Name: in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells
Uploaded: 2019-09-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells at JoVE.com

NBN נתמך על ידי מענק גיוס מיוחד של אוניברסיטת מונש הפקולטה לרפואת סיעוד ומדעי הבריאות עם מימון של ממשלת המדינה של ויקטוריה והממשלה האוסטרלית. אנו מודים Bernd בוקובזה (ZMBH, אוניברסיטת היידלברג, גרמניה) ופגע H. Kampinga (המחלקה למדעים ביו-רפואיים של תאים & מערכות, אוניברסיטת חרונינגן, הולנד) על תמיכה יסולא בפז שלהם שיתוף של ריאגנטים, הולגר לורנץ (ZMBH מתקן הדמיה, אוניברסיטת היידלברג, גרמניה) על תמיכתו במיקרוסקופיה ועיבוד תמונה, וקלייר הירסט (ARMI, אוניברסיטת מונש, אוסטרליה) לקריאה קריטית של כתב היד.

1. הכנה לתאי הלה
<ol><li>הכינו את החומרים הבאים: PBS (137 מ"מ, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ2hpo4, 1.8 mm KH2PO4), pH 7.4; DMEM, בתוספת עם 10% FCS ו 1% עט-דלקת; 4% פאראמפורמלדהיד ב-PBS; 0.5% טריטון-X100 בערוץ הPBS; TBS-T (150 מ"מ היאl, 20 מ"מ טריס, 0.05% רצף), pH 7.4; 0.0001% פתרון פולי-ל-ליזין סטרילי; 10-היטב שקופיות אבחון; תא לח; נייר טישו; וצ...

<ol>
	<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+structural+and+mechanistic+aspects+of+Hsp70+molecular+chaperones.">Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).</li><li>Kampinga, H. H., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HSP70+chaperone+machinery:+J+proteins+as+drivers+of+functional+specificity.">The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).</li><li>Nillegoda, N. B., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+Hsp70-based+protein+disaggregases:+emergence+and+mechanisms.">Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Bracher, A., Verghese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+exchange+factors+of+Hsp70+molecular+chaperones.">The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+HSP70+co-chaperone+complex+unlocks+metazoan+protein+disaggregation.">Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation.</a> Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+an+intricate+J-protein+network+driving+protein+disaggregation+in+eukaryotes.">Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Kirstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+properties+of+the+disaggregase+function+of+J-proteins+and+Hsc70+in+Caenorhabditis+elegans+stress+and+aging.">In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging.</a> Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).</li><li>Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Disaggregation+in+multicellular+organisms.">Protein Disaggregation in multicellular organisms.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).</li><li>Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CbpA,+a+DnaJ+homolog,+is+a+DnaK+co-chaperone,+and+its+activity+is+modulated+by+CbpM.">CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).</li><li>Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+J-domain-Triggered+ATP+Hydrolysis+by+Hsp70+Chaperones.">Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones.</a> Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Benschop, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+of+core+protein+complex+compositions+for+Saccharomyces+cerevisiae.">A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).</li><li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+RNA-protein+interactions+in+situ+using+modified-MTRIPs+and+proximity+ligation.">Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).</li><li>Mocanu, M. M., V&#225;radi, T., Sz&#246;llosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+proximity+ligation+assay+(PLA).">Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA).</a> Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).</li><li>Sekar, R. B., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+microscopy+imaging+of+live+cell+protein+localizations.">Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations.</a> Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).</li><li>Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).</li><li>Nagy, P., Sz&#246;llosi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+or+no+proximity:+that+is+the+question+&#8211;+but+the+answer+is+more+complex.">Proximity or no proximity: that is the question &#8211; but the answer is more complex.</a> Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).</li><li>Hoetelmans, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acetone,+methanol,+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure,+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+fixation+protocol+for+proteome-wide+immunofluorescence+localization+studies.">A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies.</a> Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).</li><li>Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+for+immunofluorescence+suppresses+localization+of+some+integral+membrane+proteins.">Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).</li><li>Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+liberates+the+membrane+modelling+protein+Pex11beta+from+peroxisomal+membranes.">Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes.</a> Histochemistry &amp; Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).</li><li>Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+antibody+localization+of+alpha2-macroglobulin+in+membrane-limited+vesicles+in+cultured+cells.">Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).</li><li>Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+yeast+cell+wall+composition+and+structure+in+response+to+growth+conditions+and+mode+of+cultivation.">A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation.</a> Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).</li><li>Romaniuk, J. A., Cegelski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+wall+composition+and+the+influence+of+antibiotics+by+cell-wall+and+whole-cell+NMR.">Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).</li><li>Salazar, O., Asenjo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+lysis+of+microbial+cells.">Enzymatic lysis of microbial cells.</a> Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).</li><li>Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+stationary+phase+induced+by+low+oxygen+tension:+cell+wall+thickening+and+localization+of+the+16-kilodalton+alpha-crystallin+homolog.">Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog.</a> Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).</li><li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).</li></ol>

