Name: in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells
Uploaded: 2019-09-02T15:00:00
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NBNは、ビクトリア州政府とオーストラリア政府からの資金援助を受けて、モナッシュ大学医学部の特別募集助成金によって支援されています。ベルント・ブカウ(ZMBH、ハイデルベルク大学、ドイツ)とハーム・H・カンピングガ(オランダ・フローニンゲン大学生物医学科)の貴重な支援と試薬の共有に感謝します。イメージング施設、ハイデルベルク大学、ドイツ)は、共焦点顕微鏡と画像処理をサポートし、原稿の批判的な読み取りのためのクレア・ハースト(ARMI、モナッシュ大学、オーストラリア)。

1. HeLa細胞製剤
<ol><li>次の材料を準備する: PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4),pH 7.4;DMEM, 10% FCS と 1% ペンストレップを補充;PBSで4%パラホルムアルデヒド;0.5% PBS でトリトン X100;TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM トリス, 0.05% ツエン), pH 7.4;0.0001% 無菌ポリ-リジン溶液;10ウェル診断スライド。湿気の多い部屋;ティッシュペーパー;そしてコプリンのスライド染色の瓶。 ...

<ol>
	<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li><li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays:+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox.">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li><li>Mayer, M. P., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+structural+and+mechanistic+aspects+of+Hsp70+molecular+chaperones.">Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).</li><li>Kampinga, H. H., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HSP70+chaperone+machinery:+J+proteins+as+drivers+of+functional+specificity.">The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).</li><li>Nillegoda, N. B., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metazoan+Hsp70-based+protein+disaggregases:+emergence+and+mechanisms.">Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Bracher, A., Verghese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+exchange+factors+of+Hsp70+molecular+chaperones.">The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+HSP70+co-chaperone+complex+unlocks+metazoan+protein+disaggregation.">Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation.</a> Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).</li><li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+an+intricate+J-protein+network+driving+protein+disaggregation+in+eukaryotes.">Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Kirstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+properties+of+the+disaggregase+function+of+J-proteins+and+Hsc70+in+Caenorhabditis+elegans+stress+and+aging.">In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging.</a> Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).</li><li>Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Disaggregation+in+multicellular+organisms.">Protein Disaggregation in multicellular organisms.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).</li><li>Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CbpA,+a+DnaJ+homolog,+is+a+DnaK+co-chaperone,+and+its+activity+is+modulated+by+CbpM.">CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).</li><li>Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+J-domain-Triggered+ATP+Hydrolysis+by+Hsp70+Chaperones.">Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones.</a> Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).</li><li>S&#246;derberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li><li>Benschop, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+consensus+of+core+protein+complex+compositions+for+Saccharomyces+cerevisiae.">A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).</li><li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+RNA-protein+interactions+in+situ+using+modified-MTRIPs+and+proximity+ligation.">Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation.</a> Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).</li><li>Mocanu, M. M., V&#225;radi, T., Sz&#246;llosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+and+proximity+ligation+assay+(PLA).">Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA).</a> Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).</li><li>Sekar, R. B., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET)+microscopy+imaging+of+live+cell+protein+localizations.">Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations.</a> Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).</li><li>Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).</li><li>Nagy, P., Sz&#246;llosi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+or+no+proximity:+that+is+the+question+&#8211;+but+the+answer+is+more+complex.">Proximity or no proximity: that is the question &#8211; but the answer is more complex.</a> Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).</li><li>Hoetelmans, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acetone,+methanol,+or+paraformaldehyde+on+cellular+structure,+visualized+by+reflection+contrast+microscopy+and+transmission+and+scanning+electron+microscopy.">Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy.</a> Applied Immunohistochemistry &amp; Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).</li><li>Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+fixation+protocol+for+proteome-wide+immunofluorescence+localization+studies.">A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies.</a> Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).</li><li>Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+for+immunofluorescence+suppresses+localization+of+some+integral+membrane+proteins.">Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).</li><li>Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfixation+detergent+treatment+liberates+the+membrane+modelling+protein+Pex11beta+from+peroxisomal+membranes.">Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes.</a> Histochemistry &amp; Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).</li><li>Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+antibody+localization+of+alpha2-macroglobulin+in+membrane-limited+vesicles+in+cultured+cells.">Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).</li><li>Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+yeast+cell+wall+composition+and+structure+in+response+to+growth+conditions+and+mode+of+cultivation.">A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation.</a> Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).</li><li>Romaniuk, J. A., Cegelski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+wall+composition+and+the+influence+of+antibiotics+by+cell-wall+and+whole-cell+NMR.">Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).</li><li>Salazar, O., Asenjo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+lysis+of+microbial+cells.">Enzymatic lysis of microbial cells.</a> Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).</li><li>Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterial+stationary+phase+induced+by+low+oxygen+tension:+cell+wall+thickening+and+localization+of+the+16-kilodalton+alpha-crystallin+homolog.">Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog.</a> Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).</li><li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).</li></ol>

