Lysin-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen und die Dias 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann das überschüssige Poly-L-Lysin mit Reinstwasser wegwaschen und die Dias lufttrocknen lassen. Waschen Sie die Zellen nach dem Inkubationsschritt zweimal mit einem Milliliter Waschpuffer durch Zentrifugation.Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen im Waschpuffer wieder auf. Pellet die Zellen nach der letzten Wäsche, und entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Waschpuffer enthält 1,2 Molaren-Sorbitol. Um die Zellwand zu verdauen, pellet die Zellen wieder und suspendieren sie die Zellen in 250 Mikroliter frisch zubereiteter Lyticase-Lösung.Inkubieren Sie die Zellen bei 30 Grad Celsius für 15 Minuten mit sanftem Schütteln. Nach dem Verdauungsschritt die Zellen dreimal im Waschpuffer waschen und die Zellen in 250 Mikroliter Waschpuffer mit 1,2 Molarensorbitol wieder aufhängen. Fügen Sie jedem poly-L-Lysin-beschichteten Brunnen 20 Mikroliter re-suspended-Zellen hinzu und lassen Sie die festen und permeabilisierten Zellen 30 Minuten lang anheften.Waschen Sie die Brunnen dreimal mit 50 Mikroliter Waschpuffer, um nicht-haftende Zellen zu entfernen, und gehen Sie mit der Nähe Ligation Assay. Initiieren Sie den Proximity Ligation Assay oder PLA-Protokoll, indem Sie jedem Bohrloch einen Tropfen des Sperrpuffers hinzufügen und die Rutsche in einer feuchten Kammer 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie den Sperrpuffer, indem Sie ein Tissuepapier am Rand jedes Brunnens platzieren, und waschen Sie die Zellen zweimal in 100 Milliliter Waschpuffer A. Nächster, fügen Sie 40 Mikroliter der primären Antikörperlösung zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Rutsche für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Kammer.Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Dias zweimal im Waschpuffer A. Nach dem Waschen 40 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung zu jedem Brunnen hinzufügen und das Dia 60 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Kammer bebrüten. Dann entfernen Sie die Lösung und waschen Sie die Dias zweimal in Waschpuffer A.Dann fügen Sie 40 Mikroliter der DNA-Ligationsmischung, die den Stecker Oligonukleotide und DNA-Ligase enthält, zu jedem Brunnen, und inkubieren Sie die Rutsche in der feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Nach der Inkubation die Ligationsmischung entfernen und die Dias zweimal mit Waschpuffer A.Add 40 Mikroliter DNA-Verstärkungsmischung waschen, die die DNA-Polymerase und die fluoreszierend markierten Oligonukleotide zu jedem Brunnen enthält, und 100 Minuten in der feuchten Kammer bei 37 Grad Celsius brüten.Entfernen Sie die Amplifikationsmischung und waschen Sie die Dias in 100 Milliliter Waschpuffer B für 10 Minuten pro Waschgang. Dann waschen Sie die Dias in 100 Milliliter Waschpuffer B verdünnt ein bis 100 in Reinstwasser. Fügen Sie 20 Mikroliter DAPI-haltiges Montagemedium pro Bohrgut hinzu.Bedecken Sie die Brunnen der Rutsche mit einem Deckelschlupf und Versiegelung mit Nagellack. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um transiente Chaperon-Assemblys zu überwachen, die zwischen verschiedenen J-Domänenproteinen und Hsp70-Chaperon- und J-Domänenproteinen in HeLa-, S.cerevisiae- und E.coli-Zellen gebildet wurden. Menschliche Proteine der Klasse A und der Klasse B J-Domain wurden mit hochspezifischen Primärantikörpern ins Visier genommen.Jeder der roten fluoreszierenden Puncti stellt einen Proteinkomplex dar, der zwischen zwei unterschiedlichen J-Domänenproteinen in HeLa-Zellen gebildet wird. Ähnliche gemischte J-Domain-Proteinkomplexe werden auch in der einzelligen Eukaryote S.cerevisiae, oder Bäckerhefe beobachtet. Einige der von PLA erzeugten fluoreszierenden Puncti waren aufgrund der geringen Zellgröße schwieriger als einzelne Brennpunkte zu lösen.Komplexe Bildung zwischen Klasse A und B J-Domänenproteinen wurde in E.coli-Zellen nicht beobachtet, was mit biochemischen Studien mit gereinigten Proteinen übereinstimmt. Aber andere Chaperon-Assemblys mit J-Domain-Proteinen und dem Hsp70-Chaperon wurden mit dem PLA-Protokoll erfasst. Technische Kontrollen ohne primärer Antikörper gegen eines der interagierenden J-Domänenproteine oder Chaperone in den ansonsten vollständigen PLA-Reaktionen zeigten in den Zellen wenig oder keine Fluoreszenz-Punkti-Bildung, was auf einen Mangel an falsch positiver Signalverstärkung hindeutet.Um zuverlässige Ergebnisse mit dem Näherungsligationstest zu erhalten, überprüfen Sie vorab, ob die verwendeten Antikörper von ausreichender Qualität sind. Darüber hinaus vorsichtshalber, um eine Überverdauung von Zellen zu vermeiden, die eine Zellwand enthalten.

Research

JoVE Journal

Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

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Forschung

Biologie

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

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Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

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Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

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Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

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A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

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Ein einfache Fluoreszenz basierende Reporter Assay zelluläre Komponenten identifizieren erforderlich für Ricin Toxin eine Kette (RTA) Handel mit Hefe

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...