שיתוף הimmunoprecipitation וגישות מבוססות לוקליזציה שימשו כשיטות ארוכות-עמידה לאפיון מרכיב החלבונים. הגילוי של באופן מרובה באמצעות מתחמי מלווה ספציפיים הוא אתגר גדול עם שיטות קונבנציונליות כאלה, וכתוצאה מכך, ממצאים קודמים מוגבלים במידה רבה לפרשנויות איכותיות. שיטות הimmunoprecipitation המבוססות על פירוק...

כמות עצומה של מידע גנומי נשאר שולחן בלתי מתרגם בשל ההבנה השלמה שלנו של interactomes סלולריים. מתודולוגיות לגילוי חלבון בחלבון קונבנציונאלי, כגון חלבון co-immunoprecipitation עם/ללא קישור כימי ושיתוף לוקליזציה של חלבונים, אף שימוש נרחב, מהווים מגוון חסרונות. חלק מהחסרונות העיקריים כוללים קוונפיקציה ירודים של האינטראקציות והמבוא הפוטנציאלי של אירועי איגוד שאינם מקומיים. לעומת זאת, טכניקות מבוססות-קירבה מספקות חלופה וגישה רבת עוצמה ללכידת אינטראקציות חלבונים בתאים. שיטת החיבור (PLA)1, הזמינה כעת כערכה קניינית, מעסיקה נוגדנים למטרות במיוחד של מכלולי חלבונים המבוססים על הסמיכות של יחידות המשנה של האינטראקציה.
PLA הוא יזם על ידי היווצרות של פיגום המורכב של נוגדנים הראשי והמשני עם תגי DNA קטן (משחק משחק) על פני השטח של קומפלקס חלבון ממוקד (איור 1, שלבים 1-3). לאחר מכן, נקבע על ידי הקרבה של תגי ה-DNA, מולקולת DNA מעגלית נוצרת באמצעות הכלאה עם מחבר olig, מחברים (איור 1, שלב 4). היווצרות ה-DNA המעגלי מושלם על ידי צעד לפני הריסוס. פיסת ה-DNA שנוצרה לאחרונה משמשת כתבנית עבור תגובת שרשרת פולימראז (PCR) המבוססת על הגברה מראש של הזרם המבוסס על ידי אחד מתגי הגאות והביות. זה יוצר מולקולה חד-הורית של הקונקטאממית מחוברת למכלול החלבון דרך פיגום הנוגדן (איור 1, שלב 6). מולקולת ה-DNA הconcatic הוא דמיינו באמצעות fluorescently המסומן בתווית olig, הhybridize לרצפים ייחודיים מרובים פזורים ברחבי ה-DNA מוגבר (איור 1, שלב 7)2. אות ה-PLA שנוצר, המופיע כנקודה פלואורסצנטית (איור 1, שלב 7), מתאים למיקום של מתחם החלבון המיועד בתא. כתוצאה מכך, היכולת לזהות מתחמי חלבונים בעלי דיוק מרחבי ברמה גבוהה. הטכניקה אינה מוגבלת פשוט לכידת אינטראקציות חלבונים, אבל יכול להיות גם מנוצל כדי לזהות מולקולות יחיד או שינויי חלבון על חלבונים עם רגישות גבוהה1,2.
Hsp70 טפסים מערכת המלווה מאוד רב-תכליתי חשוב באופן מהותי לשמירה על הומאוסטזיס חלבון הסלולר על ידי השתתפות במערך של משק הבית, הקשורות למתח פונקציות. פעילות משק הבית של מערכת Hsp70 המלווה כוללים קיפול חלבון דה נובו, טרנסלוקציה חלבונים על פני קרומים סלולריים, הרכבה ופירוק של מכלולי חלבון, רגולציה של פעילות החלבון וקישור קיפול חלבון שונים/ בקרת איכות machineries3. מערכת המלווה אותו גם מקפלים מחדש/שפרש החלבונים, מונע צבירת חלבון, מקדם את פירוק חלבונים ומשתף פעולה עם הפרוטסים הסלולר לבזות מוטעית סופני/פגום חלבונים כדי להקל על תיקון הסלולר לאחר מדגיש רעלים רעילים4,5. כדי להשיג את הגיוון הפונקציונלי הזה, המלווה Hsp70 מסתמך על שיתוף המלווים שותפים של משפחת JDP ונוקלאוטיד החליפין גורמים (NEFs) זה בסדר לכוונן את השליטה Hsp70's ATP תלויי התלות של כריכת מצע ושחרור3, . שישה מטרים יתר על כן, המלווה המשותף JDP לשחק תפקיד חיוני בבחירת מצעים עבור מערכת זו המלווה צדדי. בני משפחה זו מחולקת לשלושה כיתות (A, B ו-C) על בסיס הומולוגיה המבנית שלהם לאבטיפוס של JDP, E. coli dnaj. Class A JDPs להכיל N-טרמינל J-תחום, אשר מקיים אינטראקציה עם Hsp70, אזור עשיר גליצין-פנילאללין, אזור איגוד מצע המורכב של אזור כמו אצבע אבץ (ZFLR) ושני תחומים β-חבית, ו-C-טרמינל dimerization התחום. JDPs עם אזור N-טרמינל J-מתחם ומחוז גליצין-פנילאלנין, אבל חסר את הזפלאר, ליפול לכיתה ב'. באופן כללי, חברים בשני הכיתות הללו מעורבים בתפקודים מלווים. חברים נופלים תחת הכיתה הכוללת C, אשר מכיל JDPs כי רק לשתף את ה-J-domain4, לגייס Hsp70s לבצע מגוון של פונקציות שאינן מלווים. התפקיד החשוב של JDPs כמו הכרה מצע להחלפה "מתאמים" של מערכת Hsp70 משתקף על ידי התרחבות של בני המשפחה במהלך האבולוציה. לדוגמה, לבני אדם יש יותר מ-42 חברי JDP ברורים4. הפונקציות האלה jdps כמו monomers, הומודימרס ו/או הומו/הטרו oligomers4,5. לאחרונה, שיתוף פעולה פונקציונלי באמצעות היווצרות מורכבות ארעית בין מחלקה A (למשל, H. DNAJA2; S. cerevisiae ס Ydj1) ו-class B (למשל, H. DNAJB1; S. cerevisiae ס Sis1) איקריוטית jdps דווח כדי לקדם הכרה יעילה של אגרגטים החלבון אמורפיים ב מבחנה7,8. אלה מחלקה מעורבת jdp מתחמי ככל הנראה להרכיב על פני השטח של חלבונים צבורים כדי להקל על היווצרות Hsp70-ו Hsp70 + Hsp100 מבוססי חלבון בחוסר הסוכר7,8,9, 10. הראיות הקריטיות לתמוך הקיום של אלה בעקבות מתחמי מעורבות jdp מחלקה בתאים איקריוטית סופק עם PLA8.
PLA מועסק יותר ויותר להערכת אינטראקציות חלבונים במטתים, בעיקר בתאי יונקים. כאן, אנו מדווחים על התרחבות מוצלחת של טכניקה זו כדי לעקוב אחר מתחמי המלווה שנוצרו באופן מידי בתוך איקריוטית ו-prokaryotic אורגניזמים חד-תאיים כגון מראה שמרים S. cerevisiae ס ו חיידק E. coli. חשוב מכך, התרחבות זו מדגישה את השימוש הפוטנציאלי ב-PLA בזיהוי וניתוח של חיידקים שידביקו תאים אנושיים ובעלי חיים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJA2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJB1 Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-SPA-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DnaK antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mCherry antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sis1 Antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Corp</td>
			<td>COP-080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ydj1 antibody</td>
			<td>StressMarq Biosciences</td>
			<td>&#160;SMC-150,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-YFP antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin slide-staining jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnostic slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>1216530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Detection Reagents Orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P47-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>25300096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase 100T / / Lyticase</td>
			<td>United States Biological</td>
			<td>Z1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells

J-תחום חלבונים (jdps) הטופס הגדול ביותר משפחת שותף מגוון ביותר בתאי איקריוטית. הממצאים האחרונים מראים כי חברים ספציפיים של משפחת JDP יכול ליצור הטרוקומפלקסי ארעי ב eukaryotes כדי לכוונן בחירת המצע עבור 70 kDa חום בהלם חלבון (Hsp70) חלבון מבוסס הסוכר disצוברי. JDP מתחמי מטרה חריפה/כרונית לחץ המושרה חלבונים מצטברים וכנראה לעזור להרכיב את disצוברי ידי גיוס Hsp70s מרובים על פני משטח של אגרגטים חלבון. היקף השליטה באיכות החלבון (PQC) שנוצר על ידי האינטראקציה הפיזית האלה של JDPs שרידים במידה רבה לא מאופיין בvivo. כאן, אנו מתארים מיקרוסקופ מבוסס על באתרו האינטראקציה חלבון בתוך שיטת הקשר הקרבה הקירבה (PLA), אשר מסוגל מכבש ללכוד מתחמי המלווה האלה בנויים בתאים סלולריים ברורים של תאים איקריוטית. העבודה שלנו מרחיבה את התעסוקה של PLA מן התאים האנושיים כדי שמרים (שאיפהcerevisiae ס) וחיידקים (esהמאביקcoli), ובכך עיבוד כלי חשוב כדי לפקח על הדינמיקה של מכלולים בעלי החלבון שנוצרו בשני תאים prokaryotic ו איקריוטית.

הקודם שלנו במחקרים מבחנה באמצעות חלבונים מטוהרים חשף כי תת-קבוצה של המעמד האנושי A ו-class B JDPs טופס ארעי מעורב מתחמי מחלקה JDP כדי למקד ביעילות מגוון רחב של חלבונים צבורים ואולי להקל על ההרכבה של Hsp70 מבוסס חלבון מחוסר-גזים7. אנו המועסקים PLA כדי לקבוע אם מחלקה מעורבת (A + B) מתחמי JDP להתר...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells at JoVE.com

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

Cognate J-דומיין חלבונים לשתף פעולה עם המלווה Hsp70 לסייע במגוון של תהליכים ביולוגיים החל קיפול חלבון להשפלה. כאן, אנו מתארים את הקירבה באתרו בתוך הסמיכות, אשר מאפשר את הניטור של המלווה האלה בmachineries בלתי מלווה בחיידקים, שמרים ובתאי אדם.

במעקב באתרו של הרכבות מולקולרית הוקמה באמצעות מכלולים בחיידקים, שמרים, ותאים אנושיים