共免疫沈殿および共局在化ベースのアプローチは、タンパク質集合を特徴付ける長年の方法として使用されてきた。一過性に形成された特定のシャペロン錯体の検出は、このような従来の方法では大きな課題であり、その結果、以前の所見は主に定性的解釈に限定される。細胞リシスベースの共免疫沈殿技術は、多くの場合、タンパク質とタンパク質の相互作用を安定させるために架橋を必?...

膨大な量のゲノム情報は、細胞相互作用の我々の不完全な理解のために解釈できないままである。従来のタンパク質とタンパク質の相互作用検出方法は、化学的架橋およびタンパク質の共局在化を伴うタンパク質共免疫沈殿などの方法論であるが、広く使用されているが、様々な欠点を提起する。主な欠点のいくつかは、相互作用の定量化が不十分であり、非ネイティブ結合イベントの潜在的な導入が含まれます。これに対し、新しい近接ベースの技術は、細胞内のタンパク質相互作用を捕捉するための代替的かつ強力なアプローチを提供します。近接ライゲーションアッセイ(PLA)1は、現在独自のキットとして利用可能であり、相互作用するサブユニットの近接性に基づいてタンパク質複合体を特異的に標的とする抗体を採用している。
PLAは、標的タンパク質複合体の表面に小さなDNAタグ(PLAプローブ)を持つ一次および二次抗体からなる足場の形成によって開始される(図1、ステップ1-3)。次に、DNAタグの近接性によって決定され、コネクタオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを介して円形DNA分子が生成される(図1、ステップ4)。円形DNAの形成は、DNAライゲーション工程によって完了する。新たに形成されたDNAの円形片は、共役オリゴヌクレオチドタグの1つによってプライミングされた後続の転がり円増幅(RCA)ベースのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のテンプレートとして機能する。これにより、抗体足場を介してタンパク質複合体に付着した一本鎖連結DNA分子が生成される(図1、ステップ6)。連結DNA分子は、増幅されたDNAに散在する複数のユニークな配列にハイブリダイズする蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いて可視化される(図1、ステップ7)2)生成されたPLAシグナルは、蛍光ドット(図1、ステップ7)として現れ、細胞内の標的タンパク質複合体の位置に対応する。その結果、アッセイは高い空間精度でタンパク質複合体を検出することができました。この技術は、単にタンパク質相互作用を捕捉するだけではなく、高感度1、2のタンパク質上の単一分子またはタンパク質修飾を検出するためにも利用することができる。
Hsp70は、ハウスキーピングおよびストレス関連機能の配列に参加することにより、細胞タンパク質恒常性を維持するために根本的に重要な非常に汎用性の高いシャペロンシステムを形成する。Hsp70シャペロンシステムのハウスキーピング活動には、デノボタンパク質折りたたみ、細胞膜間のタンパク質転移、タンパク質複合体の組み立ておよび分解、タンパク質活性の調節および異なるタンパク質折りたたみ/リンクが含まれます。品質管理機械3.同じシャペロンシステムはまた、誤った折り畳み/展開されたタンパク質を折りたたみ、タンパク質凝集を防止し、タンパク質の分解を促進し、細胞プロテアーゼと協力して、末端に誤った折り畳み/損傷を受けたタンパク質を分解し、細胞修復を容易にします。プロテオトキシックストレス4,5.この機能的多様性を達成するために、Hsp70シャペロンは、Hsp70のATP依存性アロステリック制御を微調整するJDPファミリーとヌクレオチド交換因子(NEF)のパートナーシップコシャペロンに依存し、基質結合および放出3、 6.さらに、JDPコシャペロンは、この汎用性の高いシャペロンシステムの基板選定において重要な役割を果たします。このファミリーのメンバーは、プロトタイプJDP、大腸菌DnaJに対する構造相同性に基づいて3つのクラス(A、BおよびC)に細分化される。クラスA JGPは、Hsp70と相互作用するN末端Jドメイン、グリシンフェニルアラニン豊富な領域、亜鉛指様領域(ZFLR)と2つのβバレルドメインからなる基質結合領域、およびC末端二量化ドメインを含む。N末端Jドメインおよびグリシンフェニルアラニンが豊富な領域を有するJGPは、ZFLRを欠いているが、クラスBに分類される。一般に、これら 2 つのクラスのメンバは、チャペロン関数に関与しています。Jドメイン4のみを共有するJGPを含むキャッチオールクラスCに該当するメンバーは、Hsp70sを募集して様々な非チャペロン機能を実行します。Hsp70システムの交換可能な基板認識「アダプター」としてのJDPの重要な役割は、進化中の家族の拡大によって反映される。たとえば、人間には 42 を超える異なる JDP メンバー4があります。これらのJDFは、モノマー、ホモダイマーおよび/またはホモ/ヘテロオリゴマー4、5として機能します。近年、クラスA間の一過性複合体形成による機能的協力(例えば、H.サピエンスDNAJA2;S. セレビシエYdj1) とクラス B (例えば, H.サピエンスDNAJB1;S.セレビシエSis1)真核生物JDPは、インビトロ7,8における非晶質タンパク質凝集体の効率的な認識を促進することが報告された。これらの混合クラスJDP複合体は、おそらくHsp70-およびHsp70+Hsp100ベースのタンパク質分解ガス7、8、9の形成を容易にするために凝集タンパク質の表面に集合する10.真核細胞におけるこれらの一過性形成混合クラスJDP複合体の存在を支持する重要な証拠をPLA8で提供した。
PLAは、主に哺乳動物細胞におけるメタゾアにおけるタンパク質相互作用の評価にますます採用されています。ここでは、真核生物および原核生物単細胞生物(発芽酵母S.セレビシエおよび細菌大腸菌)において一過性に形成されたシャペロン複合体をモニタリングするこの技術の拡大に成功したと報告する。重要なことに、この拡張は、ヒトおよび動物細胞に感染する微生物を検出および分析する際のPLAの潜在的な使用を強調している。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJA2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab157216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DNAJB1 Antibody</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ADI-SPA-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-DnaK antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mCherry antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab125096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Sis1 Antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Corp</td>
			<td>COP-080051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ydj1 antibody</td>
			<td>StressMarq Biosciences</td>
			<td>&#160;SMC-150,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-YFP antibody</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin slide-staining jar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnostic slides</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>1216530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Detection Reagents Orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO92002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>62971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>32213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P47-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo-Fischer</td>
			<td>25300096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase 100T / / Lyticase</td>
			<td>United States Biological</td>
			<td>Z1004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ monitoring of transiently formed molecular chaperone assemblies in bacteria, yeast, and human cells

Jドメインタンパク質(JGP)は、真核細胞において最大かつ最も多様なコシャペロンファミリーを形成します。最近の知見は、JDPファミリーの特定のメンバーが真核生物の一過性ヘテロ複合体を形成し、70 kDaヒートショックタンパク質(Hsp70)シャペロンベースのタンパク質分解物の基質選択を微調整できることを示している。JDP複合体は、急性/慢性ストレス誘発凝集タンパク質を標的とし、タンパク質凝集体の表面に複数のHsp70sをリクルートすることにより、逆凝縮物を組み立てるのに役立つ可能性があります。これらの物理的に相互作用するJDPによって形成されるタンパク質品質管理(PQC)ネットワークの程度は、生体内ではほとんど特徴付けられていないままである。ここでは、近接ライゲーションアッセイ(PLA)と名付けられたその中の顕微鏡ベースのタンパク質相互作用アッセイについて説明し、真核細胞の異なる細胞区画においてこれらの一時的に形成されたシャペロン錯体を強く捕捉することができる。我々の研究は、PLAの雇用をヒト細胞から酵母(サッカロマイセス・セレビシエ)および細菌(エシェリヒア・コリ)に拡大し、両方で一過性に形成されたタンパク質アセンブリのダイナミクスを監視する重要なツールを提供する。原核生物および真核細胞。

精製タンパク質を用いたインビトロ研究では、ヒトクラスAとクラスB JDPのサブセットが一時的な混合クラスJDP複合体を形成し、広範囲の凝集タンパク質を効率的に標的化し、Hsp70ベースの組み立てを容易にすることを明らかにした。タンパク質の分解性7.PLAを用いて、ヒト子宮頸癌細胞(HeLa)に混合クラス(A+B)JDP複合体が生じるかどうかを判定した。ヒトJGP DNAJA2(クラスA)および...