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

שיטה זו לוכדת אינטראקציות חלבון חולף באורגניזמים כמו חיידקים ושמרים ובסוגי תאים שונים. כאן אנו מנטרים מתחמי מלווים ספציפיים שנוצרו באופן ארעי ומעורבים בפרוטאוסטאזיס תאי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לייצר מידע על דינמיקה לוקליזציה תת תאית של מכלי חלבון בתאים פרוקריוטיים ואיקריוטיים.התאמות של טכניקה זו באורגניזמים יוניקולריים כמו חיידקים ושמרים, מאפשר לחוקרים להשתמש בו ככלי רב עוצמה לחקור מחלות הקשורות לזיהומים מיקרוביאליים. טכניקה זו יכולה להיות מועסקת באופן פוטנציאלי כדי לנתח אינטראקציות חלבון כמעט בכל האורגניזמים פשוט על ידי שינוי התנאים בשלב הכנת המדגם של הפרוטוקול. חשוב לבחור נוגדנים באיכות טובה שהם ספציפיים ונבדקים באימונוהיסטוכימיה, שפעת חיסונית, ELISA או immunoprecipitations.התחל בטיפול מקדים בשקופיות אבחון של 10 בארות עם פולי-ל-לינזין. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של סטרילי ומסונן 0.0001%poly-L-Lysine לכל באר, והדרוגו את השקופיות במשך 30 דקות במכסה המנוע של זרימה למינארית סטרילית. לאחר מכן, לשטוף כל באר עם 50 microliters של מים סטריליים כדי להסיר עודף פולי-L-לינזין.מוסיפים כ-15,000 תאים ל הבאר בהתאם לסוג התא, ומגדלים את התאים באינקובטור לח סטרילי ב-37 מעלות צלזיוס עם 5%פחמן דו-חמצני ל-60%-80%. לאחר 24 שעות, להסיר את מדיום הצמיחה על ידי הצבת נייר טישו בקצה של כל באר, ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 50 microliters של PBS. לאחר מכן לתקן את התאים על ידי הוספת 50 microliters של טרי מוכן 4% paraformaldehyde ב PBS לכל באר דגירה השקופית בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.לאחר קיבעון, לשטוף את השקופית שלוש פעמים על ידי שקוע את השקופית בצנצנת מכתים שקופיות עם PBS. כדי לחלחל את הממברנות של התאים המחוברים, להטביע את השקופית ב 100 מיליליטר של 0.5% טריטון-X100 ב PBS, ודגירה את התאים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. ואז לשטוף את השקופיות שלוש פעמים ב TBS-T.לאחר הכביסה האחרונה, להסיר חיץ עודף עם נייר טישו. לגדל ולדלל תאים S.cerevisiae על פי הוראות כתב היד, ולאחר מכן להעביר אותם צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר גלולה על ידי צנטריפוגה ב 665 פעמים g במשך שלוש דקות. הסר את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים בחמישה מיליליטר של מדיום טרי.לאחר מכן הוסיפו 550 מיקרוליטרים של 37% פורמלדהיד לריכוז סופי של 4% והדגירה את התרבות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות כדי לתקן את התאים. לאחר הדגירה, גלולה את התאים, להסיר את supernatant, ולתלות את גלולה במיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde מוכן טרי במאגר לשטוף. דגירה התאים בטמפרטורת החדר במשך 45 דקות.בינתיים, הכינו את שקופיות האבחון על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של 0.0001%poly-L-Lysine לכל באר ודגירה של השקופיות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את הפולי-ל-ליזין העודף במים אולטרה-חמים ותנו לשקופיות להתייבש באוויר. לאחר שלב הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ לשטוף על ידי צנטריפוגה.הסר את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים במאגר הכביסה. גלולה את התאים לאחר הכביסה האחרונה, ולהסיר את supernatant ולתלות את התאים במיליליטר אחד של חיץ לשטוף המכיל 1.2 סורביטול טוחן. כדי לעכל את קיר התא, גלולה התאים שוב resuspend התאים ב 250 microliters של פתרון Lyticase מוכן טרי.דגירה התאים ב 30 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות עם רעידות עדינות. לאחר שלב העיכול, לשטוף את התאים שלוש פעמים במאגר לשטוף מחדש את התאים ב 250 microliters של חיץ לשטוף המכיל 1.2 סורביטול טוחן. הוסיפו 20 מיקרוליטרים של תאים תלויים מחדש לכל באר מצופה פולי-ל-לי לסין, ואפשרו לתאים הקבועים והמחלחלים להתחבר במשך 30 דקות.