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In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

コグネートJドメインタンパク質はHsp70シャペロンと協力して、タンパク質の折りたたみから分解に至るまで、無数の生物学的プロセスを支援します。ここでは、細菌、酵母およびヒト細胞におけるこれらの一時的に形成されたシャペロン機械のモニタリングを可能にする、その場近近性ライゲーションアッセイについて説明する。

細菌、酵母、ヒト細胞における一過性形成分子シャペロンアセンブリのモニタリング

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

この方法は、細菌や酵母などの生物や異なる細胞タイプの一過性タンパク質相互作用を捕捉します。ここでは、細胞プロテオスタシスに関与する一過性に形成された特異的シャペロン複合体を監視します。この技術の主な利点は、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質集合体のダイナミクスおよび細胞下局在化に関する情報を生成する能力である。細菌や酵母のような単細胞生物におけるこの技術の適応は、研究者が微生物感染に関連する疾患を調査するための強力なツールとしてそれを使用することを可能にする。この技術は、プロトコルのサンプル調製段階で条件を変更するだけで、ほぼすべての生物のタンパク質相互作用を分析するために使用される可能性があります。免疫組織化学、免疫蛍光、ELISA、または免疫沈降のいずれかに特異的かつ試験された良質の抗体を選択することが重要です。ポリL-リジンで10ウェル診断スライドを事前に処理することで始めます。100マイクロリットルの無菌を加え、各ウェルに0.0001%ポリL-リジンを濾過し、無菌層流れフードで30分間スライドをインキュベートします。次に、50マイクロリットルの無菌水でそれぞれをよく洗い、余分なポリL-リジンを除去します。細胞の種類に応じてウェルあたり約15,000個の細胞を添加し、5%の二酸化炭素を60〜80%の合流度で摂氏37度で無菌湿気の培養器で細胞を成長させます。24時間後、各ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによって成長培地を取り除き、50マイクロリットルのPBSで細胞を3回洗浄した。次に、PBSに50マイクロリットルの新鮮な4%パラホルムアルデヒドを各ウェルに加え、室温で10分間インキュベートして細胞を固定します。固定後、スライド染色瓶にPBSを入れ、スライドを3回洗います。取り付けられた細胞の膜を透過するには、スライドをPBSで0.5%トリトン-X100の100ミリリットルに沈め、室温で10分間細胞をインキュベートする。その後、TBS-Tで3回スライドを洗浄します。最後の洗浄後、ティッシュペーパーで余分なバッファーを取り除きます。原稿の方向に従ってS.cerevisiae細胞を増殖して希釈し、50ミリリットルの遠心分離管とペレットに移し、665倍gで665倍の遠心分離を行います。上清を取り除き、新鮮な培地の5ミリリットルで細胞を再懸濁します。その後、550マイクロリットルのホルムアルデヒドを加えて4%の最終濃度を得て、室温で培養を15分間インキュベートして細胞を固定します。インキュベーション後、ペレット細胞を、上清を除去し、洗浄バッファーに調製したての4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルでペレットを再懸濁した。室温で細胞を45分間インキュベートする。一方、0.0001%ポリL-リジン溶液の100マイクロリットルを各ウェルに加え、室温で30分間インキュベートすることで、診断スライドを準備します。その後、超純水で余分なポリL-リジンを洗い流し、スライドを空気乾燥させます。インキュベーションステップの後、遠心分離により1ミリリットルの洗浄バッファーで細胞を2回洗浄する。上清を取り除き、洗浄バッファー内の細胞を再び懸濁します。最後の洗浄後に細胞をペレットにし、上清を除去し、1.2モルソルビトールを含む洗浄緩衝液の1ミリリットルで細胞を再懸濁した。細胞壁を消化するために、細胞を再びペレット化し、250マイクロリットルの新たに調製したLyticase溶液中の細胞を再懸濁させた。穏やかな揺れで15分間摂氏30度で細胞をインキュベートします。消化工程後、細胞を洗浄バッファーで3回洗浄し、1.2モルソルビトールを含む洗浄バッファーの250マイクロリットルで細胞を再懸濁する。各ポリL-リジンコーティングウェルに再懸濁細胞の20マイクロリットルを追加し、固定および透過細胞を30分間取り付けます。50マイクロリットルの洗浄バッファーでウェルを3回洗浄し、非接着細胞を除去し、近接ライゲーションアッセイを進めます。近接ライゲーションアッセイ、またはPLAプロトコルを各ウェルにブロッキングバッファーの滴を加えることによって開始し、37°Cで30分間湿度の高いチャンバーにスライドをインキュベートします。各ウェルの端にティッシュペーパーを置いてブロッキングバッファーを取り除き、100ミリリットルの洗浄バッファーAで細胞を2回洗浄し、各ウェルに40マイクロリットルの一次抗体溶液を加え、湿度の高いチャンバーで37°Cで60分間スライドをインキュベートします。一次抗体溶液を取り出し、洗浄バッファーAでスライドを2回洗浄します。その後、溶液を取り出し、洗浄バッファーAでスライドを2回洗浄し、コネクタオリゴヌクレオチドとDNAリガーゼを含むDNAライゲーション混合物を40マイクロリットル加え、各ウェルに加え、37°Cの湿度チャンバーにスライドを30分間インキュベートします。インキュベーション後、ライゲーション混合物を取り除き、洗浄バッファーA.各ウェルにDNAポリメラーゼと蛍光標識オリゴヌクレオチドを含む40マイクロリットルのDNA増幅混合物を加え、加えて37°Cの湿潤チャンバーで100分間インキュベートします。増幅混合物を取り除き、1回の洗浄バッファーBを100ミリリットルで洗浄します。その後、100ミリリットルの洗浄バッファーBでスライドを洗い、超純水で1~100に希釈します。DAPI含有取り付け媒体を井戸ごとに20マイクロリットル追加します。カバースリップでスライドの井戸を覆い、マニキュアで密封します。このプロトコルは、HeLa、S.cerevisiae、および大腸菌細胞の異なるJドメインタンパク質とHsp70シャペロンおよびJドメインタンパク質の間に形成された一過性シャペロン集合体の監視に成功しました。ヒトクラスAおよびクラスBJドメインタンパク質は、非常に特異的な一次抗体を標的とした。赤い蛍光性の各々は、HeLa細胞における2つの異なるJドメインタンパク質の間に形成されたタンパク質複合体を表す。同様の混合クラスのJドメインタンパク質複合体は、単細胞真核生物S.cerevisiae、またはベーカー酵母でも観察される。PLAから発生する蛍光語の一部は、細胞サイズが小さいため、個々の病巣として解決することがより困難であった。クラスAとBJドメインタンパク質の間の複雑な形成は、精製タンパク質で行われた生化学的研究と一致する大腸菌細胞では認められなかった。しかし、Jドメインタンパク質とHsp70シャペロンを含む他のシャペロンアセンブリは、PLAプロトコルを使用して捕獲された。それ以外の完全なPLA反応における相互作用するJドメインタンパク質またはシャペロンのいずれかに対する一次抗体を欠いた技術的制御は、細胞内で蛍光白熱形成をほとんどまたは全く示さなかったことを示し、偽陽性シグナル増幅の欠如を示した。近接ライゲーションアッセイを用いて信頼できる結果を得るには、使用する抗体が十分な品質であることを事前に確認してください。さらに、細胞壁を含む細胞の過剰消化を避けるには、注意を要する。

Research

JoVE Journal

Biology

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

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酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

甲殻類との長期致死毒性試験アルテミアfranciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

定量的RT-PCRによって個々のヒト胚性幹細胞のプロファイリング

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

リビングヒト臍帯静脈内皮細胞における高解像度タイムラプスイメージングと微小管ダイナミクスの自動解析

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

分裂酵母における細胞質分裂のイベントの時空間解析

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain RTA Trafficking in Yeast

リシン毒素チェーン (RTA) 酵母の人身売買に必要な細胞成分を識別するために簡単な蛍光レポーターの試金

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...