לשטוף את בארות שלוש פעמים עם 50 microliters של חיץ לשטוף כדי להסיר תאים שאינם חסידים, ולהמשיך עם בדיקה רצועות הקרבה. ליזום את מוצג רצועות הקרבה, או פרוטוקול PLA, על ידי הוספת טיפה של מאגר החסימה לכל באר ולהדגיר את השקופית בתא לח במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הסר את חיץ החסימה על ידי הצבת נייר טישו בקצה כל באר, ולשטוף את התאים פעמיים ב 100 מיליליטר של חיץ לשטוף A.Next, להוסיף 40 microliters של פתרון הנוגדנים העיקרי לכל באר, ולהדגיר את השקופית במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתא לח.הסר את פתרון הנוגדנים העיקרי ושטף את השקופיות פעמיים במאגר הכביסה A.לאחר הכביסה, הוסף 40 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים המשני לכל באר והדגירה את המגלשה במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתא לח. לאחר מכן להסיר את הפתרון ולשטוף את השקופיות פעמיים במאגר לשטוף A.Then להוסיף 40 microliters של תערובת רצועות DNA המכיל את המחבר oligonucleotides ו LIGASE DNA, לכל באר, ולהדגיר את השקופית בתא לח ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, להסיר את תערובת הקשירה ולשטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ לשטוף A.Add 40 microliters של תערובת הגברה DNA המכיל את פולימראז DNA ואת oligonucleotides שכותרתו פלואורסצנטי לכל באר, ודגירה במשך 100 דקות בתא לח ב 37 מעלות צלזיוס.הסר את תערובת ההגברה ולשטוף את השקופיות ב 100 מיליליטר של חיץ לשטוף B במשך 10 דקות לכל לשטוף. לאחר מכן לשטוף את המגלשות ב 100 מיליליטר של חיץ לשטוף B מדולל אחד עד 100 במים אולטרה. הוסף 20 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה המכיל DAPI לכל באר.מכסים את בארות השקופית עם תלוש כיסוי וחותמים בלק. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לניטור הרכבות מלווים ארעיות שנוצרו בין חלבונים ייחודיים של J-domain לבין חלבונים מלווים ו- J-domain בתאי HeLa, S.cerevisiae ו- E.coli. חלבונים ברמה אנושית מסוג A ו-B J-domain היו ממוקדים בנוגדנים ראשוניים ספציפיים ביותר.כל אחד מהנקבים הפלואורסצנטיים האדומים מייצג קומפלקס חלבונים שנוצר בין שני חלבונים ייחודיים של J-domain בתאי HeLa. קומפלקסים דומים של חלבון J-domain מסוג מעורב נצפו גם באוקריוטה S.cerevisiae חד-תאי, או בשמרים של אופה. חלק מהנקבים הפלואורסצנטיים שנוצרו מ- PLA היו קשים יותר לפתרון כמוקדים בודדים, בשל גודל התא הקטן.היווצרות מורכבת בין חלבונים מסוג A ו- B J-domain לא נצפו בתאי E.coli, אשר עולה בקנה אחד עם מחקרים ביוכימיים שבוצעו עם חלבונים מטוהרים. אבל הרכבות מלווים אחרות שכללו חלבונים של ג'יי-דומיין והמלווה של Hsp70 נתפסו באמצעות פרוטוקול PLA. בקרות טכניות חסרות נוגדן ראשוני נגד אחד החלבונים או המלווים של J-domain המתקיימים בתגובות PLA שלמות אחרת הראו היווצרות פנצ'יטי פלואורסצנטי מועטה או ללא דו-חושית בתאים, מה שמצביע על היעדר הגברה שגויה של אותות חיוביים.כדי להשיג תוצאות אמינות באמצעות בדיקת רצועות הקרבה, ודא מראש כי הנוגדנים המשמשים הם באיכות מספקת. יתר על כן, לנקוט אמצעי זהירות במניעת עיכול יתר של תאים המכילים קיר התא.

Research

JoVE Journal

Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

לטווח ארוך רעילות מבחן קטלני עם לסרטן הארטמיה franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

תאי גזע יעיל דור מושרה אדם פלוריפוטנטיים מתאים הסומטיים של אדם עם סנדאי וירוס

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

ניתוח Spatiotemporal של אירועים Cytokinetic שמרים ביקוע

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

וזמינותו כתב המבוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית פשוט לזהות את מרכיבי התא הדרושות רעלן ריצין שרשרת (RTA) סחר בבני אדם שמרים

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...